Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und der
Unfallchirurgischen Klinik
der Medizinischen Hochschule Hannover
Der Einfluß von Fucoidin auf das Entstehen von
sekundärem Lungen- und Leberversagen in einem two-hit Modell
von Ischämie und Reperfusion und
caecaler Ligation und Punktion in der Maus
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztlichen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kerstin Beitze-Breyhan
aus Göttingen
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr.med.vet. M. Kietzmann, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
Dr.hum.biol. Martijn van Griensven, Unfallchirurgische Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr.med.vet. M. Kietzmann 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr.rer.nat. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2000
Meinem Mann
Dennis
gewidmet
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungen...
1. Einleitung... 8
2. Fragestellung... 26
3. Material... 27
3.1 Chemikalien und Medikamente ... 27
3.2 Geräte... 27
3.3 Verbrauchsmaterial ... 28
3.4 Versuchstiere... 28
4. Methoden... 29
4.1 In-vivo-Studie... 29
4.1.1 Versuchstiere... 29
4.1.2 Versuchstiergruppen ... 29
4.1.3 Versuchsprotokoll des Ischämie-Reperfusions- und CLP-Modells („two-hit“) .... 30
4.1.4 Tötung der Tiere zur Blut- und Organentnahme... 31
4.1.5 Broncho-alveoläre Lavage (BAL)... 31
4.1.6 Bestimmung der kapillären Permeabilität der Lunge... 31
4.2 Quantitative Proteinbestimmung nach Lowry ... 32
4.3 Messung der Harnstoffkonzentration im murinen Serum und in der BAL... 32
4.4 Messung der Myeloperoxidaseaktivität in murinem Lungen- und Lebergewebe .. 34
4.5 Histologie... 34
4.6 Messung von Interleukinen in murinem Serum ... 35
4.6.1 Interleukin-6 ELISA... 35
4.6.2 Interleukin-10 ELISA... 36
4.7 Statistik ... 37
Inhaltsverzeichnis
5. Ergebnisse...38
5.1 Messung der IL-6 Konzentration im Serum... 38
5.2 Messung der IL-10 Konzentration im Serum... 39
5.3 Messung der MPO-Aktivität in der Lunge und in der Leber ... 41
5.4 Pulmonalkapillare Permeabilität... 43
5.5 Letalität der Versuchstiere ... 44
5.6 Histologie... 47
5.6.1 Lunge ... 47
5.6.2 Leber ... 50
6. Diskussion... 53
6.1 Der Einfluß von Fucoidin auf die IL-6 Konzentration im Serum ... 55
6.2 Der Einfluß von Fucoidin auf die IL-10 Konzentration im Serum ... 56
6.3 Der Einfluß von Fucoidin auf die pulmonalkapillare Permeabilität ... 57
6.4 Der Einfluß von Fucoidin auf die MPO-Aktivität im pulmonalen und hepatischen Gewebe ... 58
6.5 Der Einfluß von Fucoidin auf die Histologie von Lunge und Leber ... 59
6.6 Der Einfluß von Fucoidin auf die Letalität ... 60
7. Zusammenfassung... 62
8. Summary... 63
9. Literaturverzeichnis... 64
Abkürzungen
A. Arteria
AK Antikörper
ARDS Adult Respiratory Distress Syndrome
BAL Broncho-alveoläre Lavage
BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
CARS Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome
CLP caecale Ligatur und Punktion
DNA Desoxyribonukleinsäure
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Enzym-gekoppelter Immunassay) GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
HE Hämalaun - Eosin
IFN Interferon
IL Interleukin
i.v. intravenös
LPS Lipopolysaccharide
MARS Mixed Antagonist Response Syndrome
min Minuten
MODS Multiorgan Dysfunktions Syndrom
MOV Multiorganversagen
MPO Myeloperoxidase
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
OD Optische Dichte
RT Raumtemperatur
s.c. subcutan
SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome
Th1-Zellen T-Helferzellen
TNF Tumornekrosefaktor
V. Vena
Ferner gelten die allgemeinen SI-Einheiten und die chemischen Elementsymbole.
8
1. Einleitung
Die klinische Versorgung polytraumatisierter Schockpatienten war in allen Epochen der Geschichte ein schwerwiegendes Problem. Wie bei allen Formen des Schocks (septischer Schock, hypovolämischer Schock, kardiogener Schock, neurogener Schock und anaphylaktischer Schock) kommt es zu einer Störung der Makro- und Mikrozirkulation mit konsekutiver Sympathikusaktivierung, welche eine Minderversorgung der Gewebe mit Nährstoffen und Sauerstoff zur Folge hat. Die zelluläre Proteinbildung ist gestört, Zellorganellen zerfallen und lysosomale Enzyme werden in die Zelle freigesetzt. Es resultiert eine Aktivierung des Immunsystems und eine Zerstörung der Zellstruktur. Aufgrund dieser pathophysiologischen Mechanismen kommt es zu pathologischen Organveränderungen an Lungen, Leber, Nieren und Intestinum während des Schockgeschehens.
Durch ständig fortschreitende Verbesserungen der rettungsmedizinischen Maßnahmen und Einführung großzügiger Volumenersatztherapien wurde das initiale Überleben von polytraumatisierten Schockpatienten ermöglicht. Dadurch trat ein bislang nicht bekanntes Spektrum von Folgeerkrankungen auf, welches unmittelbar mit den oben beschriebenen Organveränderungen im Schockgeschehen in Zusammenhang steht. Im klinischen Vordergrund standen hier zunächst die pathophysiologischen Veränderungen der Lunge (Komplex aus Luftnot, erhöhten Temperaturen und zentraler Zyanose), welche als
„Schocklunge“ beschrieben wurden (MOON 1932; JENKINS et al. 1950).
1967 wurde durch ASHBAUGH et al. der noch heute gültige Begriff des „Adult Respiratory Distress Syndrome“ (ARDS) eingeführt (ASHBAUGH et al. 1967). Dieses Syndrom stand zu der Zeit an erster Stelle der Todesursachen im Verlauf bei Patienten nach Schock (ASHBAUGH et al. 1967; BAUE 1975; EISEMANN et al. 1977; GORIS u. DRAAISMA 1982; PONTOPPIDAN et al. 1985; ALBERTS et al. 1986). Die Inzidenz des ARDS konnte durch weitere intensivmedizinische Behandlungsfortschritte erheblich verringert werden, so daß neben den zunächst lebenslimitierenden Lungenveränderungen auch die Veränderungen der anderen Organsysteme eine wichtige Rolle einnahmen. Dieses neu entstandene Syndrom wurde 1973 von TILNEY et al. erstmalig als „distal organ failure“ beschrieben, 1975 wurde der Begriff des Multiorganversagens (MOV) durch Baue geprägt (BAUE 1975). Seitdem wurden auf den Intensivstationen steigende Zahlen von Patienten ermittelt, die trotz maximaler Intensivtherapie nicht mehr stabilisiert werden konnten und ein mit hoher Letalität
Einleitung 9 einhergehendes progressives MOV entwickelten (CARRICO et al. 1986; MANSHIP et al.
1984; SCHUSTER et al. 1989). Um das Kontinuum der Organdysfunktion zu beschreiben und nicht nur den Endpunkt des Organversagens hervorzuheben, wurde die Bezeichnung MOV durch „Multiorgan Dysfunktions Syndrom“ (MODS) entsprechend der Konsensuskonferenz von 1991 der „Society of Critical Care Medicine“ und der „American College of Chest Physicians“ ersetzt (BONE 1992). Das MODS stellt noch heute - mehr als zwei Jahrzehnte nach der erstmaligen Beschreibung - die schwerwiegendste Komplikation bei Traumapatienten dar. Etwa 40 % schwerkranker Intensivpatienten entwickeln ein MODS, welches mit Mortalitätsraten von 70 % einhergeht und die führende Todesursache auf Intensivstationen darstellt (MANSHIP et al. 1984; TRAN et al. 1990; DEITCH 1992;
MARSHALL et al. 1995; RANGEL-FRAUSTO et al. 1995; SALVO et al. 1995).
Pathophysiologisch spielt nach neuen Erkenntnissen das Immunsystem beim MODS eine bedeutende Rolle. Es sind die eigenen endogenen Mediatoren der Immunabwehr, die zum sequentiellen Versagen multipler Organsysteme (Lunge, Leber, Intestinum, Niere) beitragen.
Exogene Faktoren scheinen untergeordnet zu sein (DEITCH 1992).
1.1 Die Rolle des Immunsystems bei der Pathogenese des SIRS und MODS
Die allgemeine Funktion des Immunsystems besteht darin, daß der Organismus gegen die Invasion ubiquitär vorkommender pathogener mikrobieller Agenzien verteidigt wird.
Das Immunsystem lässt sich funktionell in die angeborene Immunität (unspezifisch, Antigen- unabhängig) und erworbene Immunität (spezifisch, Antigen-abhängig) unterteilen (Tabelle 1.1). Beide funktionellen Einheiten bestehen aus einer Vielzahl von Molekülen (humorale Abwehr) und Zellen (zelluläre Abwehr). Wichtige humorale Systeme sind das Komplementsystem, die Immunglobuline (Antikörper), das Koagulationssystem, das Fibrinolysesystem, das Kallikrein-Kininsystem, Eicosanoide, Akut-Phase-Proteine und Proteasen. Zu den bedeutenden zellulären Systemen gehören die Granulozyten, Thrombozyten, Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten.
