Bestimmung der Schnittstelle von EacI

Um die Schnittstelle der Restriktionsendonuklease EacI zu bestimmen, wurde ein einer “primer exten-sion” vergleichbarer Ansatz gewählt. Ein durch Verwendung eines 5’-markierten Primers erhaltenes markiertes PCR-Produkt wurde mit EacI verdaut und anschließend parallel mit einer Sequenzreaktion, die mit dem gleichen markierten Primer durchgeführt wurde, auf einem Sequenzgel analysiert. Durch Fluoreszenzmarkierung des sense- bzw. antisense-Stranges kann man mit dieser Methode ermitteln, wo und mit welchem Überhang das Enzym sein Substrat relativ zu seiner Erkennungssequenz schneidet.

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 91

Abb. 3.20: Bestimmung der EacI-Schnittstelle. A: Darstellung der für die Bestimmung verwendeten PCR-Produkte, die zusammengehörenden Primer sind gleichfarbig dargestellt. B: Bestimmung der Schnittstelle im (1) Oberstrang bzw. (2) Unterstrang, die Signale der geschnittenen markierten PCR-Produkte ist der entsprechenden Base in der mit dem gleichen Primer durchgeführten Sequenzreaktion zugeordnet.

Time [min]

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

CA GC TC A AT TCT c CT TG G A T CA G C C A C T A T C A GC T T G GC T C C A T T C T T G A C T Tim e [min]

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

Time [min]

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

CA GC TC A AT TCT c CT TG G A T CA G C C A C T A T C A GC T T G GC T C C A T T C T T G A C T

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

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3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 92

Die Schnittstellenbestimmung wurde zur Kontrolle parallel mit AlwI durchgeführt, das die gleiche Erkennungssequenz besitzt und dessen Schnittstelle bekannt ist. Es zeigte sich, dass EacI und AlwI echte Isoschizomere sind, d. h. sie erkennen und schneiden die gleiche Sequenz (Abb. 3.20, Abb. 3.21).

↓ 5’-GGATCNNNN NN-3’

3’-CCTAGNNNNN N-5’

↑

Abb. 3.21: Erkennungs- und Schnittstelle von EacI. Die Erkennungsequenz von EacI ist fett gedruckt, die Spalt-stelle ist durch Pfeile angezeigt.

EacI ist damit in die zahlenmäßig noch relativ kleine Gruppe der Typ IIS Endonukleasen einzuordnen, die eine asymmetrische Erkennungssequenz besitzen und meist nicht innerhalb, sondern relativ zu dieser um einige Basen versetzt schneiden. Während Typ II Endonukleasen generell als Homodimer aktiv sind, sind Typ IIS Endonukleasen entweder heterodimer oder monomer aufgebaut. Die monomeren Restrikti-onsendonukleasen weisen dabei meist ca. die doppelte Größe auf, wie eine Untereinheit der dimeren Enzyme. Die Anreicherung von EacI weist darauf hin, dass dieses Enzym zu den monomeren Typ IIS Endonukleasen gehört (s. 3.7.2).

3.7.5 Klonierung und Sequenzierung des Methylase-Restriktase-Modifizierungssystems aus E. acidaminophilum

Bisher wurden erst wenige Typ IIS Endonukleasen eingehend charakterisiert, meist ist die Sequenz der Restriktionsendonukleasen nicht bekannt. Mit Hilfe einer eleganten und relativ einfachen Methode lassen sich Restriktionsendonukleasen klonieren, das homogene Enzym ist nicht notwendig. Die Methode be-ruht darauf, dass die Restriktionsendonuklease im Genom stets direkt benachbart der entsprechenden Methyltransferase lokalisiert ist. Die Klonierung erfolgt über die Aktivität der Methyltransferase, indem eine Plasmid-Genbank des entsprechenden Organismus mit dem Enzym komplett geschnitten wird. Eine Grundvoraussetzung für diese Methode ist daher, dass der für die Genbank verwendete Vektor durch das untersuchte Enzym geschnitten werden kann (der für die Plasmid-Genbank von E. acidaminophilum verwendete Vektor pUC18 weist 10 EacI-Schnittstellen auf). Plasmide, die in ihrem Insert die Methyl-transferase codieren und diese in E. coli exprimieren, sind spezifisch methyliert und gegen die Restrikti-onsendonuklease resistent. Wird dieser Restriktionsansatz in E. coli rücktransformiert, erhält man im Idealfall nur Klone, die die Methyltransferase auf ihrem Insert tragen. Die Restriktionsendonuklease sollte sich dann stromauf- oder -abwärts des Methyltransferasegens befinden.

