Messungen mit dem Alternate Gradient Magne- Magne-tometer

W¨ahrend die Messungen mit mikrostrukturierten Hallkreuzen auf einzelne Ma-gnetosomenketten abzielt, erm¨oglicht die Messung mit dem Wechselgradienten-Magnetometer (Alternate Gradient Wechselgradienten-Magnetometer, AGM) die Ermittlung von magnetischen Eigenschaften einer großen Anzahl von Bakterien. Hier sind zun¨achst die individuellen Eigenschaften einzelner Ketten ohne entscheiden-de Beentscheiden-deutung. Dennoch sind wichtige magnetische Eigenschaften bestimmbar.

Durch dieses Verfahren erfolgt eine Mittelung aller Bakterien auf der Probe und erlaubt R¨uckschl¨usse auf die magnetischen Eigenschaften einer großen Anzahl, also zum magnetischen Verhalten der Kultur als Ganzes. Der Aufbau und die Funktionsweise eines Wechselgradientenmagnetometers ist in [95] und [123] ge-nauer beschrieben, hier wird nur kurz auf das Prinzip eingegangen. Verwendung fand das am Lehrstuhl Brack vorhandene AGM. Das Wechselgradientenmagne-tometer besteht aus einem Elektromagneten, der zur Magnetisierung der Probe, das Anlegen eines homogenen, magnetischen Feldes im Bereich von −20 und +20 kOe gestattet. W¨ahrend der Messung wird diesem homogenen Feld ein Gra-dientenfeld geringerer St¨arke ¨uberlagert. Erzeugt wird das GraGra-dientenfeld durch ein Paar von Helmholtzspulen. Durch das inhomogene Feld wird die, an einer Glaskapillare befestigte Probe ausgelenkt, aber nur wenn sie ein magnetisches Moment besitzt. Die Probe bildet zusammen mit der Glaskapillare und einem Piezoelement, an dem die Kapillare befestigt wird, ein schwingungsf¨ahiges Sys-tem. Vor der eigentlichen Messung wird die Frequenz des Wechselstromes, mit dem die Gradientenspulen betrieben werden, an die Eigenfrequenz dieses Sy-stems angepaßt. Das bewirkt, dass die Amplitude des Meßsignals maximal wird.

Uber einen Lock-In-Verst¨arker wird die im Piezoelement entstehende Span-¨ nung aufgenommen und in einem Rechner weiterverarbeitet. Zur Pr¨aparation f¨ur Messungen am AGM war es notwendig, Zellen auf einen Tr¨ager abzuschei-den, der dann an der Glaskapillare befestigt werden konnte. Als Tr¨ager wurde jeweils eine GaAs-Substrat Probe mit Abmessungen von 3 mal 3 mm ohne He-terostruktur verwendet. Zellen aus einer Kultur mit normaler Zelldichte wurden bei 13.000 U/min zentrifugiert und in speziellem Puffer gewaschen, um die Ver-unreinigungen durch organische Reste im Medium zu minimieren. Jeweils 5µl aus einer angereicherten und gewaschenen Bakteriensuspension (intakte Bak-terien) wurden mit einerµl-Pipette auf GaAs-Substrate ¨ubertragen. Die erhal-tenen Ans¨atze wurden an Luft getrocknet. Die Probe wurde anschließend mit Reinstwasser gewaschen, so dass nur noch Bakterien, die auf der Oberfl¨ache

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -1,2

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

Lysierte Probe

M/Ms

H in kOe

Abbildung 7.1: Hysterese einer auf GaAs abgeschiedenen und zuf¨allig verteil-ten Ansammlung von Magnetosomenketverteil-ten bestimmt mit dem Wechselgradien-tenmagnetometer (AGM). Die Bakterien wurden in diesem Fall auf der Probe lysiert. Die Koerzitivfeldst¨arke betr¨agt hier 130 Oe. Die Originalmessung (grau) wurde gegl¨attet (schwarze Kurve).