Einleitung 10
angeborene Immunität erworbene Immunität
humorale Faktoren
Fibrinolysesystem Kallikrein-Kininsystem Eicosanoide
Koagulationssystem Akut-Phase-Proteine Proteasen
Immunglobuline
zelluläre Faktoren
Monozyten Makrophagen Thrombozyten Granulozyten
B-Lymphozyten T-Lymphozyten
Tabelle 1.1: Wichtige funktionelle Einheiten des Immunsystems
Beim Eindringen mikrobieller Agenzien in den Organismus kommt es zu einer Aktivierung des Immunsystems, wobei die Stärke der Immunreaktion mit der Schwere der Infektion korreliert.
Bei der konsekutiven Inflammationsreaktion, welche das Ziel hat, die Agenzien zu eliminieren, interagieren die funktionellen Einheiten des Immunsystems (angeborene und erworbene Systeme) regulierend, so dass die Immunreaktion in bestimmten Grenzen bleibt und rechtzeitig beendet wird.
Gelingt es dem Immunsystem nicht, das pathogene Agens (Bakterien, Endotoxine) zu eliminieren (z.B. bei einer Sepsis), besteht die Gefahr einer persistierenden intensiven dysregulativen Aktivierung des Immunsystems, welche in dem klinischen Bild des septischen Schocks resultieren (BUDELMANN 1969; SCHUSTER et al. 1989) und letztendlich zu einem MODS führen kann.
Das systemische Entzündungsantwort Syndrom (Systemic Inflammatory Response Syndrome
= SIRS), das dem einer Ganzkörperentzündung gleicht, liegt definitionsgemäß dann vor, wenn zwei oder mehr der folgenden Parameter in entsprechender Weise pathologisch sind:
1.) Rektaltemperatur > 38°C oder < 36°C 2.) Herzfrequenz > 90 Schläge pro Minute
3.) Atemfrequenz > 20 Atemzüge pro Minute oder arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck < 4,3 kPa
4.) Leukozyten > 12000 pro mm2 oder < 4000 pro mm2 oder 10 % der Leukozyten bestehen aus unreifen Formen
Einleitung 11 Geht das SIRS mit einer nachgewiesenen generalisierten Infektion einher, wird von Sepsis gesprochen, welche bei einem gravierenden Verlauf die Hämodynamik beeinträchtigen kann (schwere Sepsis). Sind die Körperfunktionen nicht mehr im Stande, die Homöostase aufrecht zu erhalten, entsteht ein physiologisches Ungleichgewicht, das MODS (BONE 1992). Die Entstehung des SIRS kann pathophysiologisch in drei Phasen unterteilt werden: die lokale Immunantwort, die initiale systemische Immunantwort und die massive systemische Inflammation (BONE 1996; DAVIES u. HAGEN 1997).
In der ersten Phase werden lokal humorale und zelluläre Immunmediatoren als Folge einer normalen Immunantwort auf ein Trauma oder einen Infektionsnidus aktiviert. Bereits entstandene Gewebeschäden bleiben auf diese Weise lokal beschränkt und werden beseitigt (REGEL et al. 1989). Damit die proinflammatorische Immunantwort keinen negativen Effekt hervorruft, werden regulativ antiinflammatorische Mediatoren freigesetzt (DINARELLO et al. 1993; PLATZER et al. 1995). Bei Persistenz des Gewebeschadens und fortlaufender lokaler Immunreaktion werden Mediatoren und proteolytische Enzyme in die systemische Zirkulation freigesetzt, so daß eine Einwanderung peripherer immunkompetenter Zellen - vorwiegend neutrophile Granulozyten - erfolgt. Es werden Koagulationsfaktoren aktiviert.
Dieser Prozess der zweiten Phase endet erst mit Abklingen der Infektion bzw.
Wiederherstellung der normalen Immunantwort (BONE 1996; FUKUSHIMA et al. 1994).
Mißlingt die Wiederherstellung der Homöostase, wirkt in der dritten Phase die systemische Immunantwort destruktiv, und es resultiert die klinische Manifestation des SIRS (REGEL et al. 1991; BONE 1996).
Durch die progressive endotheliale Dysfunktion kommt es zu einer Erhöhung der mikrovaskulären Permeabilität mit konsekutiver Transsudation in das Interstitium und Bildung von Mikrothrombi, so daß eine Gewebsischämie auftreten kann (VAN GRIENSVEN et al. 1999; BARIE 1993; BARIE u. MULLINS 1988; IBBOSTON u. WALLACE 1989;
KREUZFELDER et al. 1988; LEWIS et al. 1990; LUCAS et al. 1991; NUYTINCK et al.
1988; PAPE et al. 1994; PETRAK et al. 1989; SEEKAMP u. WARD 1993a; STEPHENS et al. 1988, GANDO et al. 1996; SIGURDSSON et al. 1992). Kommt es im Verlauf zu einer teilweisen Wiederherstellung der Durchblutung, kann durch Sauerstoffradikale und die Induktion von Heat Shock Proteinen in dem Ischämiegebiet ein Reperfusionsschaden entstehen (CIPOLLE et al. 1993; RINALDO et al. 1990). Dadurch, daß die Dysregulation der vasodilatatorischen und vasokonstriktorischen Mechanismen eine ausgeprägte Vasodilatation
Einleitung 12 hervorruft, kommt es zu einer Zunahme der Transsudation (GOMEZ-JIMENEZ et al. 1995;
MIYAUCHI et al. 1990), welche wiederum in der funktionellen Dysfunktion eines oder mehrerer Organe enden kann (MODS). Klinisch imponieren die klassischen Entzündungszeichen (Rubor, Calor, Tumor, Dolor und Functio laesa). Gelingt es dem Körper nicht, die überschießende Inflammation zu regulieren, resultiert der Exitus letalis.
Auch besteht die Möglichkeit, daß eine antiinflammatorische Immunreaktion überschießen und zu einer Immunparalyse führen kann (KREMER et al. 1996; MILLS et al. 1989;
RANDOW et al. 1995; SYBRE et al. 1994). Diese immunologische Reaktion wird als
„Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome“ (CARS) bezeichnet (BONE 1996a;
BONE 1996b; BONE 1996d; DAVIES u. HAGEN 1997) und kann ebenfalls zu einem MODS führen.
Eine antiinflammatorische Aktivierung bedeutet jedoch nicht zwangsläufig die Inaktivierung der inflammatorischen Reaktion. Persistiert die inflammatorische Aktivität trotz aktivierter antiinflammatorischer Immunantwort, liegt ein sogenanntes „Mixed Antagonist Response Syndrome“ (MARS) vor (BONE 1996a; BONE 1996b; DAVIES u. HAGEN 1997). Auch dieses kann in einem MODS resultieren.
An SIRS oder MODS erkrankte Patienten sterben also nicht zwangsläufig an unkontrollierbaren Infektionen, sondern an ihrer eigenen dysregulierten Entzündungsantwort (VAN GRIENSVEN et al. 1999). Da bei gleichen Verletzungsschweregraden nur ein Teil der Patienten ein MODS entwickelt, müssen neben dem initialen Trauma noch weitere prädisponierende Faktoren zur Entwicklung eines MODS vorliegen (BERNARD et al. 1990;
ANDERSON u. SPRINGER 1991). Zu nennen sei hier der Zusammenhang zwischen sekundären pulmonalen Veränderungen und frakturbedingten Ischämien, welche durch Gefäßverletzungen hervorgerufen werden können. Dieser Zusammenhang wird besonders bei partiellen oder kompletten Ischämien nach offenen Frakturen beobachtet, welche ein erhöhtes Risiko für posttraumatische Komplikationen beinhalten (SÜDKAMP et al. 1989; AUF’M KOLK u. LETSCH 1996). Die entstandene Ischämie führt erst bei einer Reperfusion durch Einschwemmen von Proteasen, lysosomalen Enzymen, Arachidonsäuremetaboliten, Sauerstoffradikalen und aktivierten neutrophilen Granulozyten zu sekundären Organschäden, wobei die Pathologie der Schädigung ein einheitliches Muster aufweist (BERNARD et al.
1994; BURCHARDI 1987). Es wird also nicht nur das von der Ischämie betroffene Areal,
Einleitung 13 sondern auch distales Gewebe und Organe geschädigt. Dieser systemische Schaden erfolgt erst dann, wenn das ischämische Gebiet reperfundiert wird (SEEKAMP u. WARD 1993a).
Bei einer Ischämie mit anschließender Reperfusion kommt es häufig zu einer sekundären Organschädigung, unabhängig davon, welches topographische Gebiet der Ischämie ausgesetzt war. Pulmonale Schäden wurden nach Ischämie/Reperfusion der Extremitäten (BELKIN et al.
1989; GOLDMANN et al. 1992; SEEKAMP et al. 1993; SEEKAMP et al. 1994; SEEKAMP et al. 1993B; SEIBERT et al. 1993; WELBOURN et al. 1991a), der Leber (DUBAYO u.
CARLSON 1988) und genereller Ischämie beim hypovolämischen Schock beschrieben.
Ursächlich hierfür sind neutrophile Granulozyten und reaktive Sauerstoffradikale (BELKIN et al. 1989; FLAHERTY 1991; GOLDMANN et al. 1992; GRECH et al. 1994; KAZUI et al.
1994; KLAUSNER et al. 1988; SEEKAMP u. WARD 1993A; SEIBERT et al. 1993;
WELBOURN et al. 1991A; WELBOURN et al. 1991B; WELBOURN et al. 1990; YUKOTA et al. 1989, INAUEN et al. 1990; ZIMMERMANN et al. 1990), welche zum Teil in den neutrophilen Granulozyten gebildet werden oder in den chemischen Reaktionen entstehen, welche in dem reperfundierten Areal ablaufen (KORTHUIS et al. 1989; PARKS u.
