4. Methoden
4.3 Messung der Harnstoffkonzentration im murinen Serum und in der BAL
Die quantitative Bestimmung des Harnstoffgehalts im Mäuseserum und in der BAL-Flüssigkeit erfolgte nach dem Prinzip folgender Farbreaktion. Das Enzym Urease katalysiert rasch die Hydrolyse von Harnstoff in Ammoniak und Kohlenstoffdioxid. Der entstehende Ammoniak reagiert mit Hypochlorit und Phenol zu Indophenol, dessen Extinktion bei einer
Methoden 33 Wellenlänge von 578 nm bestimmt werden kann. Die Extinktion ist proportional zur Harnstoffkonzentration.
a) Harnstoff + H2O Urease 2 NH3 + CO2 b) 2 NH3 + 2 NaClO 2 NH2 + NaOH
c) 2 Phenol + 2 NH2Cl + 2 OH- 2 4-Aminophenol + 2 Cl- + 2 H2O d) 2 4-Aminophenol + 2 Phenol + O2 2 Indophenol + 2 H2O
Lösungen:
Urease-Lösung: 10 U Urease in 0,5 ml PBS und 0,5 ml Glycerol Harnstoff-Eichlösung: 30 mg Harnstoff/dl Wasser
Phenollösung: 25 mg Nitroprussid-Natrium-Dihydrat und 5 ml flüssiges Phenol in 500 ml Wasser gelöst
Hypochlorit-Lösung: 2,5 g Natriumhydroxid und 2,5 ml Natriumhypochlorit-Lösung mit 13 % aktivem Chlor in 500 ml Wasser gelöst
Durchführung:
In Zweifachansätzen wurden jeweils 50 µl Probe, 50 µl Harnstoff-Eichlösung und 50 µl Kontrolle (Wasser), mit 25 µl Urease versetzt und 15 Minuten bei RT inkubiert. Nach Zugabe von je 1,25 ml Phenollösung und 1,25 ml Hypochloritlösung und einer 30 minütigen Inkubationszeit, erfolgte die photometrische Absorptionsbestimmung bei einer Wellenlänge von 578 nm. Die Quantifizierung erfolgte mittels Interpolation in der Eichkurve.
Methoden 34
4.4 Messung der Myeloperoxidaseaktivität (MPO) in murinem Lungen- und Lebergewebe
Da ein direkter Zusammenhang zwischen der MPO Aktivität im Gewebe und der Anzahl der dort vorhandenen neutrophilen Granulozyten besteht (ALLAN et al. 1985), wurde zur Messung der Akkumulation der neutrophilen Granulozyten im Lungen- und Lebergewebe die Aktivität der MPO bestimmt.
Die kryokonservierten Gewebeproben wurden zunächst gewogen und in entsprechendem Anteil 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) mit 5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und 0,5 %-igem Hexadecylmethylammoniumbromid homogenisiert. Die Homogenisation erfolgte 3 mal 5 Minuten mittels Ultraturrax auf Eis.
Es folgte die Lyse der entstandenen Suspension im 10 minütigen, eisgekühlten Ultraschallbad.
Anschließend wurde ein 30 minütiger Zentrifugationsschritt bei 3000xg und 4°C durchgeführt. Je 10 µl des entstandenen Probenüberstandes wurden nun in einem well einer 96-well-Mikrotiterplatte mit 390 µl einer 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung, 3%
Wasserstoffperoxid und 1 % O-diasinidine Hydrochlorid versetzt. Bei 450 nm wurde nun im Photometer (ELISA-Reader) die Änderung der optischen Dichte über 3 Minuten gemessen.
Weiterhin wurde anhand einer zuvor auf die gleiche Weise erstellten Myeloperoxidase-Standardkurve die genaue Menge MPO quantifiziert.
