Bis heute ist die Translocase I oder MraY als ″drug target″ wenig erforscht worden, vor allem aufgrund der schwierig durchzuführenden Expression und Reinigung dieses Membranproteins, welche Mengin-Lecreulx et al. erstmals 2004 gelungen war, sowie der intrinsischen Probleme bei der Entwicklung von Inhibitoren membranständiger Enzyme.[21] Kürzlich konnten Bernhard et al.
MraY aus Escherichia coli und Bacillus subtilis zellfrei exprimieren, wobei gute Aktivitäten gefunden wurden. Für das aus E. coli isolierte MraY mussten allerdings noch Lipide zugesetzt werden, da das Enzym in Lösung nicht so stabil und robust war, wie das analoge Enzym aus Bacillus subtilis, von dem Mengen von bis zu 1.2 mg/L erhalten werden konnten.[22]
Die Konsequenz ist, dass noch kein kommerziell entwickelter MraY-Inhibitor als Antibiotikum auf dem Markt ist. Daraus folgt ein vielversprechendes Ziel für die Suche nach neuen antibakteriell wirkenden Medikamenten,[23,24] denn das Vorkommen von MraY ist zwar einerseits auf Bakterien limitiert, andererseits ist die fehlerfreie Funktion von MraY die Voraussetzung für die Entwicklung und das Überleben aller bakteriellen Organismen, was zu den entscheidenden Vorteilen der Translocase I als ″drug target″ zählt.[25,26]
Zuerst wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen der Mechanismus zur Bildung von Lipid I in Escherichia coli,[27] Micrococcus luteus[28] und Staphylococcus aureus untersucht.[29] Anfang der 1970er Jahre konnte hierfür ein erstes Modell postuliert werden, wobei zwei entscheidende Teilreaktionen entdeckt wurden: Die erwartete Reaktion des Undecaprenylphosphat-Lipidcarriers mit dem UDP-MurNAc-pentapeptid, wobei Mg2+ benötig wird, ist reversibel und die Gleichgewichtskonstante beträgt 0.25. Zum anderen wurde durch Versuche mit Tritium-markiertem UMP eine Austauschreaktion des UMP-Restes des Eduktes UDP-MurNAc-pentapeptid bei Abwesenheit des Lipidcarriers beobachtet. In dem folgenden von Neuhaus et al. vorgeschlagenen Mechanismus sind die Reaktionen 1-3 für diese Austauschreaktion und die Reaktionen 1-6 für die vollständige Umsetzung zum Lipid II verantwortlich (Abb. 4).[28,30] Da die kombinierten Geschwindigkeitskonstanten für 1-3 größer als für 1-6 sind, bewirkt eine partielle Inhibierung der
Reaktionen 1-3 keine Hinderung der Umsetzung (1-6). Dieses Modell wurde durch weitere Versuche bestätigt.[31]
Abb. 4 Teilschritte der MraY-vermittelten Reaktion
Ikeda et al. entdeckten 1991,[32] dass in E. coli die Translocase I das Produkt des Gens mraY ist.
Neben dessen Klonierung und Sequenzierung[33] konnte außerdem die Abhängigkeit vom Pmra-Promoter gezeigt werden.[34,35]
Bezogen auf die Struktur des Enzyms Translocase I war schon früh bekannt, dass eine lipidische Mikroumgebung für die Aktivität essentiell ist,[27,29,36] und dass hydrophobe und hydrophile Domänen alternierend in der Aminosäuresequenz des Enzyms auftreten.[32] Die Topologie konnte schließlich von Mengin-Lecreulx et al. 1999 in einem Modell zusammengefasst werden.[37] Dabei wurde für das Membranprotein zunächst ein zweidimensionales Modell angegeben, welches beispielsweise für MraY aus S. aureus aus zehn Transmembranhelices sowie fünf cytoplasmischen und sechs periplasmischen Domänen inklusive der C- und N-Termini besteht. Für das katalytisch aktive Zentrum des ersten Membran-assoziierten Schritts in der Peptidoglycansynthese sind aber nur die cytoplasmischen Domänen entscheidend (Abb. 5).
Diese Domänen sind sowohl am katalytischen Prozess als auch an der Substraterkennung beteiligt.