GRANGER 1986). Durch Interaktionen mit Desoxyribonukleinsäuren können Sauerstoffradikale DNA-Strangbrüche hervorrufen (BIELSKI u. SHIUE 1979; BURGER et al. 1980). Ferner führen Reaktionen zwischen Sauerstoffradikalen mit ungesättigten Fettsäuren durch Lipidperoxidationen zu Zellmembranschädigungen, welche zum Zelluntergang führen können (AUST u. SVINGEN 1982; YOUNES et al. 1987).
In der Pathogenese des MODS spielen als prädisponierende Faktoren auch sogenannte „one- hit“, „two-hit“ oder „multiple-hit“ Konzepte eine wichtige Rolle (MEAKINS 1990). Der Ausdruck „two-hit“ wird für das biologische Phänomen verwendet, bei dem eine initiale Traumatisierung mit Aktivierung und Freisetzung von immunologischen Mediatorsystemen stattfindet. Eine weitere Schädigung führt zu einer zusätzlichen Mediatorenfreisetzung. Durch die initiale Hypoxie kommt es beispielsweise beim hämorrhagischen Schock zur Aktivierung der zellulären und humoralen Immunantwort (first-hit). Jede weitere Traumatisierung wie Operationstrauma, Weichteilschäden und Infektion (second- bzw. multiple hit) kann nun zu einer überschießenden Reaktion der bereits aktivierten Mediatorsysteme führen und so ein SIRS oder MODS auslösen (DEITCH 1992).
Einleitung 14 In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die bakterielle Translokation zu nennen. Bakterielle Translokation ist definiert als Verlust der Darmbarriere und die folgende systemische Ausbreitung von Bakterien und Endotoxin (BERG 1992). Verhütet wird sie unter normalen Umständen durch folgende drei Faktoren.
Die mechanische Schranke, durch das Schleimhautepithel selbst gebildet (apikale Zellmembran der Enterozyten zusammen mit den die Interzellularspalten nach luminal abdichtenden „tight junctions“), stellt einen dieser Faktoren dar. Die humorale und zelluläre Immunabwehr im Darm, auch als GALT bezeichnet („gut associated lymphoid tissue“), welche neben intraepithelialen Lymphozyten aus in der Lamina propria lokalisierten Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen und Granulozyten sowie Plasmazellen besteht, bildet den nächsten Faktor. Die den Mukus kolonisierende ‚normale‘ obligat anaerobe Darmflora, die ein Überwuchern durch anaerobe, fakultativ pathogene Organismen verhindert, stellt den letzten Faktor dar.
Durch das Versagen einer oder mehrere Komponenten dieses ‚Mukosa-Abwehr- Mechanismus‘ kann die Translokation gefördert werden (FINK 1991). Die Bedeutung der Translokation wird unterschiedlich beurteilt, jedoch kann sie nach SCHUSTER (1996) eine gute Erklärung für die Ähnlichkeit im Ablauf des Mediator induzierten MODS bei primär bakterieller Infektion mit gramnegativen Keimen und primär nichtinfektiöser Erkrankung wie dem Polytrauma liefern. REDFORS et al. (1984) beschrieben die mesenteriale Minderperfusion als wichtigste Ursache am Versagen der mechanischen Barrierefunktion.
Im Rahmen der Notfallmedizin kommt dem große Bedeutung zu. So kann die Minderperfusion der Splanchnikusorgane aufgrund der im Schock einsetzenden Kreislaufzentralisation ein sehr viel größeres Ausmaß erreichen, als es an der Reduktion des systemischen Blutdrucks ersichtlich ist. Bereits ein mäßiger Abfall der viszeralen Perfusion führt, bedingt durch das Gegenstromprinzip der Kapillaren in den Schleimhautvilli, zu ausgeprägter Hypoxie der Enterozyten an den Villusspitzen.
Diese Theorie ist eine der wichtigsten im Bereich der „two-hit“-Konzepte (DEITCH et al.
1990a, 1990b u. 1992).
Einleitung 15 1.2 Die Rolle von neutrophilen Granulozyten bei der Pathogenese des SIRS und MODS
Die Tatsache, daß in unterschiedlichen Tiermodellen eine Neutropenie einen systemischen Ischämie/Reperfusionschaden signifikant verhindern konnte, zeigt die Relevanz der neutrophilen Granulozyten bei der Pathogenese des auf diese Weise entstehenden Gewebeschadens (CARDEN et al. 1990; HERNANDEZ et al. 1987; ROMSON et al. 1983).
Neben den genannten neutrophilen Granulozyten spielen Mediatoren beim Prozess der Ischämie/Reperfusion eine Rolle. Zum Beispiel konnten nach Ischämie/Reperfusionsschaden erhöhte Spiegel von Thromboxan gemessen werden (KLAUSNER et al. 1989), deren Bedeutung jedoch gering erscheint, da durch Inhibition der Bildung dieser Moleküle mit Indomethacin keine Verringerung der Neutrophilenakkumulation im pulmonalen Gewebe nachgewiesen werden konnte (PUNCH et al. 1991). Ebenfalls erhöht bei einem Ischämie/
Reperfusionsschaden ist das Leukotrien B4 (KLAUSNER et al. 1988), welches zum einen als Chemotaxin auf neutrophile Granulozyten wirkt (PALMBLAD et al. 1981) und zum zweiten die Freisetzung von Wasserstoffperoxidradikalen aus den neutrophilen Granulozyten bewirkt (GOLDMANN et al. 1990), so daß seine Wirkung indirekt über die Aktivierung neutrophiler Granulozyten zu sehen ist und somit die zentrale Rolle dieser Zellen bei dem Pathomechanismus hervorhebt.
Die neutrophilen Granulozyten als wichtiger Bestandteil des unspezifischen zellulären Immunsystems (GRISWOLD u. MAIER 1988) werden durch Chemotaxis auf die mikrobiellen Organismen aufmerksam gemacht. Die Adhäsion an und die Migration der neutrophilen Granulozyten durch das Endothel wird durch mehrere Phasen gekennzeichnet.
Hier ist das „Rolling“, das „Attachement“ und die „Diapedesis“, welche jeweils mit unterschiedlichen Adhäsionsmolekülen zusammenhängen, zu nennen (eine genauere Beschreibung in Sektion 1.3). Die Migration verläuft über einen chemotaktischen Gradienten an den Fokus, wo die mikrobiellen Organismen phagozytiert und lysiert werden. Bei der Lyse körperfremder Stoffe spielen die in den Granulae (Peroxidase positive und Peroxidase negative Granula) enthaltenen Substanzen wie Myeloperoxidase, Elastase, Lysozym, ß- Glycerophosphatase, Laktoferrin, Prokollagenase und alkalische Phosphatase eine wichtige Rolle (ACKERMAN 1971; BAINTON u. FARQUHAR 1966; BAINTON et al. 1971;
SCOTT u. HORN 1970). Auch bei der Entstehung eines Gewebeschadens nach Ischämie/Reperfusion nehmen diese lysosomalen Produkte eine wichtige Funktion ein, so daß die neutrophilen Granulozyten zu den Schlüsselzellen des Ischämie/Reperfusionsschadens zählen (FUJISHIMA u. AIKAWA 1995; KORTHUIS et al. 1988; VEDDER et al. 1989).
Einleitung 16 Als initialer Schritt des Pathomechanismus steht also die Chemotaxis, ein chemischer Stimulus, der die Wanderungsrichtung phagozytierender Zellen in Abhängigkeit von einem Konzentrationsgradienten der reizauslösenden Substanz bestimmt, welche nicht obligat ein mikrobieller Organismus sein muß (BAUER u. MARZI 1994; BILLING 1993; WARD u.
MULLIGAN 1991). Zu den potenten Chemotaxinen gehören IL-1, IL-6, TNF-α, Endotoxin, Sauerstoffradikale, Komplementfaktoren C3a und C5a, Leukotriene (z.B. LTB4), Fragment D der Fibrinolyse und Plättchenaktivierender Faktor (DEMLING 1985; KINDT et al. 1991;
WARREN et al. 1989; WEIGELT et al. 1988). Ein großer Teil wird direkt im Gewebe nach Ischämie in der Reperfusionsphase von Endothelzellen und Gewebsmakrophagen gebildet.
Weitere Aktivatoren neutrophiler Granulozyten sind Immunkomplexe, Gerinnungsfaktoren, das Kallikrein-Kininsystem, Granulozyt-Monozyt-Kolonieformender Faktor, Prostaglandine und Fragmente des geschädigten Gewebes wie zum Beispiel Kollagenfragmente (CERASOLI et al. 1990; JONAS et al. 1991; MALIK 1985; NEUHOF 1991; WARREN 1991; WARREN et al. 1989; WEIGELT et al. 1988; WESTABY 1988).
Diese Aktivierung führt zu einer Hochregulation der Adhäsionsmoleküle (siehe Sektion 1.3) und die neutrophilen Granulozyten adhärieren am kapillaren Endothel. Es kommt zu einer vermehrten Produktion und Freisetzung der bereits oben genannten lysosomalen Produkte und Sauerstoffradikale, die morphologisch ein sternförmiges Ausbreiten der Endothelzelle (Zellspreading) verursachen, was eine verminderte Verformbarkeit der Zellen zur Folge hat (BAUER u. MARZI 1994; HOOVER et al. 1987; NOGARE 1989). Durch das Zellspreading kommt es zu einer Erhöhung der endothelialen Permeabilität, es können somit schädigende Mediatoren einschließlich Zellen die Endothelbarriere einfacher passieren. Eine Endothelpermeabilitätserhöhung kann auch von inflammatorischen Mediatoren verursacht werden (VAN GRIENSVEN et al. 1999; MARUO et al. 1992).