4.5 Histologie
Nach Tötung der Tiere wurden Lunge und Leber entnommen. In einen Lungenflügel wurde mittels einer Kanüle über den Hauptbronchus 1 ml 5 % Phosphat gepufferte Formaldehyd Lösung infundiert, anschließend mit einer Ligatur verschlossen und in 5 % Phosphat gepufferte Formaldehyd-Lösung für mindestens 7 Tage aufbewahrt. Nach Abtrennung eines Leberlappens wurde dieser, genau wie der Lungenflügel, über den Zeitraum von mindestens einer Woche in 5 % Phosphat gepufferter Formaldehyd-Lösung gelagert.
Methoden 35 Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die Gewebeproben in Paraffin eingebettet und in 3 µm Schichten geschnitten, welche anschließend mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurden.
In den Präparaten der Lunge wurden interstitielle Verdickungen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Pneumozyten Typ II beobachtet. Die Befunde wurden in die Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt. In den Präparaten der Leber wurden hydropische Degeneration, multifokale Herdnekrosen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Kupffersche Sternzellen beobachtet. Die Befunde wurden in die Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt. Die mikroskopische Auswertung fand mit 20- und 40-facher Vergrößerung statt.
4.6 Messung von Interleukinen in murinem Serum
Der Einfluß von Fucoidin auf den pathophysiologischen Prozess des Ischämie-Reperfusionsschadens (first-hit) und der durch CLP ausgelösten Sepsis (second-hit) der Mäuse sollte anhand der IL-6- und IL-10-Synthese mittels Enzym-gekoppelter Immunassays (ELISA) bestimmt werden. Zur quantitativen Bestimmung des Serum-IL-6 und Serum-IL-10 wurden IL-6 und IL-10 ELISA-Kits der Firma R&D Systems, Minneapolis, USA, verwendet.
Die ELISA wurden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die verwendeten ELISAs beruhten auf dem sogenannten „Sandwich System“ (s.u.).
Methoden 36 4.6.1 Interleukin-6 ELISA
Durchführung:
Die 96-well-Mikrotiterplatte war mit einem spezifischen, monoklonalen anti-Maus IL-6 Antikörper beschichtet (Capture-antibody), welcher vorhandenes IL-6 aus zupipettierten Serumproben und Standards (je 50 µl/well) bindet. Nach einer zweistündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und anschließendem fünfmaligem Waschen zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen wurde ein mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelter zweiter polyklonaler anti-Maus IL-6 AK (je 100 µl/well) hinzugegeben, welcher an das bereits über den Capture-antibody an der Mikrotiterplatte gebundene IL-6 bindet (Detecting-antibody).
Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde der nicht gebundene Anteil an Zweitantikörper durch fünfmaliges Waschen entfernt. Anschließend wurden 100 µl Substrat (3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin) pro well hinzugefügt und bei RT auf dem Rüttler inkubiert. Nach 30 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopplösung (HCl 10 M) gestoppt. Das gebundene Enzym setzt das Substrat zu dem meßbaren Farbstoff um, dessen Konzentration proportional zur IL-6-Konzentration im Ansatz ist. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wurde die O.D. im ELISA-Reader in Doppelwerten gemessen und über eine Standardeichreihe (1000 pg/ml-15,6 pg/ml) entsprechend den Herstellerangaben in Konzentrationen umgerechnet.
4.6.2 Interleukin-10 ELISA
Durchführung:
Die Durchführung erfolgte vom Prinzip wie der oben beschriebene IL-6 ELISA mit dem Unterschied, daß IL-10-spezifische AK verwendet wurden. Die Mikrotiterplatte war hier mit einem spezifischen polyklonalen anti-Maus IL-10 Antikörper beschichtet (Capture-antibody).
Als Zweitantikörper (Detecting-antibody) wurde ein mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelter polyklonaler anti-Maus IL-10 AK eingesetzt. Alle weiteren Schritte erfolgten, wie oben beschrieben.