Dabei wird vermutet, dass die Domänen II-IV von A und B für die Wechselwirkung mit den Phosphatresten des Undecaprenyl-Lipidcarriers oder UDP-MurNAc-pentapeptides beteiligt sind (Katalyse). Die Domänen I und V von B sind an den Wechselwirkungen mit den Aminosäuren des Glycopeptids beteiligt (Substraterkennung). Außerdem wurde durch Vergleich mit verwandten Enzymen die fünfte cytoplasmische Domäne als Zuckererkennungsdomäne identifiziert, die spezifisch auf das UDP-N-Acetyl-D-Hexosamin reagiert.[38]
Lloyd et al. konnten 2004 eine Struktur des kovalenten Intermediats bestehend aus Phospho-MurNAc-pentapeptid und den nucleophilen Resten des Membranproteins Translocase I postulieren.[39]
Acceptor-P + E-P-MurNAc-pentapeptid Acceptor-P---E-P-MurNAc-pentapeptid (4) E + UDP-MurNAc-pentapeptid E---UDP-MurNAc-pentapeptid (1) E---UDP-MurNAc-pentapeptid UMP---E-P-MurNAc-pentapeptid (2) UMP---E-P-MurNAc-pentapeptid UMP + E-P-MurNAc-pentapeptid (3) Acceptor-P---E-P-MurNAc-pentapeptid E --Acceptor-P2-MurNAc-pentapeptid (5) E --Acceptor-P2-MurNAc-pentapeptid E + Acceptor-P2-MurNAc-pentapeptid (6)
Abb. 5 Topologisches Modell der Membranproteine MraY (A: aus E. coli und B: aus S. aureus; aus Lit. 37)
Dazu wurden zunächst aus E. coli C-terminale Hexahistidin-Fusionsproteine durch zielgerichtete Mutagenese konstruiert, dargestellt und gereinigt. Mittels der Aktivität der Mutanten und durch Sequenzvergleich mit verwandten Phosphatzucker-Transferase-Proteinen konnten nur drei Aminosäurereste entdeckt werden, die nucleophile Seitenketten besitzen (Asp-115, Asp-116 und Asp-267) und den Phosphattransfer katalysieren. Aufgrund der Analogie des Aspartatmotives in Prenyltransferasen wurde das in der Abb. 6 dargestellte Modell postuliert.
Helix 3 Helix 4
Abb. 6 Modell des aktiven Zentrums von MraY (aus Lit. 39).
Dabei werden die Aspartatreste Asp-115 und Asp-116 durch den Mg2+-Co-Faktor chelatisiert, der wiederum an die Pyrophosphatbrücke des MurNAc-pentapeptides bindet, und Asp-267 wirkt als katalytisches Nucleophil zur Abspaltung von UMP.
Bouhss et al. entdeckten 2008 nach weiteren Untersuchungen mit ortsspezifischer Mutagenese mit dem bis zur Homogenität gereinigten MraY-Protein, dass nur ein Aspartat-Rest essentiell für die Aktivität war, da nach Mutationen der zwei anderen Aspartat-Reste immer noch eine signifikante Aktivität festzustellen war. Daraus wurde ein direkter Angriffs-Mechanismus abgeleitet, wobei der unabdingbare Aspartat-Rest 98 in der zweiten cytoplasmischen Domäne das Undecaprenylphosphat deprotoniert, welches simultan das β-Phosphat des MurNAc-pentapeptides 4 angreift (Abb. 7).[40]
Abb. 7 Postulierter MraY-katalysierter Einschritt-Mechanismus zur Bildung von Lipid I 5
Zur Untersuchung und Charakterisierung neuartiger MraY-Inhibitoren sind Assays erforderlich, wobei nur wenige den Maßstäben des high throughput screening (HTS) genügen.[41-45] Diese sind allerdings für das Translocase I-Enzym mit gewissen Nachteilen behaftet: So wurden auch zusätzliche Aktivitäten, wie MurG, Transglycolase und Transpeptidase mitgemessen, oder die Assays sind auf Zellpräparationen angewiesen, was Auswirkungen auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hat. Außerdem werden vor allem radioaktive Substrate verwendet; erst Blanot et al.
