3. Material und Methoden
3.1. Materialien
3.1.1. Chemikalien
Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Sigma Aldrich und Fluka (Steinheim, DE), abcr GmbH (Karlsruhe, DE), VWR (Darmstadt, DE), Thermo Fisher (Braunschweig, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE), Fluorochem (Hadfield, UK) und Prozomix (Haltwhistle, UK) bezogen.
3.1.2. Vewendete Enzyme
Neben den selbst hergestellten Enzymen kamen auch einige kommerziell erhältliche Enzyme zum Einsatz (Tab. 1).
Tabelle 1: Verwendete Enzyme und deren Verwendung.
Enzym Herkunft Verwendung
PfuUltraII Fusion HS
DNA-Polymerase Agilent (Santa Clara, US) PCR, QuikChange-PCR Phusion High-Fidelity
DNA-Polymerase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly
T5-Exonuclease NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly Taq DNA-Ligase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly
Dpn1 NEB (Frankfurt, DE) Verdau von DNA-Templat
DNAseI (Rind) Sigma Aldrich (Steinheim,
DE) Enzymatischer
Zellaufschluss Lysozym aus Hühnereiweiß AppliChem GmbH
(Darmstadt, DE) Enzymatischer Zellaufschluss Peroxidase (Meerrettich) AppliChem GmbH
(Darmstadt, DE) Aktivitäts-Assay für Oxidasen
Glukose-6-P-Dehydrogenase aus
Leuconostoc mesenteroides
Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) Regeneration von NADPH und NADH
Formiat-Dehydrogenase
aus Candida boidinii Sigma Aldrich (Steinheim,
DE) Regeneration von NADH
18
3.1.3. Verwendete Kits
Für verschiedene molekular- und mikrobiologische Techniken wurden Anwendungsspezifische Kits verwendet, welche im Folgenden aufgeführt sind (Tab. 2).
Tabelle 2: Verwendete Kits und deren Verwendung.
Kit Herkunft Verwendung
ZyppyTM Plasmid Miniprep
Kit Zymo Research
(Irvine, US) Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
DNA Clean and
ConcentratorTM Zymo Research
(Irvine, US) DNA-Reinigung
ZymocleanTM Gel DNA
Recovery Kit Zymo Research
(Irvine, US) Extraktion von DNA aus einem Agarosegel PierceTM BCATM Protein
Assay Kit
Thermo Fisher (Braunschweig, DE)
Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration
3.1.4. Verwendete Plasmide
Für die heterologe Expression und Herstellung von Iminreduktasen (IREDs) und Putrescinoxidasen (PuOs) wurden drei verschiedene Expressionssysteme verwendet, sodass auch drei verschiedene Plasmide eingesetzt wurden (Tab 3).
Tabelle 3: Verwendete Plasmide.
Plasmid
Empfänger-stamm
Resistenz-marker Operon Verwendeter Induktor
An-wendung pET28a(+) E. coli DH5α /
E. coli BL21(DE3)
Kanamycin-Resistenz
Lactose-Operon IPTG IREDs
pBAD18[157] E. coli JW5510 Ampicillin-Resistenz
Arabinose-Operon L
(+)-Arabinose PuOs pBAD33[157] E. coli JW5510
Chlor- amphenicol-Resistenz
Arabinose-Operon L
(+)-Arabinose IREDs
19 3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer
Für das Einfügen von zielgerichteten Mutationen wurden verschiedene Techniken angewendet, wobei spezifische Oligonukleotide (Primer) eingesetzt wurden (Tab 4,5).
Alle Primer wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) bezogen.
Tabelle 4: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Kofaktorspezifität.
