Messung von Reflexionsspektren

Meßbereich

Die Bestimmung der Fl¨ugelfarben erfolgte durch Messung der spektralen Reflexion R(λ) unabh¨angig vom menschlichen Sehen mit einem Spektroradiometer. Die Messungen deck-ten den UV- und den sichtbaren Bereich (300 nm bis 680 nm) ab. Dies ist der Bereich, in dem aus der Kombination von nat¨urlich vorhandenem Licht (Untergrenze ca. 300 nm;

siehe auch Abb. 2.4, Seite 36) (Henderson & Hodgkiss 1963, Henderson 1970, CIE 1971) und der spektralen Empfindlichkeit der Photorezeptoren von Schmetterlingen (Obergrenze bei ca. 700 nm) Sehen bei Schmetterlingen grunds¨atzlich m¨oglich ist (z. B. Bernard 1979, Menzel 1979, Eguchi et al. 1982, Matic 1983, Arikawa et al. 1987, Steiner et al. 1987, Bernard & Remington 1991, Shimohigashi & Tominaga 1991, Kinoshita et al. 1997).

Polarisation

Eine weitere Eigenschaft des Lichts, seine Polarisation, d. h. die Schwingungsebene des E-Vektors, beeinflußt das Sehen vieler Vertebraten, aber vor allem Evertebraten und wird oft als eigene Sinnesqualit¨at wahrgenommen (Nilsson & Warrant 1999). Bei Schmetterlingen wurde bisher nur f¨urPapilio ein Einfluß der Polarisation des Lichts auf das Sehen nachge-wiesen.Papilioist zu echtem Farbensehen (nach der Definition von Menzel 1979) bef¨ahigt (Kelber & Pfaff 1999), wobei die Polarisation von Licht mit dem Farbsehsystem interferiert und dadurch

”Falschfarben“ erzeugt (Kelber 1999). Es ist eher unwahrscheinlich – aber bisher nicht untersucht –, daß bei Lycaeniden ¨ahnliche morphologische Verh¨altnisse wie bei den Photorezeptoren von Papilio vorliegen und damit ein entsprechender Einfluß der Polarisation von Licht auf die Wahrnehmung von Farben gegeben ist. Nachdem die hier betrachteten Fl¨ugel vonP. icarus aber kaum Glanz aufweisen, sondern diffus reflektieren, reflektieren sie wohl nicht-polarisiertes Licht bzw. depolarisieren reflektiertes, polarisiertes Himmelslicht. Die Polarisation wird daher im folgenden nicht weiter betrachtet.

Geometrie

Der geometrische Aufbau bei der Messung der spektralen Reflexion muß m¨oglichst nahe die Umst¨ande nachempfinden, unter denen das Objekt unter nat¨urlichen Bedingungen gesehen wird, da diese das Erscheinungsbild beeinflussen (Endler 1990). Besonders wichtig ist die Wahl der richtigen Beleuchtungsgeometrie bei der Vermessung von Strukturfarben oder von Oberfl¨achen mit einer ausgepr¨agten Struktur, wie sie etwa schuppenbedeckte Schmetterlingsfl¨ugel darstellen, da sie maßgeblich das Meßergebnis bestimmen kann (z. B.

Vukusic et al. 1999, Gupta et al. 1989, Vukusic et al. 2001b). Die Beleuchtung kann diffus oder direkt sein. Diffuse Beleuchtung herrscht in aquatischen Systemen vor und kann in terrestrischen Systemen in Waldhabitaten, innerhalb dichter Vegetation sowie in offenen Habitaten unter Bew¨olkung vorherrschen. In offenen terrestrischen Habitaten ist aber meist das direkte Sonnenlicht maßgeblich f¨ur die Beleuchtung von Objekten und dominiert aufgrund seiner hohen Intensit¨at immer, wenn es einen Fleck direkt beleuchtet (Endler 1993, z. T. eigene Messungen). Die gew¨ahlte direkte Beleuchtung (Lichtb¨undel mit kleiner numerischer Apertur N.A.) bei der Spektroradiometrie kommt damit den nat¨urlichen Verh¨altnissen nahe. Die Imagines von Polyommatus icarus sind bevorzugt bei warmem, sonnigem Wetter im direkten Sonnenlicht offener Habitate aktiv (Ebert &

Rennwald 1993, Tillmanns 1995, J¨aremo Jonson et al. 1998, Tolman & Lewington 1998).