Methoden 37 4.7 Statistik
Innerhalb der Gruppen wurden Mittelwerte gebildet und als Streuungsmaß der Standard error of the Mean (SEM) berechnet.
Alle statistischen Berechnungen erfolgten mit dem Programm Prism, GraphPad Software Inc, San Diego, USA.
Es wurden die 6 Gruppenpaare Kontrolle mit Laparotomie 8h, Laparotomie 8h mit Laparotomie 48h, Ischämie/Reperfusion 8h mit Ischämie/Reperfusion 48h, Ischämie/Reperfusion 48h mit Ischämie/Reperfusion 48h + Fucoidin, caecale Ligatur und Punktion 40h mit caecale Ligatur und Punktion 40h + Fucoidin und Ischämie/Reperfusion + caecale Ligatur und Punktion 48h mit Ischämie/Reperfusion + caecale Ligatur und Punktion 48h + Fucoidin verglichen.
Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten dieser Gruppen wurden mit dem ungepaarten Student’s t-test ermittelt.
Die Überlebenskurven wurden mit einem sogenannten Fisher´s exakter Test geprüft.
(p < 0,05 = signifikanter Unterschied)
38
5. Ergebnisse
5.1 Messung der IL-6 Konzentration im Serum
IL-6 spielt als multifunktionaler Immunmediator eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr und Hämatopoese. Zur Messung der IL-6 Konzentration im murinen Serum wurde ein Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), wie unter Sektion 4.6.1 beschrieben, verwendet.
Abb. 5.1: Mittelwerte ± SEM der IL-6 Konzentration in murinem Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Abbildung 5.1 zeigt die mittlere IL-6 Konzentration gemessen in pg/ml in murinem Serum.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche lediglich einer Anästhesie unterzogen wurde und bei der eine mittlere IL-6 Konzentration von 15,6 ± 2,5 pg/ml gemessen wurde, war bei den laparotomierten Tieren nach 8 Stunden ein signifikanter Anstieg der IL-6 Konzentration auf 51,3 ± 9,4 pg/ml im Serum zu beobachten (p < 0,05). 48 Stunden nach Laparotomie war die Serumkonzentration von IL-6 bereits wieder auf Normalwerte (15,5 ± 2 pg/ml) wie bei der
Kontrolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP 48h I/R+CLP 48h+F
0 100 200 300 400
*
*
*
*
Versuchsgruppen
[IL-6] (pg/ml)
Ergebnisse 39 Kontrollgruppe abgesunken (Abbildung 5.1). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt nach Ischämie/Reperfusion, bei der es nach 8 Stunden zu einem starken signifikanten Anstieg der IL-6 Konzentration (321,5 ± 52,1 pg/ml) kam. Dieser Konzentrationsanstieg war deutlich höher als bei der Laparotomiegruppe. Nach Ischämie/Reperfusion war nach 48 Stunden ein Rückgang der IL-6 Konzentration auf 44,6 ± 29 pg/ml zu beobachten. Dies zeigt auch die Untersuchung der anderen „one-hit“ Gruppe, bei der es nach CLP nach 40 Stunden (29,3 ± 3,4 pg/ml) zu keiner Erhöhung der IL-6 Serumkonzentration kam.
Auch nach Gabe von Fucoidin kam es in den beiden „one-hit“ Gruppen Ischämie/
Reperfusion 48h (26,2 ± 8,5 pg/ml) und CLP 40h (22,5 ± pg/ml) zu keiner IL-6 Konzentrationsveränderung.
In dem „two-hit“ Modell nach Ischämie/Reperfusion und caecaler Ligation und Punktion kam es nach 48 Stunden ebenfalls zu keinem IL-6 Konzentrationsanstieg (30,0 ± 7,2 pg/ml). In der mit Fucoidin behandelten „two-hit“ Gruppe zeigte sich jedoch mit 230,5 ± 52,9 pg/ml eine im Vergleich zu der Gruppe ohne Fucoidin stark signifikant erhöhte IL-6 Konzentration nach 48 Stunden (Abbildung 5.1).