1.3 Die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Pathogenese des SIRS und MODS
Die Adhäsion als entscheidender Schritt der Migration (FURIE u. MCHUGH 1989; FURIE et al. 1987; HARLAN 1987) wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt. Es können drei Gruppen von Adhäsionsmolekülen differenziert werden: die Selektine, die Integrine und die Immunglobulin-ähnlichen. Diese werden sowohl von den Endothelzellen als auch von den neutrophilen Granulozyten exprimiert (KUROSE et al. 1994), so daß es zu einer hochaffinen
Einleitung 17 spezifischen Ligand-Rezeptor-Bindung kommen kann und eine selektive Akkumulation neutrophiler Granulozyten in dem inflammatorischen bzw. reperfundierten Gebiet resultiert.
Bei dieser Reaktion nimmt das von den neutrophilen Granulozyten exprimierte L-Selektin eine wichtige Rolle ein, da es neben der initialen Adhäsionsfunktion zwischen neutrophilen Granulozyten und Endothel auch eine Signalfunktion in die neutrophilen Granulozyten hinein besitzt (SPERTINI et al. 1991b; RICHTER u. ZETTERBERG 1994; SIMON et al. 1995;
WADDEL et al. 1994; WADDEL et al. 1995). Beim sogenannten „Tethering“ und „Rolling“
der neutrophilen Granulozyten an den Endothelzellen spielt es eine wichtige Rolle (LEY et al.
1991). Bei niedriger Flussgeschwindigkeit entstehen zwischen neutrophilen Granulozyten und Endothel Scherkräfte, wobei es zunächst zu einer rein physikalischen Adhäsivität kommt, die dann durch das neutrophile L-Selektin und das endotheliale P- und E-Selektin in eine transiente Adhäsion überführt wird (ANDERSON u. SPRINGER 1987; BUTCHER 1991;
SPRINGER 1990).
Als nächstes werden die neutrophilen Granulozyten auf den Endothelzellen „attached“ oder abgestoppt mittels eines stabilen Zell-Zellkontaktes über die Integrine. Die Integrinmoleküle bestehen aus mehren Untereinheiten, wobei die β2 Untereinheit für die Adhärenz der neutrophilen Granulozyten besonders wichtig ist.
Aus der Gruppe der Immunglobulin-ähnlichen Adhäsionsmoleküle ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) das wichtigste (SPRINGER 1990). Das ICAM-1 konnte als endothelialer Ligand für die β2-Integrine identifiziert werden (SMITH et al. 1988; SMITH et al. 1989).
1.3.1 Das L-Selektin
Das L-Selektin kommt ausschließlich auf hämatopoetischen Zellen vor (GALLATIN et al.
1983; TEDDER et al. 1990; JUTILA et al. 1989). Bei den neutrophilen Granulozyten ist es auf den Mikrovilli lokalisiert, was bei dem Adhäsionsvorgang, also dem Kontakt des L- Selektins mit dem endothelialen Liganden, vorteilhaft ist (TEDDER et al. 1995a).
L-Selektin gehört zur Familie der Selektine, die von evolutionär konservierten Genen kodiert werden (COLLINS et al. 1991; JOHNSTON et al. 1990; ORD et al. 1990; TEDDER et al.
Einleitung 18 1989; WATSON et al. 1990). Es besitzt vier unterschiedliche extrazelluläre Domänen (aminoterminale kalziumabhängige Lektindomäne, epidermale Wachstumsfaktor-ähnliche Domäne und zwei short consensus repeat Einheiten), welche homolog mit Domänen von komplementbindenden Proteinen sind (TEDDER et al. 1995a). Die Deletion jeder einzelnen Domäne schränkt die Bindungskapazität von neutrophilen Granulozyten an Endothelzellen ein, was die wichtige Rolle dieser Domänen bei der Zelladhäsion zeigt (TEDDER et al.
1995a; KANSAS et al. 1994). Neben P- und E-Selektin auf den Endothelzellen kommen als mögliche Liganden des L-Selektins auch Kohlenhydrate wie das sialysierte Lewisx-Antigen, CD 34, fucosylatiertes Oligosaccharid und ein sulfatiertes 50 kD Glykoprotein in Betracht (BAUMHUETER et al. 1993; HELFET et al. 1990; LASKY et al. 992; PHILLIPS et al. 1990;
PICKER et al. 1991). Da diese Kohlenhydrate in den verschiedenen Geweben differenziert exprimiert werden, resultieren unterschiedliche Affinitäten für das L-Selektin und dementsprechend auch für die neutrophilen Granulozyten.
Außer den oben erwähnten besitzt L-Selektin zwei weitere Domänen: eine transmembranale Domäne und eine zytoplasmatische Domäne. Letztere weist eine Tyrosinkinase-Aktivität auf, durch die die Signaltransduktoren Ras, Jun N-Terminal Kinase und Mitogen-activated- Protein-Kinase aktiviert werden können (BRENNER et al. 1996; BRENNER et al. 1997;
WADDEL et al. 1995).
Nach Aktivierung der neutrophilen Granulozyten kommt es zu einer Metalloproteinase vermittelten proteolytischen Spaltung des extrazellulären Anteils des L-Selektins, dem sogenannten „Shedding“ (GRIFFIN et al. 1990; JUNG u. DAILEY 1990; JUTILA et al. 1990;
KISHIMOTO 1989; KISHIMOTO et al. 1990; SPERTINI et al. 1991a; TEDDER et al. 1990), wobei bei neutrophilen Granulozyten ein 80 bis 105 kD schweres Fragment, bei Lymphozyten ein 62 kD Fragment im Serum quantitativ detektiert werden kann (JUNG u.
DAILEY 1990; KISHIMOTO 1989; SCHLEIFFENBAUM et al. 1992; SPERTINI et al.
1991a). Diese nachweisbaren Fragmente werden als lösliches L-Selektin bezeichnet. Das Aktivitätsniveau von neutrophilen Granulozyten korreliert mit dem löslichen L-Selektin (MAEKAWA et al. 1998). Der Spiegel an löslichem L-Selektin zeigt ein Maximum sechs Stunden nach initialem Trauma (VAN GRIENSVEN et al. 1999; MAEKAWA et al. 1998).
In vitro können Hydroxamat-basierte Metalloproteinase-Inhibitoren das Shedding von L- Selektin herabsetzen (BENNETT et al. 1996; WALCHECK et al. 1996). Analog dazu sind die
Einleitung 19 Metalloproteinasen, Kollagenase und Stromelysin in der Lage, die Anzahl L-Selektin positiver Zellen zu verringern (PREECE et al. 1996). Es konnte gezeigt werden, daß eine Inhibition von L-Selektin mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen Ischämie/Reperfusionsschäden protektiv wirkt (RAMAMOORTHY et al. 1996; PALMA- VARGAS et al. 1997), was vermutlich über eine verminderte Migration zu erklären ist (TEDDER et al. 1995b). Allerdings ist hier bei wiederholter Gabe zu beachten, daß es zu einer Anti-Antikörperbildung kommen kann.
1.4 Die Rolle von Zytokinen bei der Pathogenese des SIRS und MODS
Die Aktivität der neutrophilen Granulozyten und die Expression der Adhäsionsmoleküle steht in engem Zusammenhang mit der Freisetzung von Zytokinen (GAMBLE et al. 1985;
KUIJPERS et al. 1992; NATHAN et al. 1989; POHLMAN et al. 1986). Wie im ersten Abschnitt bereits erwähnt, interagieren pro- und antiinflammatorische Zytokine regulierend, so daß die inflammatorische Reaktion kontrolliert verläuft und in ihrem Ausmaß temporär und quantitativ limitiert bleibt, um regenerative Prozesse zu ermöglichen. Hierbei kommt es zunächst zur Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-6. Im weiteren Verlauf werden durch negative Rückkopplung verschiedene Zytokine ausgeschüttet (DINARELLO 1996). Hierzu zählen das IL-10, IL-4 und IL-13. Neben diesen genannten gibt es noch eine Vielzahl weiterer Zytokine, welche in dem hochdifferenzierten Zusammenspiel von pro- und antiinflammatorischer Wirkung eine Rolle spielen. Bei einer limitierten Immunreaktion ist nach wenigen Tagen am Plasmazytokinspiegel der Übergang von der inflammatorischen Primärphase in die kompensatorische hypoinflammatorische Sekundärphase zu beobachten. Bei diesem Regelmechanismus kann es aus noch ungeklärter Ursache sowohl zu überschießenden pro- als auch antiinflammatorischen Reaktionsniveaus kommen und zu einem SIRS, MODS, MARS oder CARS (s.o.) führen (SEEKAMP et al.
1998; BONE 1996a; BONE 1996b; BONE 1996d; DAVIES u. HAGEN 1997; KREMER et al. 1996; MILLS et al. 1989; RANDOW et al. 1995; SYRBE et al. 1994).
1.4.1 Das Zytokin Interleukin-6
IL-6 ist ein multifunktionaler Immunmediator, der eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr und Hämatopoese spielt (AKIRA et al. 1993; HIRANO 1994; VAN SNICK 1990;
KISHIMOTO 1992) und von einer Vielzahl von Zellen wie T-Lymphozyten, B-
Einleitung 20 Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten, Hepatozyten, Astrozyten, Endothelzellen, Mesangiumzellen, Osteoblasten, Sertolizellen sowie in Karzinomen, Sarkomen, Myelomen und Melanomen exprimiert wird. IL-6 ist ein Polypeptid mit einer Länge von 212 Aminosäuren. Die genetische Sequenz, welche dieses Protein kodiert, konnte 1986 entschlüsselt werden (HIRANO et al. 1986). Das bioaktive Protein mit einer Länge von 184 Aminosäuren entsteht erst nach Abspaltung einer aus 28 Aminosäuren bestehenden hydrophoben Signalsequenz. Aufgrund unterschiedlicher Glykosylierungen und Phosphorylierungen an Aminosäureposition 73 und 172 kann das Molekulargewicht von IL-6 zwischen 21,5 und 28 kD liegen.