fixiert waren, auf dieser verblieben. Der Waschschritt entfernt einen großen Teil der urspr¨unglich abgeschiedenen Bakterien. Durch mehrfaches Schwenken der Probe in Reinstwasser, verbunden mit einem kurzen Ultraschall-Dip (weniger als 30 Sekunden), kann die Zahl der auf dem Substrat abgeschiedenen Bakterien nochmals stufenweise reduziert werden. Zus¨atzlich zu einer Probe mit intakten abgeschiedenen Bakterien, wurde auch eine mit Lysozym behandelte und gerei-nigte Magnetosomfraktion vorbereitet. Damit sollte untersucht werden, welchen Einfluss der Zustand der Magnetosomenfraktion¹hat. Dazu wurden jeweils 5µl auf gereinigte GaAs-Substrate mit einer Mikroliterpipette abgeschieden. Die

1Hier wird einmal der Zustand in vivo, also bei intakten Bakterien oder in Form von lysierten Bakterien mit einzelnen Magnetosomenketten weitgehend ohne Zellreste verstanden.

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 -1,2

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

Intakte Bakterien

0°

90 °

M/Ms

H in kOe

Abbildung 7.2: Hysteresekurve einer auf GaAs abgeschiedenen Suspension von intakten Bakterien, bestimmt mit einem Wechselgradienten-Magnetometer.

Die Koerzitivfeldst¨arke betr¨agt hier ca. 250 Oe. Die Remanenz um die0,50±2 deutet auf eine zuf¨allige Verteilung der magnetischen Momente hin. In den In-sets sind die jeweiligen Winkellagen des magnetischen Feldes (dicker schwarzer Pfeil) zu den zuf¨alligen Anordnungen der Ketten (ohne Bakterienh¨ulle darge-stellt) veranschaulicht.

Proben mit abgeschiedenen Bakterien wurden zus¨atzlich in Reinstwasser ge-waschen, was weitere Verunreinigungen auf der Probe auf ein Minimium re-duzierte. Zum Vergleich wurde außerdem auch eine nicht gewaschene Probe verwendet. Die Messungen mit dem Wechselgradienten-Magnetometer hatten damit drei unterschiedliche Probenans¨atze als Grundlage: ein GaAs-Tr¨ager mit intakten Bakterien, intakte auf dem Tr¨agersubstrat gewaschene Bakterien und schließlich lysierte magnetische Bakterien, wo die Ketten außerhalb der Zelle vorlagen². F¨ur alle drei Ans¨atze wurden vorgereinigte GaAs-Proben als Sub-strat verwendet. Bei der Messung erscheint auch der diamagnetische Anteil des

2Alle verwendeten Bakterien waren vom StammMagnetospirillum magnetotacticum.

GaAs in der Hysteresekurve. Dieser wird durch nachtr¨agliche Subtraktion von der Messkurve eliminiert. Teilweise ergaben die Messungen kein ausreichend starkes Signal, was auf zu geringe Zell- bzw. Magnetosomendichten auf den Proben zur¨uckzuf¨uhren war. Um mehr Bakterien auf den Proben zu belassen, wurde vom Waschschritt abgesehen, so dass sich effektiv 5µl Bakteriensuspen-sion auf dem GaAs-Substrat befand. Die Zelldichten der Kulturen, die lysiert wurden, waren ¨ahnlich hoch wie die der intakten Zellen. Die dabei erhaltenen Hysteresekurven sind in den Abbildungen 7.1 und 7.2 aufgef¨uhrt. Aufgetragen sind jeweils die normierte Magnetisierung _M^M

S der Probe gegen das angelegte Feld H.