5.2Messung der IL-10 Konzentration im Serum
IL-10 spielt als Immunmediator eine wichtige Rolle bei der Regulation inflammatorischer Prozesse. IL-10 ist unter anderem in der Lage, die Produktion unterschiedlicher Zytokine und Immunmediatoren immunkompetenter Zellen zu inhibieren und die zytotoxische Aktivität von Makrophagen herabzusetzen. Als antiinflammatorisches Zytokin nimmt es bei der Entstehung des SIRS und MODS eine wichtige Funktion ein. Die Messung des IL-10 erfolgte wie unter Sektion 4.6.2 beschrieben, mittels eines ELISA.
Ergebnisse 40
Abb. 5.2: Mittelwerte ± SEM der IL-10 Konzentration in murinem Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Abbildung 5.2 zeigt die mittlere IL-10 Konzentration gemessen in pg/ml in murinem Serum.
Sowohl in der Kontrollgruppe (20,5 ± 2,4 pg/ml) als auch in den Guppen mit durchgeführter Laparotomie, Ischämie/Reperfusion, caecaler Ligatur und Punktion waren weder nach 8 Stunden noch nach 48 Stunden signifikant erhöhte mittlere IL-10 Konzentrationen im Serum nachweisbar (in diesen Gruppen von minimal 18,9 ± 0,4 pg/ml bis maximal 37,3 ± 6,7 pg/ml).
In der „two-hit“ Gruppe war nach Gabe von Fucoidin ein signifikanter Anstieg der IL-10 Konzentration auf 106,1 ± 25,5 pg/ml im Vergleich zur „two-hit“ Gruppe ohne Fucoidingabe (37,3 ± 6,7 pg/ml) zu beobachten (p < 0,05).
Kontrolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP 48h I/R+CLP 48h+F
0 50 100
150 *
Versuchsgruppen
[IL-10] (pg/ml)
Ergebnisse 41 5.3 Messung der MPO-Aktivität in der Lunge und in der Leber
Da ein direkter Zusammenhang zwischen dem MPO Gehalt im Gewebe und der Anzahl der dort vorhandenen neutrophilen Granulozyten besteht, wurde zur Messung der Akkumulation der neutrophilen Granulozyten im Lungen- und Lebergewebe die Aktivität der MPO bestimmt. Die Messungen wurden, wie in Sektion 4.4 der Methoden beschrieben, durchgeführt.
Abb. 5.3.1: Mittelwerte ± SEM der Myeloperoxidaseaktivität in murinem Lungengewebe
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Abbildung 5.3.1 zeigt die Myeloperoxidaseaktivität gemessen in U/min der einzelnen Gruppen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (0,026 ± 0,005 U/min) kam es 8 Stunden nach Laparotomie (0,035 ± 0,002 U/min) und Ischämie/Reperfusion (0,04 ± 0,004 U/min) zu einem Anstieg der MPO-Aktivität im pulmonalen Gewebe.
Wie in Abbildung 5.3.2 dargestellt, konnte eine derartige Aktivitätszunahme der Myeloperoxidase in der Leber in ähnlicher Weise gezeigt werden (Kontrolle 0,022 ± 0,003 U/min), Laparotomie (0,034 ± 0,003 U/min) und Ischämie/Reperfusion (0,05 ± 0,006 U/min).
Nach 48 Stunden war diese bereits wieder auf normale Werte in beiden Organen abgesunken
Kontrolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP 48h I/R+CLP 48h+F
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
*
*
Versuchsgruppen
MPO-Aktivität [U/min]
Ergebnisse 42 (im Mittel 0,024 ± 0,003 U/min). Die Aktivitätsabfälle bei den Gruppen Lunge und Leber Laparotomie 8h und 48h und Lunge Ischämie/Reperfusion 8h und 48h waren signifikant (p<0,05).