Die Bindung an hohe Lichtintensit¨aten spiegelt sich auch in Aspekten der Sehphysiologie wider. Die Pupillenreaktion der Augen von Polyommatus icarus ist an die sehr hohen Lichtintensit¨aten bei diesen Bedingungen angepaßt (J¨aremo Jonson et al. 1998).

Bei den Messungen wurde nur das direkte, vom Fl¨ugel in einen kleinen Raumwinkel reflektierte Licht erfaßt. Dies entspricht weitgehend den nat¨urlichen Verh¨altnissen, unter denen visuelle Signale gesehen werden. Auch Ommatidien sehen, abh¨angig von Facet-tendurchmesser und Abstand zum Objekt, nur einen sehr kleinen Winkelbereich des von einem Objekt reflektierten Lichts (Land 1997).

Versuchsaufbau

Die Fl¨ugel wurden vom distalen Fl¨ugelende her unter einem Winkel von 45^◦ zur Fl¨ uge-lebene beleuchtet (Abb. 2.3). Um eine einheitliche und reproduzierbare Geometrie der Beleuchtung zu erhalten, wurden die Fl¨ugel f¨ur die Messungen so angeordnet, daß der beleuchtende Lichtstrahl bei Projektion in die Fl¨ugelebene parallel zu dem mehr oder weniger geraden Hinterrand der Fl¨ugel verlief. Das beleuchtende Lichtb¨undel war auf die Sch¨arfeebene der Beobachtungs- und Meßoptik fokussiert (N.A =0,07–0,09). Die Fl¨ugel wurden dann f¨ur die Messung in diese Ebene gebracht. Als Lichtquelle diente eine Xenon-Hochdruck-Kurzbogenlampe (Osram XBO 75W/2 OFR) in einem Lampenhaus (Oriel 60000 mit Oriel 60005 Reflektor) mit Quarz-Kondensor (F/1,5; Oriel 68806) und stabili-sierter Stromquelle (Oriel 68806). Dieser Lampentyp liefert ein intensives Licht mit einem kontinuierlichen Spektrum im ben¨otigten Wellenl¨angenbereich und ist auch aus einer Rei-he techniscRei-her Gr¨unde am besten f¨ur diesen Typ von Messungen geeignet (Spikes 1983, Endler 1990, Anonymus 1996c, 1999c). Das Licht wurde in einen Lichtleiter (Fl¨ ussig-keitslichtleiter Oriel 77554; optischer Durchmesser 3,0 mm; L¨ange 1 m; bzw. Quarzlicht-leiter Oriel 77600UVS mit 600 µm Dickkernfaser; L¨ange 2 m; Oriel 77800 Faseroptik-Einkopplung mit Quarzlinse F/2,0) eingekoppelt und anschließend mit einer Optik (Oriel 77646 mit Quarzlinse Oriel 3-41250; f = 75 mm) in die Sch¨arfeebene der Meßoptik fo-kussiert. Vor dem Lichtleiter befand sich nach Bedarf ein Wasserfilter (Oriel 61945) zur

Lampe Sichtoptik

und Sensor

Beleuchtungsstrahl Meßstrahl

Schmetterlingsflügel

distal proximal

Abb. 2.3: Schemazeichnung des Versuchsaufbaus zur Messung der spektralen Reflexion von Schmetterlingsfl¨ugeln. Der Fl¨ugel wurde von einem Lichtstrahl unter einem Winkel von 45^◦ zum Meßstrahl beleuchtet. Mit der Sicht- und Meßoptik wurde der Fl¨ugel betrachtet. Nur von der Meßstelle direkt in diese Optik reflektiertes Licht wurde gemessen. Im allgemeinen wurde aus ei-ner Richtung senkrecht zum Fl¨ugel gemessen. F¨ur Messungen (der blauen Strukturfarben) aus anderen Winkeln wurde der Fl¨ugel um eine durch den Meßfleck verlaufende Achse geschwenkt, die senkrecht zur Zeichenebene stand.

Reduzierung der W¨armestrahlung.