Die Produktion von IL-6 kann über unterschiedliche Stimuli wie Mitogene, Antigene, Lipopolysaccharide, Zytokine (IL-1 und TNF) und Viren induziert werden (AARDEN et al.
1985; BAUER et al. 1988; NAVARO et al. 1998; WAAGE et al. 1990). Eine Inhibition der IL-6 Expression erfolgt durch IL-4, IL-10 und IL-13. Erhöhte IL-6 Serum-Spiegel werden bei verschiedenen pathologischen Prozesssen gemessen. Hierzu zählen bakterielle und virale Infektionen, Sepsis, Traumen, Autoimmunerkrankungen und Malignome (AKIRA et al. 1993;
HIRANO 1994; VAN SNICK 1990; KISHIMOTO 1992). Daher spielt es als Prädiktor für das Outcome bei septischem Schock oder SIRS eine wichtige Rolle (SHALABY et al. 1989a;
SHALABY et al. 1989b) und wird dementsprechend an vielen intensivmedizinischen Kliniken als Routineparameter bestimmt (CALANDRA et al. 1991; HACK et al. 1989; et al.
HELFGOTT 1989; TILMANN STEINMETZ et al. 1995; WAAGE et al. 1989; ZABEL et al.
1989), wobei eine anfangs hohe Plasmakonzentration ab dem Tag der stationären Aufnahme auf eine schlechte Prognose hinweist (PAPE et al. 1999; HACK et al. 1989; THIJS u. HACK 1995; WAAGE et al. 1989). Es besteht eine Korrelation zwischen der IL-6 Plasmakonzentration am ersten Tag der Aufnahme und dem Score des "Mortality Probability Modell II" (LEMESHOW et al. 1993) und am dritten bis zum siebten Tag mit dem "Apache III" (KNAUS et al. 1985; KNAUS et al. 1981). Patienten, welche ein SIRS überlebten, zeigten niedrigere IL-6 Niveaus (TERREGINO et al. 1997). Kinder mit Sepsis und hohen IL- 6 Werten entwickeln häufiger ein MODS als Kinder ohne Steigerung der IL-6 Plasmakonzentration.
IL-6 ist in der Lage, in vitro die Endothelpermeabilität dosis- und zeitabhängig zu erhöhen.
Nach Zugabe eines spezifischen Antikörpers gegen IL-6 war diese Reaktion reversibel (VAN GRIENSVEN 1999; MARCUS et al. 1996; MARUO et al. 1992; ROYALL et al. 1989).
Einleitung 21 1.4.2 Das antiinflammatorische Zytokin Interleukin-10
IL-10 ist ein Immunmediator, der eine wichtige Rolle bei der Regulation inflammatorischer Prozesse spielt. So ist IL-10 in der Lage, die Produktion von IL-1, TNF, Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), IL-6, IL-8, IL-12 und IFN-γ bei aktivierten Th1-Zellen, NK-Zellen und Monozyten/Makrophagen zu inhibieren.
Besonders IFN-γ wird durch IL-10 stark gehemmt. Nach Untersuchungen von FIORENTINO et al. (1991) und ENK (1993) geschieht die Wirkung von IL-10 auf die T-Zell-(Th1-) Zytokinsekretion wahrscheinlich nicht direkt, sondern indirekt über die Hemmung der Makrophagenfunktion (Antigenpräsentation und Sekretion proinflammatorischer Zytokine).
Ferner kann IL-10 die zytotoxische Aktivität von Makrophagen herabsetzen und die Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten, Mastzellen und T-Lymphozyten induzieren (MOORE et al. 1993; FIORENTINO et al. 1989; MOSMAN 1994).
Es wird von einer Reihe unterschiedlicher Zellen exprimiert. Zu ihnen gehören aktivierte Th2- Zellen, fetale Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Keratinozyten, B-Lymphozyten und Gliazellen (MOORE et al. 1993; MOSMAN 1994). Murines IL-10 ist ein Polypeptid mit einer Länge von 178 Aminosäuren. Die genetische Sequenz, welche dieses Protein kodiert, konnte entschlüsselt werden. Bezüglich der Aminosäuresequenz liegt eine 73%ige Homologie zwischen murinem und humanem IL-10 vor. Das bioaktive Protein mit einer Länge von 160 Aminosäuren entsteht erst nach Abspaltung einer hydrophoben Precursorsignalsequenz (TAKEBE et al. 1988). Erhöhte Werte finden sich nach Traumen bzw. operativen Eingriffen.
1.5 Möglichkeiten der Prävention und Therapie des SIRS und MODS
Bisher gibt es keine ausreichend wirksame Therapie des SIRS und MODS. Zur Verringerung der Mortalität und der Verbesserung der Prognose des SIRS und MODS existieren jedoch unterschiedliche, nicht ausreichend effektive Präventions- und Therapieansätze.
Einer dieser Therapieansätze ist die selektive digestive Dekontamination zur Befreiung des oberen Intestinaltraktes von gramnegativen Bakterien und anderen potentiell pathogenen Mikroorganismen durch topische und parenterale antibiotische Therapien. Unter dieser Therapie kam es zwar zu einer Verminderung der nosokomialen Infektionen; Inzidenz und
Einleitung 22 Mortalität des MODS konnten unter diesem Regime aber nicht gesenkt werden (GASTINNE et al. 1992; CERRA et al. 1992). Auch Versuche einer Anti-Endotoxin-Therapie mit Antiseren, hyperimmunem polyklonalem Immunglobulin, monoklonalen IgM-Antikörpern gegen den Kern des LPS oder gegen die Lipid-A-Region des Endotoxinmoleküls waren ohne nennenswerten Erfolg (MANTHOUS et al. 1993; ZANETTI et al. 1993).
Spezifische immunsupprimierende Therapien gegen IL-1, Thrombozyten-aggregierenden Faktor oder TNF-α mittels monoklonaler Antikörper verliefen nicht zufriedenstellend und könnten sogar einen negativen Effekt durch Beeinträchtigung der Immunantwort hervorrufen (DINARELLO et al. 1993).
Kontroverse Meinungen gibt es über die Durchführung einer kontinuierlichen Hämofiltration bei SIRS- bzw. MODS-Patienten, um die Konzentration von Endotoxinen und Immunmediatoren (speziell TNF-α, IL-1 und IL-6) im Plasma zu verringern und den Sauerstoffpartialdruck zu verbessern (HIRASAWA et al. 1996; KODAMA et al. 1995).
Andere Autoren sehen in der Durchführung der Hämofiltration keine Erfolge zur Reduktion der Immunmediatoren, sondern vielmehr die Gefahr einer zusätzlichen Aktivierung von Leukozyten (SCHETZ et al. 1995).
Therapien mit unterschiedlichen Antioxidantien wie Eisenchelatbildner, Katalase, Superoxid- Dismutase, Allopurinol und N-Acetylcystein zur Reduktion freier Radikale brachten keine deutlichen Erfolge (SCHILLER et al. 1993). Die Anwendung von Glucan als Immunmodulator und Antithrombin III erbrachten positive Ergebnisse (BABINEAU 1994 u.
1999; YU u. TOMASA 1993).
Die symptomatische Prävention und Therapie des MODS in Form adäquater Notfalltherapie, Sicherung des Gasaustausches, ausreichender Volumensubstitution und Substitution von Erythrozytenkonzentraten und Verabreichung vasopressiver Substanzen, um eine ausreichende Gewebeperfusion aufrecht zu erhalten, bleiben aufgrund fehlender suffizienter und gezielter Therapieansätze weiterhin Mittel der ersten Wahl. Morbidität und Mortalität können unter diesen Maßnahmen jedoch nicht gesenkt werden (VINCENT 1996).
Einleitung 23 Ein möglicher Therapieansatz, in das pathogenetische Geschehen bei der Entwicklung des SIRS und MODS einzugreifen, könnte die selektive Inhibition von Adhäsionsmolekülen sein, da diese einen maßgeblichen Einfluß bei der Neutrophilenmigration haben. Die daraus resultierende, oben geschilderte Immunreaktion und die damit verbundenen Organschäden könnten somit eventuell verhindert werden.
Eine Therapie mit monoklonalen Antikörpern gegen Integrin-Adhäsionsmoleküle neutrophiler Granulozyten (Anti-CD18, Anti-CD11b) schienen im experimentellen Modell erfolgsversprechend (WINN et al. 1993; TALBOTT et al. 1994; BEATTY et al. 1984;
GASIC et al. 1991; ARFORS et al. 1987). In diesem Zusammenhang ist ebenfalls eine selektive Inhibition von L-Selektin vorstellbar, welche für das „Rolling“ der neutrophilen Granulozyten an den Endothelzellen verantwortlich ist (BARGATZE et al. 1994). Hier konnten bereits mit den monoklonalen Antikörpern EL-246 (VAN GRIENSVEN 1999), DREG-200 (MA et al. 1993) und CY-1747 (RUBIO-AVILLA et al. 1997) gute Erfolge erzielt werden, wobei allerdings bei mehrfacher Applikation dieses monoklonalen Antikörpers eine Anti-Antikörperreaktion auftreten kann. Eine längerfristige Behandlung eines Patienten mit einem monoklonalen Antikörper über mehrere Tage oder eine wiederholte Applikation bei Auftreten von Organfunktionsstörungen im weiteren intensivstationären Verlauf wäre wahrscheinlich nicht mehr effektiv, sondern würde den Patienten eventuell zusätzlich belasten. Außerdem besteht die Gefahr einer allergischen Reaktion auf das Fremdeiweiß.