Die Signalst¨arke betrug 5µV. Die Koerzitivfeldst¨arke der lysierten Probe be-tr¨agt ca. HC = 130 Oe bei einer Remanenz³ von 0,52±2 . In der Abbildung 7.2 sind zwei Hysteresen von intakten Bakterien gegen¨ubergestellt, die um 90^◦ gedreht zueinander vermessen wurden. Die Koerzitivfeldst¨arken beider Kurven sind identisch (ca. 250 Oe), die Remanenz der um 90^◦gedrehten Probe betr¨agt ca. 0,47±2 (0,52±2 bei 0^◦). Eine Remanenz von um die 50 % (0,50) ist ein Hinweis auf eine zuf¨allige Verteilung der magnetischen Momente. Sowohl intak-te, als auch lysierte Proben weisen eine Remanenz um 0,50 auf. Der Unterschied liegt in einer deutlich kleineren Koerzitivfeldst¨arke bei der lysierten Probe. Au-ßerdem weist diese eine kleinere Signalst¨arke (um Faktor 5) und zudem ein schlechteres Signal-Rauschverh¨altnis als die Probe mit intakten Bakterien auf.

Dies l¨asst sich nur damit erkl¨aren, dass die Dichte an magnetischen Ketten im Falle der lysierten Bakterien deutlich geringer war.

Bei h¨oheren Feldern spielen insbesondere Ummagnetisierungsprozesse innerhalb der Kette eine Rolle. Die Hysterese wird aber durch das Kollektiv der Bakteri-ensuspension auf der Probe bestimmt. Da die Bakterien durch den Trockungs-prozess in einer organischen Matrix oder auf dem GaAs- Substrat fixiert sind, ist eine aktive Ausrichtung der Bakterien praktisch ausgeschlossen.

Aussagen zum mikromagnetischen Verhalten der einzelnen Magnetosomenket-ten zu treffen, ist mit dieser Methode schwer. Ein zur Beschreibung gut geeig-neter theoretischer Ansatz ist das im Kapitel 5 bzw. 5.2 beschriebene Kugel-kettenmodell. Wie dort genauer gezeigt, erh¨alt man durch Minimierung der Ge-samtenergie und unter Ber¨ucksichtigung der Kristall-Anisotropie, die M¨oglich-keit eine Aussage zum Hystereseverhalten zu treffen. Durch Aufaddierung einer Vielzahl von zuf¨allig orientierten magnetischen Ketten, erh¨alt man Hysterese-kurven, die als Vergleich zu den Messungen in diesem Teilkapitel herangezogen

3Die angegebenen Remanenzen sind jeweils bezogen auf die normierte S¨attigungsmagneti-sierung zu 1.

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 -1,2

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

Vergleich AGM-Messung /

Kugelkettenmodell

Messung AGM

Rotation n =

Fanning n = 2

Fanning n = 5

M/Ms

H in kOe

Abbildung 7.3: Vergleich AGM-Messung mit Theorie (Kugelkettenmodell):

Die grau gestrichelten Kurven stammen aus theoretischen Berechnungen zum Kugelkettenmodell aus [58]. Die durchgezogene, rote Linie stellt die Messung dar. Die beste ¨Ubereinstimmung mit der Theorie ergibt sich f¨ur den Mechanis-mus des Fanning (n=2), aber bei deutlich unterschiedlichen Koerzitivfeldern.

werden k¨onnen⁴. Die magnetische Fraktion und somit die Dichte der abgeschie-denen Magnetosomenenketten war auf der lysierten Probe deutlich geringer.

Auch hier finden sich aber deutliche Hinweise auf die statistische Verteilung der magnetischen Momente. Die Remanenz betr¨agt um die 0,5. Trotz nahe-zu gleichen Ausgangskonzentrationen an magnetischen Partikeln in den beiden Ans¨atzen hat die Waschprozedur deren Zahl insbesondere bei der Probe mit lysierten Bakterien verringert.

In der Abbildung 7.3 sind die theoretischen Kurven aus dem

Kugelkettenmo-4Die berechneten Werte der Hysteresekurven sind bei Kuo [58], unter anderem f¨ur Magnetit und f¨ur verschiedene Kettenl¨angen in Tabellen aufgef¨uhrt. Die beiden Ummagnetisierungsmo-den, Fanning und parallele Rotation, finden dabei ebenfalls Ber¨ucksichtigung.

dell [58] mit der Hysterese, bestimmt aus der AGM-Messung, zum Vergleich in ein Diagramm eingetragen. Die generelle Form, sowohl der Theoretischen, als auch der Messkurve spiegeln die zuf¨allige Verteilung der magnetischen Momen-te wieder. Die Form der HysMomen-terese ist ein Hinweis auf zuf¨allig verMomen-teilMomen-te Single Domain Partikel mit einer uniaxialen Anisotropie.