Abb. 5.3.2: Mittelwerte ± SEM der Myeloperoxidaseaktivität in murinem Lebergewebe
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Pulmonale MPO-Aktivität [U/min]
Hepatische MPO-Aktivität [U/min]
Ischämie/Reperfusion 48h 0,025 ± 0,004 0,020 ± 0,004
Ischämie/Reperfusion 48h + Fucoidin 0,029 ± 0,003 0,021 ± 0,002
CLP 40h 0,033 ± 0,003 0,024 ± 0,002
CLP 40h + Fucoidin 0,040 ± 0,003 0,028 ± 0,002
IR + CLP 48h 0,029 ± 0,002 0,032 ± 0,004
IR + CLP 48h + Fucoidin 0,034 ± 0,003 0,035 ± 0,002
Tab. 5.3.3: Mittelwerte ± SEM der Myeloperoxidaseaktivität in murinem Leber- und Lungengewebe bestimmter Untersuchungsgruppen
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP
Kontrolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP 48h I/R+CLP 48h+F
0.000 0.025 0.050
*
*
Versuchsgruppen
MPO-Aktivität [U/min]
Ergebnisse 43 Wie in Tabelle 5.3.3 dargestellt, zeigten sich jedoch innerhalb der einzelnen Gruppen Unterschiede bei den Tieren, die mit Fucoidin behandelt wurden. Sowohl in den „one-hit“
Modellen (Ischämie/Reperfusion und caecale Ligatur und Punktion) als auch in dem „two-hit“ Modell war hier im Vergleich zu den nicht mit Fucoidin behandelten Tieren die pulmonale und hepatische MPO-Aktivität höher. Diese Unterschiede waren allerdings statistisch nicht signifikant.
5.4 Pulmonalkapillare Permeabilität
Die pulmonalkapillare Permeabilität kann anhand der Proteinkonzentration im Alveolarraum ermittelt werden. Hierzu wurde am Ende des jeweiligen Versuches eine BAL durchgeführt (siehe Sektion 4.14 in Methoden). Nach einer Korrektur der Proteinkonzentration in der zurückgewonnenen BAL-Flüssigkeit über die Harnstoffkonzentration des Plasmas und der BAL konnte die Proteinratio des Epithelial linig fluid (ELF)/Plasma bestimmt werden (siehe Sektion 4.1.5 und 4.1.6 in Methoden).
Abb. 5.4: ELF/Plasma Protein Ratio als Ausdruck der pulmonalkapillären Permeabilitätsstörung Die Werte sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM.
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Kontolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP48h I/R+CLP48h+F
0.00 0.25 0.50 0.75
*
Versuchsgruppen
ELF/Plasma Protein Ratio
Ergebnisse 44 Abbildung 5.4 zeigt die mittlere Proteinratio aller Versuchsgruppen. Auffällig war hier, daß in der Gruppe Ischämie/Reperfusion mit einer Ratio von 0,52 ± 0,24 nach 48 Stunden eine erhöhte Permeabilität im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ratio 0,28 ± 0,08) vorlag. Bei der Gruppe Ischämie/Reperfusion nach 48 Stunden, die mit Fucoidin behandelt wurde, war eine deutliche Verringerung der Permeabilität im Vergleich zur Gruppe Ischämie/Reperfusion nach 48 Stunden ohne Fucoidin festzustellen (Ratio 0,27 ± 0,04). Dieser Wert entsprach dem Normalwert.
In den beiden „two-hit“ Gruppen war diese Verringerung der Permeabilität auf Normalwerte nicht vorhanden (Ratios I/R+CLP 48h 0,66 ± 0,18 und I/R+CLP 48h +F 0,58 ± 0,24).
Insgesamt zeigten sich innerhalb der einzelnen Gruppen Unterschiede bei den Tieren, die mit Fucoidin behandelt wurden. Sowohl in den „one-hit“ Gruppen (Ischämie/Reperfusion 48h und caecale Ligatur und Punktion 40h) als auch in der „two-hit“ Gruppe war hier im Vergleich zu den nicht behandelten Tieren die pulmonalkapilläre Permeabilität geringer.