Die Beobachtung der Meßstellen und die Messung der Reflexionsspektren erfolgten senkrecht zur Fl¨ugelebene (N.A. =0,14–0,15). Im Objekt betrug der Durchmesser des runden Meßflecks je nach gew¨ahlter Vergr¨oßerung 0,11 mm bis 0,21 mm, was nur einigen wenigen Fl¨ugelschuppen entspricht (je nach Fl¨ugelbereich, Falter- und Fl¨ ugelschuppen-gr¨oße und verwendeter Vergr¨oßerung ca. 2–10 Schuppen). Es konnten damit auch die kleinsten Fl¨ugelmusterelemente getrennt vermessen werden. Nur bei gezielten Untersu-chungen zum Einfluß der Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtung wurden auch andere Winkel verwendet, was aber dann bei den Ergebnissen angegeben wird.

Die verwendete Sichtoptik (mit Lichtleiter; Oriel 77184) erlaubte die direkte Beobach-tung der zu vermessenden Probe und des Meßflecks. Ein mit Verl¨angerungstuben an der Sichtoptik montiertes Quarz-Mikroskopobjektiv (Zeiss Ultra-Fluar 10/0,20) entwarf ein reelles Bild des Objekts auf H¨ohe eines Umlenkspiegels in der Sichtoptik. Im Zentrum der Bildebene (und des Umlenkspiegels) befand sich das Ende eines Lichtleiters (Durchmes-ser des Fa(Durchmes-serb¨undels 0,6 mm), der das auf ihn fallende Licht zu einem Spektrographen (Oriel 77400 MS125 Spectrograph; f = 125 mm; F/3,7; Gitter Oriel 77416 mit 400 Li-nien/mm, 450 nm Blaze) leitete. Das Bild konnte in der Sichtoptik betrachtet werden, wobei das Lichtleiterende einen schwarzen Punkt im Zentrum bildete und den Meßfleck bezeichnete. Der Spektrograph bildete das durch den Lichtleiter der Sichtoptik einfallen-de Licht in sein Spektrum zerlegt auf einem Photodioeinfallen-denarray (Oriel InstaSpec II mit 1024 Elementen; temperaturstabilisiert) ab. Die Steuerung des Diodenarrays und die Da-tenaufnahme erfolgten von einem Personalcomputer aus mit Hilfe der zum Diodenarray geh¨orenden Einsteckkarte und Software (InstaSpec II Version 2.23). Da sich die Angaben

der Firma Oriel zur Wellenl¨angenkalibrierung des Spektrographen als nicht ganz korrekt herausstellten, kalibrierte ich das System mit den Quecksilber-Spektrallinien im Spektrum der Raumbeleuchtung (Leuchstoffr¨ohre Osram L58W/25) und den bei Sansonetti et al.

(1996) angegebenen Daten. Die spektrale Reflexion wurde in dem f¨ur die biologische Fra-gestellung relevanten Bereich von 300 nm bis 680 nm mit einer Aufl¨osung von ca. 0,5 nm gemessen, d. h. ein einziges aufgenommenes Spektrum bestand aus 775 Datenpunkten.

Das Spektroradiometer lieferte auch noch Daten außerhalb der Grenzen dieses Meßbe-reichs (259–758 nm), die aber aus physikalischen Gr¨unden und wegen diverser technischer Limitierungen mit zunehmender Entfernung von den gew¨ahlten Grenzen immer st¨arker fehlerbehaftet waren. Die spektrale Reflexion R(λ) (in Prozent) wurde relativ zu einem Weißstandard (Labsphere Spektralon 99; >99 % Reflexion im gemessenen Wellenl¨ angen-bereich) gemessen und berechnet sich nach der Formel

R(λ) = 100 %× I(λ)

I₀(λ) (2.3)

wobei I₀(λ) die vom Spektroradiometer gemessene Intensit¨at des vom Weißstandard re-flektierten Lichts ist und I(λ) die Intensit¨at des vom Fl¨ugelfleck reflektierten Lichts.