Insbesondere die theoretischen Hysteresen des Fanning-Mechanismus beschrei-ben die Messkurve bei gr¨oßeren Felder (H) am besten. Die Koerzitivfeldst¨arken f¨ur die angegebenen Aspektverh¨altnisse (Kettenl¨angen) von n=2 und n=5 im Falle des Fanning-Modus stimmen aber nicht mit der Messkurve ¨uberein. Die gemessene Koerzitivfeldst¨arke w¨urde auf ein Aspektverh¨altnis von n=3 hindeu-ten.

In [30] werden Hysteresen, gemessen bei Raumtemperatur, einer Probe ma-gnetischer Bakterien (Bulk) vom Stamm MV-1 vorgestellt. Die dort angege-benen Werte f¨ur die Koerzitivfeldst¨arke bewegen sich zwischen 20 und 50 mT (200 bis 500 Oe). Die Koerzitvifeldst¨arken von 0,2 bis 0,3 kOe sind gr¨oßer als der erwartete theoretische Wert von ∼ 0,11 kOe f¨ur zuf¨allig orientiertes Single Domain Magnetit mit einer Orientierung der leichten Achse entlang der [111]-Richtung. Hier ist ein zus¨atzlicher Einfluss durch die Formanisotropie und die Kettenanordnung der Single Domain Partikel (Magnetosome) entlang der leichten [111]-Achse erkennbar. Daraus l¨asst sich schließen, dass die intrinsische magnetokristalline Formanisotropie wohl nicht die einzige bestimmende Quelle f¨ur das Koerzitivfeld sein kann [30].

Generell sind die beobachteten Koerzitivfeldst¨arken deutlich gr¨oßer als das Erd-magnetfeld (∼ 0,05 mT). Damit sind die Magnetosomenketten in ihrem ma-gnetischen Verhalten unabh¨angig von den ¨Anderungen und den beobachteten Polarit¨atswechseln des Erdmagnetfeldes in der geologischen Vergangenheit der Erde [30].

7.2 Rastersondenverfahren

Die Verfahren zum Abscheiden von Bakterien auf mikrostrukturierten Halblei-terproben, erm¨oglichen die gezielte Untersuchung einzelner Organismen. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten und vorgestellten Methoden zum gezielten Abscheiden von Bakterien auf Halbleitern, machen es m¨oglich, das gleiche Bak-terium, gekennzeichnet und wiederauffindbar durch strukturierte Marken, mit verschiedenen physikalischen Verfahren zu untersuchen. Neben der Elektronen-mikroskopie (siehe beispielsweise Abbildung 2.14 bzw. Kapitel 3 oder 4) bieten sich auch Rastersondenverfahren an. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit

Hil-Abbildung 7.4: Schematische Darstellung zweier Beispiele von vorstruktu-rierten Proben, die zum gezielten Abscheiden und Wiederfinden von einzelnen abgeschiedenen Bakterien verwendet wurden. Die hier gezeigten Strukturen sind auf den jeweiligen Masken jeweils in horizontaler, als auch in vertikaler Rich-tung periodisch wiederholt. Typische Scanfeldgr¨oßen von 10µm sind in Form eines schwarzen quadratischen Feldes eingezeichnet.

fe der am Lehrstuhl vorhandenen Rastersondenverfahren (AFM:Atomic Force Mikroscopyund MFM:Magnetic Force Microscopy) auch Magnetische Bakteri-en untersucht. Dabei wurde auf komplexe Pr¨aparations- und AnalyseverfahrBakteri-en derbiologischenAFM-Methodik verzichtet, bei der biologische Proben in einem

Elektrolyten in vivo untersucht werden k¨onnen. Interessant waren in dieser Ar-beit insbesondere die magnetischen Eigenschaften der Ketten. Diese konnten auch bei immobilisierten Bakterien, die sich nicht im Medium befanden, un-tersucht werden. Bei den ersten Versuchen stellte sich heraus, dass grunds¨atz-lich das Finden von Bakterien auf unstrukturierten Oberfl¨achen mit Hilfe des kleinen Scanauschnittes des AFMs (ca. 10µm), in Verbindung mit den verh¨alt-nism¨aßig langen Bildaufnahmezeiten, eine besondere Schwierigkeit darstellte.

