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3. Material und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Chemikalien

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Sigma Aldrich und Fluka (Steinheim, DE), abcr GmbH (Karlsruhe, DE), VWR (Darmstadt, DE), Thermo Fisher (Braunschweig, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE), Fluorochem (Hadfield, UK) und Prozomix (Haltwhistle, UK) bezogen.

3.1.2. Vewendete Enzyme

Neben den selbst hergestellten Enzymen kamen auch einige kommerziell erhältliche Enzyme zum Einsatz (Tab. 1).

Tabelle 1: Verwendete Enzyme und deren Verwendung.

Enzym Herkunft Verwendung

PfuUltraII Fusion HS

DNA-Polymerase Agilent (Santa Clara, US) PCR, QuikChange-PCR Phusion High-Fidelity

DNA-Polymerase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

T5-Exonuclease NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly Taq DNA-Ligase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

Dpn1 NEB (Frankfurt, DE) Verdau von DNA-Templat

DNAseI (Rind) Sigma Aldrich (Steinheim,

DE) Enzymatischer

Zellaufschluss Lysozym aus Hühnereiweiß AppliChem GmbH

(Darmstadt, DE) Enzymatischer Zellaufschluss Peroxidase (Meerrettich) AppliChem GmbH

(Darmstadt, DE) Aktivitäts-Assay für Oxidasen

Glukose-6-P-Dehydrogenase aus

Leuconostoc mesenteroides

Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) Regeneration von NADPH und NADH

Formiat-Dehydrogenase

aus Candida boidinii Sigma Aldrich (Steinheim,

DE) Regeneration von NADH

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3.1.3. Verwendete Kits

Für verschiedene molekular- und mikrobiologische Techniken wurden Anwendungsspezifische Kits verwendet, welche im Folgenden aufgeführt sind (Tab. 2).

Tabelle 2: Verwendete Kits und deren Verwendung.

Kit Herkunft Verwendung

ZyppyTM Plasmid Miniprep

Kit Zymo Research

(Irvine, US) Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

DNA Clean and

ConcentratorTM Zymo Research

(Irvine, US) DNA-Reinigung

ZymocleanTM Gel DNA

Recovery Kit Zymo Research

(Irvine, US) Extraktion von DNA aus einem Agarosegel PierceTM BCATM Protein

Assay Kit

Thermo Fisher (Braunschweig, DE)

Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration

3.1.4. Verwendete Plasmide

Für die heterologe Expression und Herstellung von Iminreduktasen (IREDs) und Putrescinoxidasen (PuOs) wurden drei verschiedene Expressionssysteme verwendet, sodass auch drei verschiedene Plasmide eingesetzt wurden (Tab 3).

Tabelle 3: Verwendete Plasmide.

Plasmid

Empfänger-stamm

Resistenz-marker Operon Verwendeter Induktor

An-wendung pET28a(+) E. coli DH5α /

E. coli BL21(DE3)

Kanamycin-Resistenz

Lactose-Operon IPTG IREDs

pBAD18[157] E. coli JW5510 Ampicillin-Resistenz

Arabinose-Operon L

(+)-Arabinose PuOs pBAD33[157] E. coli JW5510

Chlor- amphenicol-Resistenz

Arabinose-Operon L

(+)-Arabinose IREDs

19 3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer

Für das Einfügen von zielgerichteten Mutationen wurden verschiedene Techniken angewendet, wobei spezifische Oligonukleotide (Primer) eingesetzt wurden (Tab 4,5).

Alle Primer wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) bezogen.

Tabelle 4: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Kofaktorspezifität.

Ziel- Mutation

Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘)

V = vorwärts, R = rückwärts

R33X, T34X,

K37X WT 3 B V: GTGGAACHVCRMKAAAGCCDAKAGCGAACCGCTGGCAAAACTG R: GTTCGCTMTHGGCTTTMKYGBDGTTCCACACCGTGGTCGTGTAG

N32X V1 2 A V: CACGACCACGGTGTGGNNKTACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTAMNNCCACACCGTGGTCGTG

K37X V1 2 A V: GAACTACGAGAAAGCCNNKAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTMNNGGCTTTCTCGTAGTTC

L67X V5 2 A V: CGTGGTTAATGTGNNKGATTATGACACCTCTGATC R: GATCAGAGGTGTCATAATCMNNCACATTAACCACG

T71X V5 2 A V: GTGCTGGATTATGACNNKTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGAMNNGTCATAATCCAGCAC

L75X V8 2 A V: GACACCTCTGATCAGNNKCTGCGCCAAGACGAAG R: CTTCGTCTTGGCGCAGMNNCTGATCAGAGGTGTC

N32E V3 1 A V: CACGACCACGGTGTGGGAATACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTATTCCCACACCGTGGTCGTG

R33Y WT 1 A V: CCACGGTGTGGAACTACACCAAAGCCAAAAGCG R: CGCTTTTGGCTTTGGTGTAGTTCCACACCGTGG

R37A V8 1 A V: GAATACGAGAAAGCCGCGAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTCGCGGCTTTCTCGTATTC

L67I V7 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG

T71V WT 1 A V: GTGCTGGATTATGACGTGTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGACACGTCATAATCCAGCAC

T71V V6 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:

1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an drei Positionen gleichzeitig.

b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange-PCR; B) Gibson assembly.