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 93

Da Plasmide gegen EacI geschützt sind, die aus E. coli-Stämmen isoliert wurden, die über die dam-Methylase verfügen, wurde die pUC18-Genbank von E. acidaminophilum zuerst in den Methyltransfera-se-defizienten E. coli-Stamm SCS110 transformiert. Die nunmehr isolierten Plasmide waren unmethy-liert und wurden einem kompletten Restriktionsverdau mit EacI unterzogen und in E. coli XL1 Blue MRF’ rücktransformiert. 10 Klone wurden ausgewählt, die Plasmid-DNA isoliert und in SCS110 trans-formiert. Die aus den rekombinanten SCS110-Klonen isolierte unmethylierte Plasmid-DNA wurde abermals mit EacI verdaut, zwei der untersuchten Plasmide erwiesen sich erneut als resistent gegenüber EacI und wurden mit Hilfe des „Genome Priming Systems“ GPS™-1 sequenziert.

Das 2,7 kb-große Insert des Plasmides pEacI-1 enthielt erwartungsgemäß ein Gen, das Homologien zu Adenin-N⁶-methyltransferasen aufwies. Direkt stromabwärts des mit meacI bezeichneten Gens befand sich ein weiterer offener Leserahmen, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz mit dem N-Terminus des gereinigten EacI grob übereinstimmte. Anstelle des in der N-terminalen Sequenzierung an Position 4 gefundenen Tyrosins findet sich in der aus der Gensequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz ein Trypto-phan. Die Aminosäure an Position 5, die zuvor nicht identifiziert werden konnte, erwies sich als Tyrosin.

Auf pEacI-1 waren von EacI nur die ersten 83 Aminosäuren codiert, auch das mit einer von pEacI-1 abgeleiteten Sonde aus der λ-ZAP II-Phagenbank isolierte Plasmid pEacI-Ph5-1 vervollständigte reacI nicht komplett. Die Hydridisierung eines Southern Blots zeigte, dass die nächste HindIII-Schnittstelle ca.

800 bp stromabwärts lokalisiert war. HindIII-Fragmente von E. acidaminophilum wurden in pBluescript SK+ ligiert und dienten als Template für eine PCR mit dem Primer EacI-5 und universellen Primern. Das ca. 900 bp lange PCR-Produkt wurde direkt sequenziert und vervollständigte das reacI-Gen. Die kom-plette Sequenz ist in Abb. I.3 im Anhang zusammen mit den abgeleiteten Proteinsequenzen dargestellt.

Abb. 3.22: Schematische Darstellung der eac-Genregion aus E. acidaminophilum.

Durch Röntgenstrukturanalysen der beiden Restriktionsendonukleasen REcoRI und REcoRV wurden vier Aminosäuren identifiziert, die am aktiven Zentrum der Enzyme beteiligt sind und dem Motiv PDX19(D/E)XK entsprechen, die in Position 90 bzw. 73 beginnen. Durch Mutationsstudien wurde festge-stellt, dass die positiven bzw. negativen Ladungen an den entsprechenden Positionen essentiell sind (ANDERSON 1993). Dieses Motiv wurde auch in anderen jedoch nicht in allen Sequenzen von Restrikti-onsendonukleasen gefunden, wobei der Abstand zwischen den beiden Teilmotiven variierte. In der

ab-reacI

2000 4000

0 5113

orf11 ^orf10

meacI

EcoRI HindIII

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geleiteten Aminosäuresequenz von REacI wurde ein ähnliches Sequenzmotiv (78-PEX6DXR-87) identi-fiziert, das möglicherweise dem aktiven Zentrum von REacI entspricht.

Das Insert des zweiten Plasmids, das wie pEacI-1 vor EacI-Verdau geschützt war, war 1552 bp groß und codierte für kein Protein mit Homologien zu Methyltransferasen. Stattdessen wurde auf diesem Plasmid ein Gen identifiziert, dessen Genprodukt hohe Homologien zu Ferredoxinen des Clostridien-Typs (STICHT UND ROSCH 1998) aufweist. Diese Ferredoxine besitzen zwei [4Fe-4S]-Zentren, die von zwei konservierten Cystein-Motiven (CxxCxxCxxxC) gebildet werden. Interessanterweise folgen in der Se-quenz des Ferredoxins von E. acidaminophilum dem 4. Cystein beider Motive im Abstand von drei Ami-nosäuren ein weiteres Cystein, das bei allen anderen bekannten Ferredoxinen nicht konserviert ist. In der elektronenübertragenden Untereinheit HndC (HymB-Homolog) der zweiten Eisen-Hydrogenase von E.

acidaminophilum (KEIL 1999) befindet sich bei einem [4Fe-4S]-Zentrum wie in dem Ferredoxin im glei-chen Abstand ein 5. Cystein. Die Sequenz des pFD-1 genannten Plasmids ist in Abb. I.4 in Anhang I dargestellt.