Mit strukturierten Proben als Grundlage und den in Kapitel 4 beschriebenen Abscheidetechniken, war es m¨oglich, einzelne Bakterien abzuscheiden, Magne-tosomen zu identifizieren und damit wiederholt und gezielt wieder anzufahren und zu untersuchen.

In Abbildung 7.4 ist ein Beispiel f¨ur eine verwendete Variante einer

Vorstruk-Abbildung 7.5: Rasterkraftmikroskopisches Bild eines Bakteriums auf einer Halbleiteroberfl¨ache, links in Schr¨agansicht, rechts in Draufsicht (mit Angaben zur H¨ohe) dargestellt. Die Gr¨oße des Scanfeldes betrug 6,5µm×6,5µm. Man erkennt die bipolare Begeiselung des Bakteriums vom Stamm Magnetospirillum magnetotacticum. Die wellige Form der Oberfl¨ache des Bakteriums im linken Bild ist als Messartefakt auf die fl¨ussige Konsistenz des Bakterieninneren zur¨uck zu f¨uhren. Bild aufgenommen durch R. Pulwey.

turierung der Probe gezeigt. Auf dem Halbleitersubstrat (ohne 2DEG) wurde mit Hilfe von fotolithografischen Methoden, Strukturen auf die Probe gebracht.

Im Fall a) in Abbildung 7.4 stellt die effektiv nutzbare, da durch Justiermarken umschlossene Fl¨ache eine Mesastruktur dar, d.h. die Fl¨ache ist erhaben zum Rest der Probe. Die Gr¨oße betr¨agt hier 180µm. Im Fall b) in Abbildung 7.4 wird die effektiv nutzbare Fl¨ache durch die inneren Justiermarken, im Abstand von 60µm, definiert. Besonders die Struktur in b) eignet sich f¨ur die

Rasterson-denverfahren, wegen der kleineren Strukturgr¨oßen und ihrer Planheit. In beiden Strukturen ist zur Veranschaulichung der Gr¨oßenverh¨altnisse ein 10µm großes, quadratisches schwarzes Feld (Abscheide- oder Scanfeldgr¨oße) eingezeichnet.

In Abbildung 7.5 ist ein AFM-Bild eines Bakteriums vom Stamm Magneto-spirillum magnetotacticum, auf GaAs abgeschieden, in Schr¨ag- und Draufsicht gezeigt. Die Gr¨oße des Scanfeldes betrug hier 6,5µm bei einer Scan-Rate von 0,9084 Hz (Samples 256 / Data scale 219,4 nm). Mit dieser rein topografischen Information aus dem AFM-Bild kann man die bipolare Begeiselung des Bakte-riums erkennen. Weitere Details, insbesondere aus dem Zellinneren sind aus den topografischen Informationen normalerweise nicht erkennbar. Ist das Bakterium praktisch komplett dehydriert, k¨onnen auch die Magnetosomen aufgel¨ost wer-den. Die hier nicht in Bildern aufgef¨uhrten MFM-Messungen deuteten auf eine senkrecht zur Oberfl¨ache orientierte Magnetisierung der Magnetosomen hin.

Dies entspricht also nicht wie durch die nat¨urliche Orientierung vermutet, einer Ausrichtung der Magnetisierung entlang der Kettenachse. Dies konnte durch die Messungen mit der Methode der Mikro-Hallmagnetometrie verifiziert werden.

Einzelne Magnetosomen konnten mit dem MFM nicht aufgel¨ost werden, aber die Kontrastverh¨altnisse deuteten auf ein vergleichsweise starkes magnetisches Signal hin.