Statistisch ausgewertet waren diese Werte allerdings nicht signifikant.
5.5 Letalität der Versuchstiere
Insgesamt gingen 133 Mäuse in die Tierversuche ein. Davon überlebten 91 Tiere den Versuch bis zur planmäßigen Tötung. 42 Tiere verstarben vor Versuchsende und konnten nicht mit in die Auswertung (keine Zytokinbestimmung, MPO-Aktivität, Ratio und Histologie) genommen werden.
In der Gruppe Ischämie/Reperfusion nach 48 Stunden verstarben 25 Tiere von insgesamt 33 Tieren (75,8 % Letalität), in der mit Fucoidin behandelten Gruppe verstarb 1 Tier von insgesamt 9 Tieren (11,1 % Letalität). Dieses Ergebnis war signifikant (s. Abb. 5.5.1).
3 von insgesamt 11 Tieren verstarben in der Gruppe nach caecaler Ligatur und Punktion (27,3 % Letalität), in der mit Fucoidin behandelten Gruppe starb 1 Tier von insgesamt 10 Tieren (10 % Letalität).
In der „two-hit“ Gruppe verstarben ohne Fucoidin 7 von 18 Mäusen (38,9 % Letalität), in der mit Fucoidin behandelten Gruppe verstarben 5 von 15 Mäusen (33,3 % Letalität).
Ergebnisse 45
Abb.5.5.1: Überlebensrate (Survival) der Versuchsgruppen Ischämie/Reperfusion 48h ohne Fucoidin = ---- und Ischämie/Reperfusion 48h mit Fucoidin = , *p < 0,05
Abb. 5.5.2: Überlebensrate (Survival) der Versuchsgruppen caecale Ligatur und Punktion 40h ohne Fucoidin = ---- und caecale Ligatur und Punktion 40h mit Fucoidin =
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0 20 40 60 80 100
Zeitpunkt (h)
Überlebensrate (%)
*
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0 60 60 70 80 90 100
Zeitpunkt (h)
Überlebensrate (%)
Ergebnisse 46
Abb. 5.5.3: Überlebensrate (Survival) der Versuchsgruppen Ischämie/Reperfusion und caecale Ligatur und Punktion 48h ohne Fucoidin = ---- und Ischämie/Reperfusion und caecale Ligatur und Punktion 48h mit Fucoidin =
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0 50 50 60 70 80 90 100
Zeitpunkt (h)
Überlebensrate (%)
Ergebnisse 47 5.6 Histologie
5.6.1 Lunge
Die Lungen wurden lichtmikroskopisch auf die Merkmale interstitielle Verdickungen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Pneumozyten Typ II im Sinne einer Parenchymschädigung untersucht und zeigten zahlreiche pathologische Befunde. Diese Befunde wurden qualitativ in die drei Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt.
Tab. 5.6.1.1: Lichtmikroskopische Befunde im Lungengewebe der Versuchsgruppen
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP
- = ohne besonderen Befund, + = geringgradig, ++ = mittelgradig
Ergebnisse 48 Die lichtmikroskopischen Untersuchungen der Lunge zeigen, daß in den Gruppen Ischämie/Reperfusion nach 8h und 48h, caecale Ligatur und Punktion nach 40h und Ischämie/Reperfusion und caecale Ligatur und Punktion nach 48h eine gering bis mittelgradige Verdickung des Interstitiums, geringgradig granulo-histiozytäre Infiltrationen und geringgradig vergrößerte Pneumozyten Typ II auftraten. In den mit Fucoidin behandelten Gruppen war dies in geringerem Maß der Fall.
Abb.5.6.1.1: Normales murines Lungengewebe (Kontrollgruppe), Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach.