entwickelten 2004 einen auf Fluoreszenzdetektion basierten HTS-Assay ausschließlich für MraY (bestätigt durch IC50-Bestimmung für verschiedene bekannte natürliche und synthetische Translocase I-Inhibitoren), der sehr viel aussagekräftiger ist als seine zellbasierten Vorgänger.[46]
Außer den erwähnten Multienzym-Assays sind bisher nur wenige ausschließlich auf MurG ausgelegte Assays bekannt.[47-49] Bezüglich der Inhibitoren wurden vor allem die Prenyl-Ketten variiert, und zwei Arbeitsgruppen kamen zu dem Ergebnis, dass nicht die der Natur am nächsten kommenden Substrate die höchste Aktivität zeigten, sondern solche mit ca. halb so langen Ketten (C35 statt C55). Außerdem wurden die besten Reaktionsbedingungen ermittelt und folgende interessante Aspekte entdeckt: So sind 35 % DMSO nötig, um Löslichkeitsprobleme zu umgehen,
P
und auch MurG katalysiert die entsprechende Rückreaktion (von Lipid II zu Lipid I), allerdings in weniger starkem Ausmaß als MraY. 2005 konnten de Sousa et al. einen kombinierten MraY- und MurG-Assay etablieren, der das Screening neuer Antibiotika ermöglicht. Allerdings mussten Membranen von E. coli verwendet werden, da diese keine PBP-Proteine beinhalteten, denn die direkte Weiterreaktion von Lipid II zum Peptidoglycan ist ein bekanntes Problem bei der Vernwendung von anderen Membranen.[50]
Der Forschungsschwerpunkt liegt im Moment aber vor allem bei MraY, vor allem im Bereich der HTS-geeigneten Assays und der Ermittlung der Proteinstruktur.
2.4 Muraymycine
Als MraY-Inhibitoren sind folgende nichtklinische Antibiotika bekannt: das Protein E, die Caprazamycine, Liposidomycine, Capuramycine, Fettsäure-Nucleosid-Inhibitoren (z. B.
Tunicamycine) und Peptid-Nucleosid-Inhibitoren (z. B. Mureidomycine).[51,52] Außerdemspielen die Muraymycine in der aktuellen Forschung eine wichtige Rolle, welche im weiteren Verlauf im Mittelpunkt stehen sollen. Abgesehen vom Protein E ist all diesen MraY-Inhibitoren gemeinsam, dass sie strukturell dem Substrat UDP-MurNAc-pentapeptid 4 entfernt ähnlich sind, sodass ein kompetitiver Mechanismus nahe liegt.
McDonald et al. berichteten 2002 erstmals über die aus Streptomyceten spp. LL-AA896 gewonnene Muraymycin-Familie.[53] Dabei wurden 19 Komponenten chromatographisch getrennt, die sich in der Aminoribose R1 und der Lipidkette R2 unterscheiden. Die wichtigsten Vertreter von 7 mit ensprechenden Aktivitäten sind in Abb. 8 zusammengestellt. Diese Naturstoffe bestehen aus dem 5'-Aminosäure-modifizierten Nucleosid Uridin, das an einen weiteren Zucker (Aminoribose) und einen Aminopropyllinker gebunden ist. An letzteren ist eine peptidische Einheit aus lipidiertem Hydroxyleucin sowie aus Epicapreomycidin, Harnstoff und Valin geknüpft.
Die bemerkenswerte nicht-proteinogene Aminosäure Epicapreomycidin kommt in allen 19 isolierten Derivaten vor. Für die Aktivität wurde dem Fettsäurerest und dem Aminozucker eine entscheidende Bedeutung zugewiesen. Insgesamt wurde festgestellt, dass alle getesteten Komponenten Inhibitoren von MraY sind und die Lipid II-Bildung verhindern. Dabei wurden Staphylococcen, Enterococcen und gram-negative Bakterien untersucht (z. B. MIC = 0.027 μg/ml, minimale Inhibitorkonzentration von Muraymycin A1 gegenüber einem mutierten E. coli Stamm, vergleichbar mit Liposidomycin und Mureidomycin A).