Tabelle 5: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Stereoselektivität. Die Mutationsstelle im Primer ist grau markiert.

Ziel-

Mutation Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘)

V = vorwärts, R = rückwärts

A122V, T123P,

P124A V8 1 A V: CGGTGCGATCATG GTT CCG GCG GATTTTATTGGCCAG R: CTGGCCAATAAAATC CGC CGG AAC CATGATCGCACCG

D171Y V8 1 A V: CATGCCTCAGCACTG TAT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGCGCT ATA CAGTGCTGAGGCATG

M178F V8 1 A V: CCTGCTGTTTCAG TTC TGGGGCACCCTGTTC R: GAACAGGGTGCCCCA GAA CTGAAACAGCAGG

20 Q234D, T235V,

L236D V8 1 A V: CTGACCGCAGACGCT GAT GTG GAT GCAAGTCTGGAAGG R: CCTTCCAGACTTGC ATC CAC ATC AGCGTCTGCGGTCAG

H242G V8 1 A V: CAAGTCTGGAAGCT GGT AACGTGGCGTTC R: GAACGCCACGTT ACC AGCTTCCAGACTTG

S95X,

D171X V8 3 B

V: CAGCTGACC KHT GGTTCTCCGGCACTGGC R: CAGGGCGCT ADM CAGTGCTGAGGCATGACC V: CTCAGCACTG KHT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CGGAGAACC ADM GGTCAGCTGAACCAGCAG

I120X,

M121X V8 3 A V: CTGGACGGTGCG KHT KHT GCCACCCCGGATTTTATTG R: CAATAAAATCCGGGGTGGC ADM ADM CGCACCGTCCAG

A122X,

T123X V8 3 A V: GACGGTGCGATCATG KHT KHT CCGGATTTTATTGGC R: GCCAATAAAATCCGG ADM ADM CATGATCGCACCGTC

L175X,

M178X V8 3 A V: GACAGCGCCCTG KHC TTTCAG KHT TGGGGCACCCTG R: CAGGGTGCCCCA ADM CTGAAA GDM CAGGGCGCTGTC

A241X,

H242X V8 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGGCGTTCC R: GGAACGCCACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

V212X V8 2 A V: CTGACCGAACCG NNK ACCCAGGGTGCCGTTG R: CGGCACCCTGGGT MNN CGGTTCGGTCAGTTTG

A237X V8 2 A V: GACGCTCAGACGCTG NNK AGTCTGGAAGCTCATAAC R: GAGCTTCCAGACT MNN CAGCGTCTGAGCGTCTG

M13X V8 2 A V: GTTATTGGCGCTGGCCGT NNK GGCTCCGCACTG R: CAGTGCGGAGCC MNN ACGGCCAGCGCCAATAAC

P124X V8 2 A V: CGATCATGGCCACC NNK GATTTTATTGGCCAGGC R: GCCTGGCCAATAAAATC MNN GGTGGCCATGATCG

A245X V8 2 A V: GGAAGCTCATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATGAGCTTCC

L170X, D171Y,

S172Q V8 1+2 A V: CATGCCTCAGCACTG NNK TAC CAG GCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGC CTG GTA MNN CAGTGCTGAGGCATG

A245X 15B7 2 A V: GGAAGTTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTCAAATATTCC

A241X,

H242X 110D2 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGTTGTTCC GGAACAACACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

A241X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA NDT TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA VHG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA TGG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC

R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

H242X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT NDT AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT VHG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT TGG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

A241M,

H242X V8 1+2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG NDT AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG VHG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG TGG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG

R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

E240X,

N243X 15B7 3 B V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTG KHT GTTTAT KHT GTGGCGTTCCA ACACCTGCTGGCC

R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

V244X,

F246X 110C2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, 15B7 1+3 A V: GTCTGGAAGTTTATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATAAACTTCCAGAC

21 A245C,

F246X V244X,

F246X 110D2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, A245L,

F246X 24E4 1+3 A V: GTCTGGAAATTTATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATAAATTTCCAGAC

A245L D171Y 1 A V: GGAAGCTCATAACGTG TTG TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA CAA CACGTTATGAGCTTCC

A245X 24E4 2 A V: GTCTGGAAATTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATAAATTTCCAGAC

G96D,

S79X V8 1+2 A V: GTTCAGCTGACCAGC GAT NNK CCGGCACTGGCTC R: GAGCCAGTGCCGG MNN ATC GCTGGTCAGCTGAAC

T94X, G96D,

S79X V8 1+3 A V: CTGGTTCAGCTG KHT AGCGAT KHT CCGGCACTGGCTG R: CAGCCAGTGCCGG ADM ATCGCT ADM CAGCTGAACCAG

F246X 110D2 2 A V: GAAGCTCATAACGTG TTG NNK CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG MNN CAA CACGTTATGAGCTTC

A241X 23B3 2 A V: GCTGGCAAGTCTGGAA NNK TATAACGTGTTGTTCC R: GGAACAACACGTTATA MNN TTCCAGACTTGCCAGC

H242X 23B3 2 A V: GGCAAGTCTGGAAGTT NNK AACGTGTTGTTCCAAC R: GTTGGAACAACACGTT MNN AACTTCCAGACTTGCC

N243X 23B3 2 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT NNK GTGTTGTTCCAACACC R: GGTGTTGGAACAACAC MNN ATAAACTTCCAGACTTG

N243X

V244X 23B3 3 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT KHT KHT TTGTTCCAACACCTGC R: GCAGGTGTTGGAACAA ADM ADM ATAAACTTCCAGACTTG a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:

1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an zwei Positionen gleichzeitig.

b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange-PCR; B) Gibson assembly; C) Gibson assembly kombiniert mit „22c-trick”.[158]

3.1.6. Verwendete E. coli Stämme

Das Gen für R-IRED_Ms wurde im Rahmen eines früheren Projektes von GenSkript (Piscataway, US) synthetisiert und in einem pET28a(+)-Vektor geliefert. Deshalb wurde zunächst mit einem passenden Expressionsstamm (E. coli BL21(DE3)) gearbeitet, welcher das Gen für die nötige T7-Polymerase trägt. Für die Klonierungsarbeiten mit pET28a(+) wurde außerdem der Klonierungsstamm E. coli DH5α verwendet. Im weiteren Verlauf wurde das Gen in einen pBAD33-Vektor überführt. In diesem Plasmid standen auch weitere IREDs zur Verfügung, welche bereits in Vorarbeiten kloniert wurden. Für pBAD-Plasmide wurde der Stamm E. coli JW5510 aus der Keio-Collection[159] herangezogen, bei welchem die Gene der Abbauenzyme von

L(+)-Arabinose ausgeschaltet sind. Auch für die Arbeiten mit PuOs, welche in einem

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pBAD18-Vektor integriert waren, wurde E. coli JW5510 verwendet. Neben der Expression von IREDs und PuOs wurden auch sämtliche Klonierungsarbeiten in diesem Stamm durchgeführt. Tabelle 6 zeigt den Genotyp der verwendeten Stämme.

Tabelle 6: Genotypen der verwendeten E. coli Stämme.

Stamm Genotyp

E. coli DH5α F- fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17

E. coli BL21(DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

E. coli JW5510 F- Δ(araD-araB)567 ΔlacZ4787(::rrnB-3)λ-ΔygjG763::kann rph-1 Δ(rhaD-rhaB)568 hsdR5rph-14

3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen

3.1.7.1. Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen (RbCl-Methode)

Tabelle 7: Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen.

TFBI-Puffer TFBII-Puffer

Kaliumacetat 0,59 g MOPS 0,21 g

RbCl 2,42 g RbCl 0,12 g

CaCl2 0,29 g CaCl2 1,1 g

MgCl2·4H2O 2,0 g Glycerin 37,8 g

Glycerin 37,8 g ddH2O 200 mL

ddH2O 200 mL pH 6,5 mit NaOH

pH 5,8 mit Essigsäure

3.1.7.2. Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese

Tabelle 8: Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese.

DNA-Ladepuffer 50x TAE-Puffer 0,7%ige Agaroselösung

Saccharose 4 g TRIS 0,21 g Agarose 3,5 g

Orange G 20 mg Essigsäure 57,1 mL 1x TAE-Puffer Ad 500 mL

ddH2O 10 mL EDTA 18,6 g

ddH2O ad 1 L

23 3.1.7.3. Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung

Tabelle 9: Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung.

Bindepuffer

Waschpuffer (5 mM Imidazol)

Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

KCl 22,4 g KCl 22,4 g KCl 22,4 g

Kpi-Puffer

(50 mM) ad 1 L Imidazol 342 mg Imidazol 34,2 g Kpi-Puffer

(50 mM) ad 1 L Kpi-Puffer

(50 mM) ad 1 L

3.1.7.4. Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

Tabelle 10: Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

6x SDS-Ladepuffer Coomassie

Färbelösung Coomassie Entfärbelösung

DTT 926 mg Ethanol 300 mL Ethanol 300 mL

Glycerin 3,78 g Essigsäure 100 mL Essigsäure 100 mL

SDS 1 g Coomassie 1 g ddH2O 600 mL

Bromphenol-blau 12 mg ddH2O 600 mL TRIS-HCl Puffer

pH 8,0 (350 mM) 10 mL

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