Ergebnisse 49
Abb.5.6.1.2: Pathologische verändertes murines Lungengewebe nach Ischämie/Reperfusion nach 48 Stunden, Infiltration von Leukozyten, Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach
Abb.5.6.1.3: Geringgradig verändertes murines Lungengewebe nach Ischämie/Reperfusion nach 48 Stunden und Fucoidinapplikation, Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach
Ergebnisse 50 5.6.2 Leber
Ebenso wie bei dem untersuchten Lungengewebe zeigten die lichtmikroskopischen Untersuchungen der Leberschnitte pathologische Befunde. In den Präparaten wurden hydropische Degeneration, multifokale Herdnekrosen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Kupffersche Sternzellen beobachtet. Die Befunde wurden qualitativ in die Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt.
Hydropische
Tab. 5.6.2.2: Lichtmikroskopische Befunde im Lebergewebe der Versuchsgruppen
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP
- = ohne besonderen Befund, + = geringgradig, ++ = mittelgradig
Bei allen Tieren war eine Aktivierung der Kupfferschen Sternzellen sichtbar.
Bei lichtmikroskopischer Untersuchung der Leber zeigte sich in allen mit Fucoidin behandelten Gruppen eine Verringerung der hydropischen Degeneration und der granulo-histiozytären Infiltrationen. Multifokale Herdnekrosen waren nicht mehr vorhanden.
Ergebnisse 51
Abb.5.6.2.1: Normales murines Lebergewebe (Kontrollgruppe), Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach.
Abb.5.6.2.2: Pathologische verändertes murines Lebergewebe nach caecaler Ligatur und Punktion nach 40 Stunden, Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach
Ergebnisse 52
Abb.5.6.2.3: Geringgradig verändertes murines Lebergewebe nach caecaler Ligatur und Punktion nach 40 Stunden und Fucoidinapplikation, Färbung: Hämatoxylin-Eosin, Vergrößerung: 20-fach
53
6. Diskussion
Seit zwei Jahrzehnten sind SIRS und MODS als eigenständige Syndrome beschrieben. Auch nach intensiven Bemühungen, den pathogenetischen Mechanismus der Entstehung des SIRS und MODS aufzuklären, blieben diese Syndrome die führende Todesursache auf chirurgischen Intensivstationen (DEITCH 1992). Unterschiedlichen Therapieversuchen zum Trotz, steht eine suffiziente Kausaltherapie nicht zur Verfügung. Mittel der Wahl ist weiterhin die oftmals vergebliche symptomatische Behandlung in Kombination mit bestmöglichem intensiv-medizinischem Management.
Traumata mit konsekutiver Hypoxie im Rahmen einer Ganzkörper Ischämie-Reperfusion, Hypovolämie und Schocksymptomatik resultieren in der Aktivierung sämtlicher Abwehrsysteme. In der Folge werden in hohem Maße über humorale Komponenten des Immunsystems neutrophile Granulozyten aktiviert (DWENGER et al. 1993), was zu einer vermehrten Adhäsivität im Kapillarbett führt und einen Respiratory Burst veranlaßt (BABIOR 1984; FAZELI u. RICHARDS 1984). Die neutrophilen Granulozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entstehung der sekundären Folgen des Traumas.