Lin et al. entwickelten semisynthetische Derivate dieser Antibiotika und testeten diese auf ihre antibakterielle Aktivität.[54] Im Mittelpunkt stand dabei die Einführung lipophiler Gruppen an der
primären Aminofunktion der Aminoribose und an der sekundären Aminogruppe der
Dabei wurde festgestellt, dass disubstituierte Derivate keine Aktivität (jeweils gegen verschiedene Bakterienstämme) zeigten, im Gegensatz zu Muraymycin-Derivaten, die ausschließlich an der sekundären Aminogruppe substituiert wurden. Die Aktivitäten waren dabei von der Lipophilie der eingeführten Gruppe abhängig. Daraus wurde gefolgert, dass die Fettsäure für die Penetration der Membran essentiell ist, da sich das aktive Zentrum von MraY im Cytoplasma befindet. Außerdem wurde für das primäre Amin der Aminoribose ein ähnlicher Mechanismus wie bei den Mureidomycinen, vermutet d. h. das Amin bindet in der aktiven Tasche von MraY an den Mg2+ -Co-Faktor.
Yamashita et al. synthetisierten verkürzte Muraymycin-Derivate durch Aldolreaktion an einem 5'-Uridinaldehyd.[55] Epicapreomycidin wurde hierbei durch Arginin ersetzt und der 5'-Aminozucker als auch die Fettsäure weggelassen. Die Aktivitätsuntersuchungen an verschiedenen gram-positiven Bakterien ergab ähnliche in vivo-Aktivitäten, eine Bevorzugung der (5'R)-Derivate am Uridin sowie
eine Aktivitätsverminderung durch Entschützung der Verbindungen.
Matsuda et al. konnten 2010 schließlich die erste Totalsynthese von (-)-Muraymycin D2 und einem seiner Epimere realisieren.[56,57]
(DHQD)2AQN, NaOH
tBuOCl, PrOH-H2O
5) TrocNHCH2CH2CHO, NaBH(OAc)3 AcOH, CH2Cl2
3) Triphosgen, NEt3 CH2Cl2
13 (trans/cis = 37:1)
O
Abb. 9 Synthese des Isonitrilbausteins 8 nach Matsuda et al.[57,58]
Dabei wurde eine Ugi-4-Komponenten-Reaktion mit dem Aminoribose-Uridinyl-isonitril 8, Isovaleraldeyhd 9, 2,4-Dimethoxybenzylamin 10 und der freien Säure des Valin-epicapreomycidin-harnstoffs 11 (detailierte Beschreibung siehe Kap. 2.6.) angewendet. Das Isonitril 8 wurde ausgehend vom Acetonid-geschützten Uridin 12 dargestellt (Abb. 9).[57,58]
Nach IBX-Oxidation und C2-Verlängerung durch Wittig-Reaktion wurde das in einem trans/cis Verhältnis von 37:1 gebildete trans-Olefin 13 in exzellenter Ausbeute (96 %) und Diastereoselektivität (de 98 %) unter Sharpless-Bedingungen zu 14 aminohydroxyliert. Der primäre Alkohol 14 wurde anschließend β-selektiv (β/α = 24:1) mit Bortrifluorid und dem Ribosyldonor 15 in guter Ausbeute zum Azid 16 umgesetzt, das nach Umkristallisation das reine β-Anomer 16 in 71 %-iger Ausbeute lieferte. Durch Staudinger-Reduktion mit Triphenylphosphin und direkte Boc-Schützung konnte das N-Boc-Aminoribose-Derivat dargestellt werden. Verseifung mit Bariumhydroxid und Veresterung mit tert-Butyl-trichloracetimidat, hydrogenolytische Cbz-Spaltung und reduktive Aminierung mit Troc-geschütztem 3-Aminopropionaldehyd lieferte den geschützten Isonitril-Vorläufer 17 in guter Ausbeute von 41 % über sechs Stufen. Troc-Spaltung mit Zink, Formylierung mit Ameisensäure und EDC und finale Umsetzung mit Triphosgen und Triethylamin lieferte den Isonitrilbaustein 8 in 25 % Gesamtausbeute über 13 Stufen.