W¨ahrend der Messungen des Weißstandards verschob ich diesen in der Fokusebene. Bei den sehr kleinen Meßflecken k¨onnen so lokale Schwankungen in den Reflexionseigenschaf-ten des – zur Erlangung Lambertscher ReflexionseigenschafReflexionseigenschaf-ten kleinr¨aumig strukturierten (Young 1997) – Weißstandards ausgeglichen werden, da das Diodenarray w¨ahrend der Meßzeit auffallendes Licht integriert. Messungen des Hintergrundsignals und des Weiß-standards wurden regelm¨aßig durchgef¨uhrt, um Fehler durch eine Drift der Lichtquelle oder des Sensors zu vermeiden. Die Fl¨ugel waren bei den Reflexionsmessungen auf schwar-zem Samt montiert, um St¨orungen durch Streulicht zu minimieren. Der Raum mit dem Spektroradiometer war w¨ahrend der Messungen abgedunkelt. Die Fl¨ugel faßte ich nur mit einer spitzen Pinzette an der unmittelbaren Fl¨ugelbasis, einem Bereich, von dem keine Reflexionsmessungen genommen wurden.

Datenaufnahme

Die f¨ur die Untersuchungen des Einflusses der Raupennahrung auf die Fl¨ugelfarben und die als Attrappen verwendeten Falter wurden innerhalb weniger Stunden nach dem Schlupf, aber m¨oglichst bald nach dem Aush¨arten der Fl¨ugel, durch Tieffrieren (ca. −20 ^◦C) get¨otet. Sie blieben bis zur sp¨ateren Verwendung in Pergamint¨uten im Tiefk¨uhlschrank.

Die Tiere waren ggf. vor dem Einfrieren kurz mit Blaus¨aured¨ampfen oder CO₂ bet¨aubt worden, was keine meßbare Auswirkung auf die Fl¨ugelfarben hatte. Die Herstellung der Attrappen ist in Kap. 2.3 auf Seite 40 beschrieben. Die Fl¨ugelfarben der Attrappen wur-den im allgemeinen erst nach dem Einsatz im Verhaltensversuch gemessen.

Reflexionsspektren maß ich von einzelnen Fl¨ugelmusterelementen gesondert f¨ur die f¨ur den Menschen am Fl¨ugel unterscheidbaren Farbkategorien. Zur Erfassung der Fl¨ ugelfar-ben eines Individuums wurden im allgemeinen die Farugelfar-ben nur eines Fl¨ugels gemessen.

Es zeichnete sich schon fr¨uh das Vorhandensein eines Gradienten der UV-Reflexion auf der Unterseite der Vorderfl¨ugel ab, w¨ahrend die Hinterfl¨ugel einheitlicher gef¨arbt waren.

Auf den Unterseiten der Hinterfl¨ugel waren die Musterelemente und die Farben meist deutlicher ausgepr¨agt als auf den Vorderfl¨ugeln, wo diese oft

”verwaschener“ erschienen.

Um unerw¨unschte Einfl¨usse dieser Faktoren auf die Charakterisierung der Fl¨ugelfarben zu

vermeiden, vermaß ich vor allem Hinterfl¨ugel. In den meisten nat¨urlichen Haltungen der lebenden Falter ist von der Vorderfl¨ugelunterseite allenfalls der vordere Rand gut sicht-bar, weil die posterioren Teile vom Hinterfl¨ugel verdeckt werden. Also liefern die Vorder-fl¨ugelunterseiten unter den meisten Bedingungen wenig Information f¨ur Signalempf¨anger, was die Beschr¨ankung der Messungen auf die Hinterfl¨ugel auch aus funktioneller Sicht rechtfertigt. Schließlich legen auch die chemischen Befunde nahe, daß in Hinsicht auf die Flavonoide die Hinterfl¨ugel viel bedeutsamer sind (Schittko 1997, Schittko et al. 1999, Kornmaier 1999). Insbesondere in die Auswertungen zum Einfluß des Raupenfutters auf die Fl¨ugelfarben gingen nur die Daten von Hinterfl¨ugeln ein.