Aus diesem Grund ist es von Vorteil, Substanzen einzusetzen, welche L-Selektin inhibieren, jedoch zu keiner Anti-Antikörperreaktion führen können und eine geringere allergene Wirkung entfalten. In Betracht kommen niedermolekulare Substanzen auf Basis der sialyl LewisX ähnlichen Oligosaccharide. Denkbar ist hier der Einsatz von Fucoidin.
Einleitung 24
Abb. 1.1: Struktur eines Fucoidinmoleküls (Ausschnitt)
Die Hauptkette entsteht durch die Verbindung von C-Atomen auf Position 1 und 3. Desweiteren können Extragruppen an Position 4 gekoppelt werden, wie z.B. SO3-. Eine Verzweigung findet bei jedem 3. Fucosemolekül an Position 2 statt.
Fucoidin ist ein inhomogenes Proteoglykan-ähnliches Polysaccharid mit variierendem Molekulargewicht, welches sich quantitativ hauptsächlich aus Fucose und Sulfat mit unterschiedlichen Anteilen von Uronsäure, Galactose, Mannose und Xylose zusammensetzt.
Es konnte erstmals 1950 aus der braunen Seealge Fucus vesiculosus isoliert werden (PERCIVAL u. ROSS 1950) und besitzt unterschiedliche biologische Aktivitäten. Hierzu gehört die antikoagulatorische Aktivität (NISHINO et al. 1989; GRAUFFEL et al. 1989;
CHURCH et al. 1989) und die antivirale Aktivität gegen das humane immunodeficiency virus (SUGAWARA et al. 1989), Herpesviren und Zytomegalieviren (BABA et al. 1988). Neben diesen Eigenschaften kann Fucoidin die Selektin-vermittelte Adhäsion von neutrophilen Granulozyten am Gefäßendothel inhibieren (PATANKAR et al. 1993).
Ziel dieser Arbeit ist es, basierend auf den bekannten oben geschilderten Pathomechanismen, den Einfluß von Fucoidin auf die Neutrophilenmigration und die Entwicklung eines MODS im „two-hit“ Mausmodell zu beschreiben. Als initiales Trauma (first hit) wird durch Ligatur der Aorta abdominalis eine Ischämie der unteren Extremitäten induziert. Nach Lösen der Ligatur nach einem definierten Zeitraum erfolgt die Reperfusion der ischämischen Gebiete.
O H
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O H
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C H3
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O O H H
O
O H H
C H3
Einleitung 25 Anschließend wird eine caecale Ligatur und Punktion mit daraus resultierender Peritonitis (second hit) durchgeführt.
Es sollen verschiedene Plasma- und Gewebeparameter zur Beschreibung der Neutrophilenaktivität, der Immunaktivierung und des Endothelschadens quantitativ untersucht werden. Außerdem erfolgt zur Dokumentation der entstandenen Organschädigung eine histologische Untersuchung von Leber und Lunge.
26
2. Fragestellung
Aus der Einleitung dieser Studie mit dem dargestellten Literaturstudium geht hervor, welch komplexer Vorgang eine Ischämie-Reperfusion mit caecaler Ligatur und Punktion darstellt.
Als wichtigste Komponenten im Ischämie-Reperfusionskomplex können die neutrophilen Granulozyten, Endothelzellen und Zytokine angesehen werden. Die Brücke zwischen neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen bilden die Zytokine, deren Interaktion über L- Selektin vermittelt wird. Diese Prozesse während einer Ischämie-Reperfusion der unteren Extremitäten führen im Verlauf zu distalen Organschäden, wobei als erstes zumeist die Lunge betroffen ist. Bei dieser Interaktion migrieren die neutrophilen Granulozyten in das Lungengewebe und die Permeabilität des Endothelzellverbandes wird beeinflußt. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des Einflusses des sialyl Lewisx ähnlichen Polysaccharids Fucoidin auf dieses Geschehen.
In diesem Zusammenhang soll die Beantwortung folgender Fragestellungen nach dem Ablauf dieser Studie versucht werden:
• Wird die Migration von neutrophilen Granulozyten ins Gewebe durch Fucoidin gehemmt?
• Kann Fucoidin über eine Hemmung der Adhärenz der neutrophilen Granulozyten an den Endothelzellen zu einer Reduzierung von sekundären Organschäden nach Ischämie Reperfusion und caecaler Ligatur und Punktion führen?
• Ist Fucoidin in der Lage, die Letalität nach Ischämie-Reperfusion und caecaler Ligatur und Punktion zu verringern?
27
3. Material
3.1 Chemikalien und Medikamente
Ringer-Lactat-Lösung, Braun, Melsungen Natriumchloridlösung, Braun, Melsungen Ketamin-Lösung, WDT, Garbsen
Rompun, Bayer, Leverkusen
Fucoidin, Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen Liquemin, Roche, Grenzach-Wyhlen
Fetales Kälberserum, Seromed, Berlin
Desinfektionsmittel, Softasept, Braun, Melsungen Diethylether, Rüsch Hospital, Böblingen
Stickstoff, Linde, Hannover
Allgemeine Laborchemikalien (u.a. verschiedene Salze für Pufferlösungen) wurden in handelsüblicher p.A.-Qualität bezogen.
3.2 Geräte
Feinwaage A 120 S, Sartorius, Göttingen Kühlzentrifuge, Heraeus, Hanau
Mikroskop, Zeiss, Jena
pH-Meter 761 Calimatic, Knick, Berlin
Photometer für Mikrotiterplatten MR 5000, Dynatech Laboratories, Denkendorf Rüttler, Heidolph, über: Jürgens, Hannover
Tischzentrifuge, Heraeus, Hanau
Ultraschallgerät Labsonic 1510, Braun, Melsungen Ultraturrax, Janke und Kunkel, Staufen
Material 28 Allgemeines Operationsmaterial wie Klingen, Pinzetten und Klemmen wurden aus dem
zentralen Lager der MHH bezogen.
3.3 Verbrauchsmaterial
Combitips, 0,5; 1,25; 2,5; 5,0; 12,5 ml, Eppendorf, Hamburg Einmal-Handschuhe, unsteril, N.U.Baxter S.A., Lessines, Belgien Kryoröhrchen mit Schraubdeckel, Nunc, Wiesbaden
Mikrotiterplatten, 96 wells, Flachboden, Nunc, Wiesbaden Pipettenspitzen, Sarstedt, Nümbrecht
Reaktionsgefäße, 1,5 ml, Sarstedt, Nümbrecht
1 ml Spritzen, mit Kanülen (27 G), Braun, Melsungen Zentrifugenröhrchen, 50 ml, Greiner GmbH, Nürtingen Faden Prolene 3-0, Ethicon, Norderstedt
Seide 3-0, Braun, Melsungen
Kompressen, 10 x 20 cm, Lohmann, Neuwied Rasierklingen, Wilkinson Sword, Solingen
IL-6 und IL-10 ELISA-Kits, R&D Systems, Minneapolis, USA
3.4 Versuchstiere
NMRI-Mäuse, Zentrales Tierlaboratorium der MHH
29
4. Methoden
4.1 In vivo Studie
4.1.1 Versuchstiere
Die Studie wurde an 91 männlichen NMRI Mäusen (Zentrales Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover) durchgeführt. Das mittlere Körpergewicht betrug 28 g ± 4 g und das durchschnittliche Alter 6-8 Wochen.
Die Mäuse wurden bei normalem circadianen Rhythmus mit Tageslicht in Käfigen mit einer Gruppengröße von bis zu 10 Tieren bei 22 ± 2°C gehalten. Futter und Wasser stand ihnen ad libitum zur Verfügung. Die Versuchsdurchführung erfolgte in den Räumen des Forschungsbereich der Unfallchirurgischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover.
4.1.2 Versuchstiergruppen
Die 91 Mäuse wurden in 10 unterschiedliche Gruppen wie folgt eingeteilt (Tabelle 4.1).
n Gruppe Anästhesie Laparotomie Ischämie Reperfusion CLP Fucoidin-
behandlung
Tötung
8 Kontrolle ja nein nein nein nein nein nach 8 h
8 Lap. 8h ja ja nein nein nein nein nach 8 h
8 Lap. 48h ja ja nein nein nein nein nach 48 h
8 I/R 8h ja ja sofort nach 4 h nein nein nach 8 h
8 I/R 48h ja ja sofort nach 4 h nein nein nach 48 h
8 I/R 48h+F ja ja sofort nach 4 h nein nach 4 h nach 48 h
8 CLP 40h ja ja nein nein sofort nein nach 40 h
9 CLP 40h+F ja ja nein nein sofort sofort nach 40 h
11 I/R+CLP 48h ja ja sofort nach 4 h nach 8 h nein nach 48 h
10 I/R+CLP 48h+F
ja ja sofort nach 4 h nach 8 h nach 4 h nach 48 h
Tabelle 4.1: Versuchsablauf der 10 Gruppen
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion, sofort=direkt nach der Laparotomie, nach x h=x Stunden nach Laparotomie, außer in der Gruppe Kontrolle, dort 8 Stunden nach Anästhesie
Methoden 30 4.1.3 Versuchsprotokoll des Ischämie-Reperfusions- und CLP-Modells („two-hit“)
Die Narkose erfolgte bei erhaltener Spontanatmung mit Ketamin-Lösung (100 mg/kg Körpergewicht) und Rompun (16 mg/kg Körpergwicht), welche subcutan injiziert wurden.