Abb. 10 Synthese von Muraymycin 7-D2 und 7-epi-D2 nach Matsuda et al.[59]
Die anschließende Ugi-Reaktion lieferte ein 1:1-Diastereomerengemisch, das nach globaler Entschützung per HPLC getrennt wurde, sodass die Epimere 7-D2 und 7-epi-D2 mit einer Gesamtausbeute von 3.4 % bzw. 3.3 % über 29 Stufen erhalten werden konnten (Abb. 10).
Diese Verbindungen wurden biologisch getestet und lieferten sehr gute Aktivitäten gegen MraY aus Bacillus subtilis (IC50 = 0.01 μM bzw. 0.09 μM,[59] IC50 ist die mittlere inhibitorische Konzentration, die notwendig ist für eine 50 %-ige Inhibition).[60] Aufgrund der fehlenden Lipidkette konnte aber keine antibakterielle Aktivität in vivo beobachtet werden. Deshalb synthetisierten Matsuda et al.
weitere Mimetika, die durch die Verwendung von Aldehyden mit unterschiedlichen Alkylketten gebildet wurden.[59] Dabei wurden die besten Ergebnisse für Muraymycine gemessen, die mit einer einfachen C-15-Alkylkette ausgestattet waren (MIC-Werte: 2-4 μg/mL, sowohl gegen MRSA als auch VRE). Die IC50-Werte waren etwas schlechter als beim Naturstoff 7-D2, aber immer noch sehr gut (0.33 μM bzw. 0.74 μM). Außerdem wurde ein stark verkürztes Muraymycin mit der Alkylkette direkt am Stickstoff des Ribosyl-Uridylglycins synthetisiert. Dabei wurde eine deutlich schlechtere Aktivität gegen MraY (IC50 5 μM) und die getesteten Bakterien (MIC 32-64 μg/mL) beobachtet, sodass der Peptideinheit eine wichtige Rolle zukommt. Matusda et al. bauten ihre Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung aus und studierten den Einfluss der Peptideinheit.[61] Dazu wurden für den Säurebaustein Valinharnstoff-Derivate mit Epicapreomycidin, seinem Epimer Capreomycidin, Arginin und Ornithin verwendet. Außerdem wurde zur Ermittlung der Funktion von Valin nur Epicapreomycidin in der Ugi-4-Komponenten-Reaktion verwendet. Auswertung der MIC-Werte ergab, dass alle Mimetika eine ähnliche gute Aktivität zeigten (1-8 μg/mL, sowohl gegen MRSA als auch VRE). Des Weiteren wurde festgestellt, dass das neu gebildete Stereozentrum am Leucin keinen Einfluss auf die Aktivität hatte. Ebenso spielte das Epicapreomycidin eine untergeordnete Rolle, da die Verwendung von Arginin und Capreomycidin sogar bessere Werte als der Naturstoff lieferte (MIC 1-4 μg/mL). Die Verwendung von Ornithin inkl. Valinharnstoff und dem Epicapreomycidin ohne Valinharnstoff lieferte etwas geringere Aktivitäten, wobei immer noch sehr potente Antibiotika vorlagen. Um den Einfluss des Valin-Harnstoff-Motivs zu untersuchen wurden Ornithin, Arginin und Methionin als terminale Aminosäure erprobt, was vergleichbar gute MIC-Werte von 4-8 μg/mL ergab. Daraus folgt, dass aus medizinalchemischer Sicht der C-Terminus, sprich das L-Valin, nicht notwendig und das
L-Epicapreomycidin nicht bedeutend ist. Das Vorhandensein eines Dipeptids ist für eine gute bakterielle Aktivität aber essentiell, da dieses Motiv wahrscheinlich von der cytoplasmischen Domäne V erkannt wird. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Bindungsmodell des untersuchten Muraymycin-Mimetikums mit MraY postuliert (Abb. 11).
Somit bleibt festzuhalten, dass Muraymycine sehr gute Inhibitoren für MraY sind. Allerdings steht
vor allem die Untersuchung der Funktion der Peptideinheit und des Hydroxyguanidins noch aus, was eine effiziente Totalsynthese auch der komplexen Naturstoffe essentiell macht.
Abb. 11 Postulieres Bindungsmodell von Muraymycin D2 7-D2 an MraY (aus Lit. 61)