Die sekundären Organschäden zum Beispiel nach Ischämie/Reperfusion finden ihren Ursprung in einem komplexen Zusammenspiel von immunmodulatorisch wirksamen Zytokinen, Endothelzellen und neutrophilen Granulozyten, wobei die Migration der zirkulierenden neutrophilen Granulozyten in das Gewebe von spezifischen granulozytär-endothelialen Interaktionen reguliert wird (VAN GRIENSVEN 1999). Eine wichtige Rolle hierbei spielt das L-Selektin, welches das Rolling der neutrophilen Granulozyten über das aktivierte Endothel mediiert (NICHOLSON et al. 1998; SPERTINI et al. 1991b). Nach erfolgter Extravasation werden interstitiell inflammatorische Komponenten wie Sauerstoffradikale, Zytokine und Proteasen freigesetzt, welche schwere sekundäre Organschäden induzieren und in einem SIRS oder MODS resultieren können. Die lokale Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IL-1β und IL-6 ist grundsätzlich wichtig, damit nach einem Trauma neutrophile Granulozyten an den Ort der Inflammation gelangen. Werden aber nach Ischämie/Reperfusion systemisch zu große Mengen sezerniert, überwiegen nachteilige Effekte. Oftmals ist auch eine regulierende antiinflammatorische Immunantwort mit vermehrter IL-10 Sekretion nicht mehr in der Lage, die ablaufende
Diskussion 54 Inflammation zu stoppen, so daß eine pathophysiologische Immundysregulation resultiert. Im Vordergrund steht hier die gestörte pulmonale Endothelpermeabilität mit Gewebeschaden und daraus resultierender Dysfunktion. Diese Gewebsläsion führt wiederum zu vermehrter Aktivierung neutrophiler Granulozyten und mündet über diesen circulus vitiosus in der Entwicklung eines SIRS oder MODS. Das L-Selektin spielt bei der Pathogenese eine zentrale Rolle, daher ist über eine selektive Inhibition eine Eindämmung der oben beschriebenen Immunreaktion durch Unterdrückung des Rollings und daraus resultierender verminderter Neutrophilenmigration in das Gewebe denkbar. Substanzen, welche L-Selektin inhibieren, wären hier geeignet. Eine Möglichkeit ist der Einsatz eines Antikörpers gegen L-Selektin, hierbei muß allerdings bei wiederholter Gabe an eine Erkennung des Antikörpers als Antigen gedacht werden (VAN GRIENSVEN 1999). In Betracht kommen weiterhin niedermolekulare Substanzen auf Basis der sialyl LewisX ähnlichen Oligosaccharide, die zu keiner Anti-Antikörperreaktion führen und eine geringe allergene Wirkung entfalten. Hier ist als Beispiel Fucoidin zu nennen.
Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit die Interaktionen zwischen neutrophilen Granulozyten, Endothelzellen und Zytokinen und die daraus entstehenden Organschäden untersucht und der mögliche Einfluß von Fucoidin auf Immunmodulation und Organprotektion bei der Entstehung von SIRS und MODS nach Trauma dargestellt.
In einem In-vivo-two-hit Modell wurden Mäuse einer Ischämie und Reperfusion (Trauma) mit konsekutiver Sepsis (caecale Ligatur und Punktion) ausgesetzt, welche zu einem SIRS oder MODS führen kann. Im Modell wurde eine Gruppe Tiere mit Fucoidin zur Inhibition der Granulozytenmigration behandelt und die andere wurde nicht mit Fucoidin behandelt. In den Gruppen der „one-hit" Modelle, zum einen Ischämie/Reperfusion und zum anderen caecale Ligatur und Punktion, wurde ebenfalls eine Gruppe mit Fucoidin behandelt und die andere nicht. Die Inhibition des Rollings der Granulozyten wurde mittels Histologie und Messung
In einem In-vivo-two-hit Modell wurden Mäuse einer Ischämie und Reperfusion (Trauma) mit konsekutiver Sepsis (caecale Ligatur und Punktion) ausgesetzt, welche zu einem SIRS oder MODS führen kann. Im Modell wurde eine Gruppe Tiere mit Fucoidin zur Inhibition der Granulozytenmigration behandelt und die andere wurde nicht mit Fucoidin behandelt. In den Gruppen der „one-hit" Modelle, zum einen Ischämie/Reperfusion und zum anderen caecale Ligatur und Punktion, wurde ebenfalls eine Gruppe mit Fucoidin behandelt und die andere nicht. Die Inhibition des Rollings der Granulozyten wurde mittels Histologie und Messung