Von jedem vermessenen Fl¨ugel nahm ich f¨ur jede der f¨ur den Menschen unterscheid-baren Farbkategorien (schwarz, weiß, orange und Hintergrund auf den Fl¨ugelunterseiten;

braun und orange auf den Oberseiten) mehrere Reflexionsmessungen an verschiedenen Stellen des Fl¨ugels vor. Dies waren ¨ublicherweise Messungen an jeweils f¨unf Stellen f¨ur schwarz, orange und braun sowie Messungen an jeweils zehn Stellen von weiß und Hinter-grund. Da aufgrund nat¨urlicher, individueller Variabilit¨at vor allem die orangefarbenen Flecken auf den Fl¨ugeloberseiten nicht immer in ausreichender Zahl und Gr¨oße vorhanden waren (vgl. auch Robertson & Young 1984, 1987), konnte unter Umst¨anden nicht f¨ur je-des Individuum dieser komplette Satz von Reflexionsmessungen vorgenommen werden. Es waren recht kleine Meßflecken n¨otig, um bei den kleinen Musterelementen der Fl¨ugel jede Farbe getrennt erfassen zu k¨onnen. Bedingt durch die kleinen Meßflecken war allerdings die Variation zwischen den Einzelmessungen einer Farbe und eines Fl¨ugels groß. Lokale Unterschiede in der Neigung der nicht planen, sondern reliefartig gew¨olbten Fl¨ugelfl¨ache und in der Lage und Ausrichtung der Schuppen sorgten f¨ur unvermeidbare und durch das Meßobjekt bedingte Unterschiede der Einzelmessungen eines Fl¨ugels. Da diese aber bei allen Objekten auftraten, sollten sie durch die Mittelung der Mehrfachmessungen ausge-glichen werden.

F¨ur jedes einzelne Spektrum wurden das Individuum, der Fl¨ugel, die Fl¨ugelseite, das Fl¨ugelmusterelement (Lokalisierung auf dem Fl¨ugel), der exakte Versuchsaufbau, eventu-elle Besonderheiten und die menschliche Farbkategorie protokolliert. Diese Daten wurden zusammen mit Angaben zur Lebensgeschichte der Individuen in einer Datenbank (Mi-crosoft Access 7.0) erfaßt, die die schnelle und eindeutige R¨uckverfolgung jedes einzelnen Reflexionsspektrums erm¨oglichte. Aus dieser Datenbank konnten Gruppen von Reflexi-onsspektren nach Kombinationen beliebiger Kriterien gesucht und f¨ur weitere Analysen automatisch von einem in Borland Delphi 4.0 selbstgeschriebenen Programm ge¨offnet werden.

Irisierende Blauf¨arbung der M¨annchen

Mit einem etwas abge¨anderten Versuchsaufbau bestimmte ich die spektrale Reflexion der blauen, irisierenden Fl¨ugeloberseite von M¨annchen bei verschiedenen Meßwinkeln. Als irisierend werden Farben bezeichnet, die je nach Beobachtungswinkel unterschiedlich er-scheinen (Land 1972). Im Unterschied zum oben beschriebenen Versuchsaufbau setzte ich eine UV-durchl¨assige Quarzlinse (f = 32 mm) anstatt des Mikroskopobjektivs ein.

Dadurch konnte mit einem gr¨oßeren Meßfleck (∅ 1,5 mm) und mit einem gr¨oßeren Ab-stand zwischen Meßoptik und Fl¨ugel gemessen werden. Die Beleuchtung erfolgte unter einem konstant gehaltenen Winkel von 45^◦ zur Meßrichtung von der apikalen Seite des Fl¨ugels her. Um Messungen aus verschiedenen Winkeln zum Fl¨ugel vorzunehmen, wurde

der Fl¨ugel um eine Achse in der Fl¨ugelebene geschwenkt, die senkrecht zur Beleuch-tungsrichtung stand (vgl. Abb. 2.3). Dabei ver¨anderten sich also sowohl die Meß- als auch die Beleuchtungsrichtung. Auf nat¨urliche Verh¨altnisse ¨ubertragen entspricht dies beispielsweise einem ortsunver¨anderlichen Beobachter mit festem Winkel zur Sonne, der den bewegten Schmetterlingsfl¨ugel unter verschiedenen Winkeln zu sehen bekommt. Der Weißstandard wurde in derselben Weise geschwenkt wie der Fl¨ugel. Die Referenzmes-sungen am Weißstandard und die MesReferenzmes-sungen am Fl¨ugel wurden jeweils unter demselben Winkel vorgenommen.