Nach Eintritt der Anästhesie wurde zunächst das Fell im Bereich des Abdomens großzügig rasiert, gereinigt und desinfiziert. Danach wurde eine ca. 2 cm lange kraniokaudale Laparotomie in der Linea alba durchgeführt. Um einen besseren Zugang zur Aorta abdominalis und Vena cava caudalis zu erhalten, wurden weite Darmabschnitte auf einen mit isotoner Natriumchloridlösung getränkten Tupfer hervorgelagert. Zur Erzeugung der Ischämie (first hit) der unteren Extremitäten erfolgte die infrarenale Ligatur der Aorta abdominalis und der Vena cava caudalis mit einem Faden aus Seide über 4 Stunden. Anschließend wurde die Ligatur nach erneuter Anästhesie gelöst und die Reperfusion erfolgte für weitere 4 Stunden.
Initial wurden alle Tiere mit Heparin antikoaguliert (Liquemin 125 i.E.), um eine Thrombosierung der distalen Gefäße während der Ischämiephase zu vermeiden. Die caecale Ligatur und Punktion (CLP) (second hit) wurde an der narkotisierten Maus in den Gruppen CLP 40h und CLP 40h+F direkt nach der Laparotomie, in den Gruppen I/R+CLP 48h und I/R+CLP 48h+F zum Ende der Reperfusion über die bereits angelegte Laparotomie durchgeführt. Die Ligatur wurde distal der Ileocaecalklappe mit einem 3-0 Faden angelegt.
Anschließend erfolgten 3 Punktionen mit einer 23-gauge Nadel.
Direkt nach Lösen der Ligatur (first hit) beim Ischämie/Reperfusionsmodell wurde in den Gruppen I/R 48h+F, I/R+CLP48h+F Fucoidin injiziert. In der Gruppe CLP 40h+F wurde das Fucoidin direkt nach der caecalen Ligatur und Punktion (second hit) verabreicht (Tabelle 4.1).
Mit steriler Ringer-Laktat-Lösung wurde eine Fucoidin-Stammlösung der Endkonzentration 37,5 mg pro ml hergestellt. Bis zum weiteren Gebrauch erfolgte die Aliquotierung und anschließende Lagerung dieser Gebrauchslösung bei –80°C. Die in die Schwanzvene injizierte Fucoidin-Dosis betrug 2,5 mg/kg Körpergewicht bei einem durchschnittlich injizierten Volumen von 0,2 ml.
Nach einem Beobachtungszeitraum von 8 Stunden wurden die Tiere der Gruppen Kontrolle und Lap. 8 getötet. Nach 40 Stunden wurden die Tiere der Gruppen CLP 40h und CLP 40h+F getötet. Die Tiere der Gruppen Lap.48h, I/R 48h, I/R 48h+F, I/R+CLP 48h und I/R+CLP
Methoden 31 48h+F wurden nach einem Beobachtungszeitraum von 48 Stunden getötet (siehe Sektion 4.1.4).
Während des Beobachtungszeitraumes wurde den Tieren täglich 2 ml Ringer-Laktat-Lösung subcutan injiziert. Weiterhin wurden die Tiere zwei Stunden nach dem operativen Eingriff unter eine Infrarotlichtlampe gestellt.
4.1.4 Tötung der Tiere zur Blut- und Organentnahme
Die Tötung der Tiere erfolgte mittels Exsanguation (kardiale Punktion) am mit Ketamin- Lösung und Rompun narkotisierten Tier, wobei das entnommene Blut weiter zum Serum verarbeitet wurde.
Post mortem wurde eine broncho-alveoläre Lavage (BAL) durchgeführt. Danach wurde ein Lungenflügel kryokonserviert (Myeloperoxidasebestimmung) und der andere Lungenflügel über das bronchiale System mit 5% Phosphat gepuffertem Formalin infiltriert und in 5%
Phosphat gepuffertem Formalin gelagert (Histologie). Die Leber wurde entnommen und jeweils ein Teil zur weiteren Aufarbeitung kryokonserviert (Myeloperoxidasebestimmung), während der andere Teil in Formalin fixiert wurde (Histologie).
4.1.5 Broncho-alveoläre Lavage (BAL)
Hierzu wurde eine stumpfe Kanüle in die Trachea eingeführt und fixiert. Es folgte die Spülung beider Lungenflügel mit 1 ml steriler isotoner Natriumchloridlösung. Die gewonnene Spüllösung wurde bis zur weiteren Aufarbeitung bei – 80° C eingefroren.
4.1.6 Bestimmung der kapillaren Permeabilität der Lunge
Die Ermittlung der Protein- und Harnstoffkonzentration aus der Lavageflüssigkeit erlauben eine Aussage über die kapillare Permeabilität der Lunge in vivo (VAN GRIENSVEN 1999).
Hierbei wurde der absolute Proteingehalt über die gleichzeitig gemessene Harnstoffkonzentration im Serum und in der BAL korrigiert, so daß über folgende Formel die Proteinkonzentration der BAL volumen-unabhängig berechnet werden konnte:
Ratio =
[Protein]BAL x [Protein]Serum x [Harnstoff]Serum
[Harnstoff]BAL
Methoden 32 4.2 Quantitative Proteinbestimmung nach Lowry
Die Bestimmung des Gesamt-Proteingehalts in Mäuseserum und aus der BAL zur Quantifizierung des alveolären Endothelschadens erfolgte nach dem Prinzip folgender Farbreaktion: Proteine reduzieren während der Inkubationszeit Cu(II) Ionen zu Cu(I) Ionen, welche mit Phosphomolybdat-Phosphowolframat einen blau-grünen Komplex bilden, dessen Absorption bei 578 nm photometrisch bestimmt werden kann.
Lösungen:
Lösung A: 2 % Na2CO3
0,02 % Na-K-Tartrat 0,4 % NaOH
Lösung B: 0,5 % CuSO4
Lowry I: 49 Teil Lösung A + 1 Teile Lösung B
Lowry II: Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz (Phosphomolybdat-Phosphowolframat, 1:1 mit H2O)
BSA-Eichlösung: 3,7-92 µg/ml
Durchführung:
In Zweifachansätzen wurden jeweils 50 µl Probe, 50 µl BSA-Eichlösungen und 50 µl Kontrolle (Wasser), mit Lowry I Lösung (2450 µl/Probe) versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
Nach Zugabe von je 200 µl Lowry II Lösung und einer 30 minütigen Inkubationszeit erfolgte die photometrische Absorptionsbestimmung bei einer Wellenlänge von 578 nm. Die Quantifizierung erfolgte mittels Interpolation in der Eichkurve.
4.3 Messung der Harnstoffkonzentration im murinen Serum und in der BAL
Die quantitative Bestimmung des Harnstoffgehalts im Mäuseserum und in der BAL- Flüssigkeit erfolgte nach dem Prinzip folgender Farbreaktion. Das Enzym Urease katalysiert rasch die Hydrolyse von Harnstoff in Ammoniak und Kohlenstoffdioxid. Der entstehende Ammoniak reagiert mit Hypochlorit und Phenol zu Indophenol, dessen Extinktion bei einer
Methoden 33 Wellenlänge von 578 nm bestimmt werden kann. Die Extinktion ist proportional zur Harnstoffkonzentration.
a) Harnstoff + H2O Urease 2 NH3 + CO2 b) 2 NH3 + 2 NaClO 2 NH2 + NaOH
c) 2 Phenol + 2 NH2Cl + 2 OH- 2 4-Aminophenol + 2 Cl- + 2 H2O d) 2 4-Aminophenol + 2 Phenol + O2 2 Indophenol + 2 H2O
Lösungen:
Urease-Lösung: 10 U Urease in 0,5 ml PBS und 0,5 ml Glycerol Harnstoff-Eichlösung: 30 mg Harnstoff/dl Wasser
Phenollösung: 25 mg Nitroprussid-Natrium-Dihydrat und 5 ml flüssiges Phenol in 500 ml Wasser gelöst
Hypochlorit-Lösung: 2,5 g Natriumhydroxid und 2,5 ml Natriumhypochlorit-Lösung mit 13 % aktivem Chlor in 500 ml Wasser gelöst
Durchführung:
In Zweifachansätzen wurden jeweils 50 µl Probe, 50 µl Harnstoff-Eichlösung und 50 µl Kontrolle (Wasser), mit 25 µl Urease versetzt und 15 Minuten bei RT inkubiert. Nach Zugabe von je 1,25 ml Phenollösung und 1,25 ml Hypochloritlösung und einer 30 minütigen Inkubationszeit, erfolgte die photometrische Absorptionsbestimmung bei einer Wellenlänge von 578 nm. Die Quantifizierung erfolgte mittels Interpolation in der Eichkurve.
Methoden 34
4.4 Messung der Myeloperoxidaseaktivität (MPO) in murinem Lungen- und Lebergewebe
Da ein direkter Zusammenhang zwischen der MPO Aktivität im Gewebe und der Anzahl der dort vorhandenen neutrophilen Granulozyten besteht (ALLAN et al. 1985), wurde zur Messung der Akkumulation der neutrophilen Granulozyten im Lungen- und Lebergewebe die Aktivität der MPO bestimmt.
Die kryokonservierten Gewebeproben wurden zunächst gewogen und in entsprechendem Anteil 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) mit 5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und 0,5 %-igem Hexadecylmethylammoniumbromid homogenisiert. Die Homogenisation erfolgte 3 mal 5 Minuten mittels Ultraturrax auf Eis.
Es folgte die Lyse der entstandenen Suspension im 10 minütigen, eisgekühlten Ultraschallbad.
Anschließend wurde ein 30 minütiger Zentrifugationsschritt bei 3000xg und 4°C durchgeführt. Je 10 µl des entstandenen Probenüberstandes wurden nun in einem well einer 96-well-Mikrotiterplatte mit 390 µl einer 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung, 3%
Wasserstoffperoxid und 1 % O-diasinidine Hydrochlorid versetzt. Bei 450 nm wurde nun im Photometer (ELISA-Reader) die Änderung der optischen Dichte über 3 Minuten gemessen.
Weiterhin wurde anhand einer zuvor auf die gleiche Weise erstellten Myeloperoxidase- Standardkurve die genaue Menge MPO quantifiziert.
4.5 Histologie
Nach Tötung der Tiere wurden Lunge und Leber entnommen. In einen Lungenflügel wurde mittels einer Kanüle über den Hauptbronchus 1 ml 5 % Phosphat gepufferte Formaldehyd Lösung infundiert, anschließend mit einer Ligatur verschlossen und in 5 % Phosphat gepufferte Formaldehyd-Lösung für mindestens 7 Tage aufbewahrt. Nach Abtrennung eines Leberlappens wurde dieser, genau wie der Lungenflügel, über den Zeitraum von mindestens einer Woche in 5 % Phosphat gepufferter Formaldehyd-Lösung gelagert.
Methoden 35 Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die Gewebeproben in Paraffin eingebettet und in 3 µm Schichten geschnitten, welche anschließend mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurden.
In den Präparaten der Lunge wurden interstitielle Verdickungen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Pneumozyten Typ II beobachtet. Die Befunde wurden in die Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt. In den Präparaten der Leber wurden hydropische Degeneration, multifokale Herdnekrosen, granulo-histiozytäre Infiltrationen und vergrößerte Kupffersche Sternzellen beobachtet. Die Befunde wurden in die Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradig (+) und mittelgradig (++) unterteilt. Die mikroskopische Auswertung fand mit 20- und 40-facher Vergrößerung statt.
4.6 Messung von Interleukinen in murinem Serum
Der Einfluß von Fucoidin auf den pathophysiologischen Prozess des Ischämie- Reperfusionsschadens (first-hit) und der durch CLP ausgelösten Sepsis (second-hit) der Mäuse sollte anhand der IL-6- und IL-10-Synthese mittels Enzym-gekoppelter Immunassays (ELISA) bestimmt werden. Zur quantitativen Bestimmung des Serum-IL-6 und Serum-IL-10 wurden IL-6 und IL-10 ELISA-Kits der Firma R&D Systems, Minneapolis, USA, verwendet.
Die ELISA wurden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die verwendeten ELISAs beruhten auf dem sogenannten „Sandwich System“ (s.u.).
Methoden 36 4.6.1 Interleukin-6 ELISA
Durchführung:
Die 96-well-Mikrotiterplatte war mit einem spezifischen, monoklonalen anti-Maus IL-6 Antikörper beschichtet (Capture-antibody), welcher vorhandenes IL-6 aus zupipettierten Serumproben und Standards (je 50 µl/well) bindet. Nach einer zweistündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und anschließendem fünfmaligem Waschen zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen wurde ein mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelter zweiter polyklonaler anti-Maus IL-6 AK (je 100 µl/well) hinzugegeben, welcher an das bereits über den Capture-antibody an der Mikrotiterplatte gebundene IL-6 bindet (Detecting-antibody).
Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde der nicht gebundene Anteil an Zweitantikörper durch fünfmaliges Waschen entfernt. Anschließend wurden 100 µl Substrat (3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin) pro well hinzugefügt und bei RT auf dem Rüttler inkubiert. Nach 30 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopplösung (HCl 10 M) gestoppt. Das gebundene Enzym setzt das Substrat zu dem meßbaren Farbstoff um, dessen Konzentration proportional zur IL-6-Konzentration im Ansatz ist. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wurde die O.D. im ELISA-Reader in Doppelwerten gemessen und über eine Standardeichreihe (1000 pg/ml-15,6 pg/ml) entsprechend den Herstellerangaben in Konzentrationen umgerechnet.
4.6.2 Interleukin-10 ELISA
Durchführung:
Die Durchführung erfolgte vom Prinzip wie der oben beschriebene IL-6 ELISA mit dem Unterschied, daß IL-10-spezifische AK verwendet wurden. Die Mikrotiterplatte war hier mit einem spezifischen polyklonalen anti-Maus IL-10 Antikörper beschichtet (Capture-antibody).
Als Zweitantikörper (Detecting-antibody) wurde ein mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelter polyklonaler anti-Maus IL-10 AK eingesetzt. Alle weiteren Schritte erfolgten, wie oben beschrieben.
Methoden 37 4.7 Statistik
Innerhalb der Gruppen wurden Mittelwerte gebildet und als Streuungsmaß der Standard error of the Mean (SEM) berechnet.
Alle statistischen Berechnungen erfolgten mit dem Programm Prism, GraphPad Software Inc, San Diego, USA.
Es wurden die 6 Gruppenpaare Kontrolle mit Laparotomie 8h, Laparotomie 8h mit Laparotomie 48h, Ischämie/Reperfusion 8h mit Ischämie/Reperfusion 48h, Ischämie/Reperfusion 48h mit Ischämie/Reperfusion 48h + Fucoidin, caecale Ligatur und Punktion 40h mit caecale Ligatur und Punktion 40h + Fucoidin und Ischämie/Reperfusion + caecale Ligatur und Punktion 48h mit Ischämie/Reperfusion + caecale Ligatur und Punktion 48h + Fucoidin verglichen.
Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten dieser Gruppen wurden mit dem ungepaarten Student’s t-test ermittelt.
Die Überlebenskurven wurden mit einem sogenannten Fisher´s exakter Test geprüft.
(p < 0,05 = signifikanter Unterschied)
38
5. Ergebnisse
5.1 Messung der IL-6 Konzentration im Serum
IL-6 spielt als multifunktionaler Immunmediator eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr und Hämatopoese. Zur Messung der IL-6 Konzentration im murinen Serum wurde ein Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), wie unter Sektion 4.6.1 beschrieben, verwendet.
Abb. 5.1: Mittelwerte ± SEM der IL-6 Konzentration in murinem Serum der verschiedenen Versuchsgruppen.
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, F=Fucoidin, CLP=caecale Ligatur und Punktion x h=x Stunden nach OP *p < 0,05
Abbildung 5.1 zeigt die mittlere IL-6 Konzentration gemessen in pg/ml in murinem Serum.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche lediglich einer Anästhesie unterzogen wurde und bei der eine mittlere IL-6 Konzentration von 15,6 ± 2,5 pg/ml gemessen wurde, war bei den laparotomierten Tieren nach 8 Stunden ein signifikanter Anstieg der IL-6 Konzentration auf 51,3 ± 9,4 pg/ml im Serum zu beobachten (p < 0,05). 48 Stunden nach Laparotomie war die Serumkonzentration von IL-6 bereits wieder auf Normalwerte (15,5 ± 2 pg/ml) wie bei der
Kontrolle Lap. 8h Lap. 48h I/R 8h I/R 48h I/R 48h+F CLP 40h CLP 40h+F I/R+CLP 48h I/R+CLP 48h+F
0 100 200 300 400
*
*
*
*
Versuchsgruppen
[IL-6] (pg/ml)
Ergebnisse 39 Kontrollgruppe abgesunken (Abbildung 5.1). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt nach Ischämie/Reperfusion, bei der es nach 8 Stunden zu einem starken signifikanten Anstieg der IL-6 Konzentration (321,5 ± 52,1 pg/ml) kam. Dieser Konzentrationsanstieg war deutlich höher als bei der Laparotomiegruppe. Nach Ischämie/Reperfusion war nach 48 Stunden ein Rückgang der IL-6 Konzentration auf 44,6 ± 29 pg/ml zu beobachten. Dies zeigt auch die Untersuchung der anderen „one-hit“ Gruppe, bei der es nach CLP nach 40 Stunden (29,3 ± 3,4 pg/ml) zu keiner Erhöhung der IL-6 Serumkonzentration kam.
Auch nach Gabe von Fucoidin kam es in den beiden „one-hit“ Gruppen Ischämie/
Reperfusion 48h (26,2 ± 8,5 pg/ml) und CLP 40h (22,5 ± pg/ml) zu keiner IL-6 Konzentrationsveränderung.
In dem „two-hit“ Modell nach Ischämie/Reperfusion und caecaler Ligation und Punktion kam es nach 48 Stunden ebenfalls zu keinem IL-6 Konzentrationsanstieg (30,0 ± 7,2 pg/ml). In der mit Fucoidin behandelten „two-hit“ Gruppe zeigte sich jedoch mit 230,5 ± 52,9 pg/ml eine im Vergleich zu der Gruppe ohne Fucoidin stark signifikant erhöhte IL-6 Konzentration nach 48 Stunden (Abbildung 5.1).
5.2Messung der IL-10 Konzentration im Serum
IL-10 spielt als Immunmediator eine wichtige Rolle bei der Regulation inflammatorischer Prozesse. IL-10 ist unter anderem in der Lage, die Produktion unterschiedlicher Zytokine und Immunmediatoren immunkompetenter Zellen zu inhibieren und die zytotoxische Aktivität von Makrophagen herabzusetzen. Als antiinflammatorisches Zytokin nimmt es bei der Entstehung des SIRS und MODS eine wichtige Funktion ein. Die Messung des IL-10 erfolgte wie unter Sektion 4.6.2 beschrieben, mittels eines ELISA.