Ziel- Mutation
Verwen-detes Templat
Muta-genese Strategiea
Ange-wendete Technikb
Sequenz (5‘->3‘)
V = vorwärts, R = rückwärts
R33X, T34X,
K37X WT 3 B V: GTGGAACHVCRMKAAAGCCDAKAGCGAACCGCTGGCAAAACTG R: GTTCGCTMTHGGCTTTMKYGBDGTTCCACACCGTGGTCGTGTAG
N32X V1 2 A V: CACGACCACGGTGTGGNNKTACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTAMNNCCACACCGTGGTCGTG
K37X V1 2 A V: GAACTACGAGAAAGCCNNKAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTMNNGGCTTTCTCGTAGTTC
L67X V5 2 A V: CGTGGTTAATGTGNNKGATTATGACACCTCTGATC R: GATCAGAGGTGTCATAATCMNNCACATTAACCACG
T71X V5 2 A V: GTGCTGGATTATGACNNKTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGAMNNGTCATAATCCAGCAC
L75X V8 2 A V: GACACCTCTGATCAGNNKCTGCGCCAAGACGAAG R: CTTCGTCTTGGCGCAGMNNCTGATCAGAGGTGTC
N32E V3 1 A V: CACGACCACGGTGTGGGAATACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTATTCCCACACCGTGGTCGTG
R33Y WT 1 A V: CCACGGTGTGGAACTACACCAAAGCCAAAAGCG R: CGCTTTTGGCTTTGGTGTAGTTCCACACCGTGG
R37A V8 1 A V: GAATACGAGAAAGCCGCGAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTCGCGGCTTTCTCGTATTC
L67I V7 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG
T71V WT 1 A V: GTGCTGGATTATGACGTGTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGACACGTCATAATCCAGCAC
T71V V6 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:
1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an drei Positionen gleichzeitig.
b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:
A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly.
Tabelle 5: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Stereoselektivität. Die Mutationsstelle im Primer ist grau markiert.
Ziel-
Mutation Verwen-detes Templat
Muta-genese Strategiea
Ange-wendete Technikb
Sequenz (5‘->3‘)
V = vorwärts, R = rückwärts
A122V, T123P,
P124A V8 1 A V: CGGTGCGATCATG GTT CCG GCG GATTTTATTGGCCAG R: CTGGCCAATAAAATC CGC CGG AAC CATGATCGCACCG
D171Y V8 1 A V: CATGCCTCAGCACTG TAT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGCGCT ATA CAGTGCTGAGGCATG
M178F V8 1 A V: CCTGCTGTTTCAG TTC TGGGGCACCCTGTTC R: GAACAGGGTGCCCCA GAA CTGAAACAGCAGG
20 Q234D, T235V,
L236D V8 1 A V: CTGACCGCAGACGCT GAT GTG GAT GCAAGTCTGGAAGG R: CCTTCCAGACTTGC ATC CAC ATC AGCGTCTGCGGTCAG
H242G V8 1 A V: CAAGTCTGGAAGCT GGT AACGTGGCGTTC R: GAACGCCACGTT ACC AGCTTCCAGACTTG
S95X,
D171X V8 3 B
V: CAGCTGACC KHT GGTTCTCCGGCACTGGC R: CAGGGCGCT ADM CAGTGCTGAGGCATGACC V: CTCAGCACTG KHT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CGGAGAACC ADM GGTCAGCTGAACCAGCAG
I120X,
M121X V8 3 A V: CTGGACGGTGCG KHT KHT GCCACCCCGGATTTTATTG R: CAATAAAATCCGGGGTGGC ADM ADM CGCACCGTCCAG
A122X,
T123X V8 3 A V: GACGGTGCGATCATG KHT KHT CCGGATTTTATTGGC R: GCCAATAAAATCCGG ADM ADM CATGATCGCACCGTC
L175X,
M178X V8 3 A V: GACAGCGCCCTG KHC TTTCAG KHT TGGGGCACCCTG R: CAGGGTGCCCCA ADM CTGAAA GDM CAGGGCGCTGTC
A241X,
H242X V8 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGGCGTTCC R: GGAACGCCACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG
V212X V8 2 A V: CTGACCGAACCG NNK ACCCAGGGTGCCGTTG R: CGGCACCCTGGGT MNN CGGTTCGGTCAGTTTG
A237X V8 2 A V: GACGCTCAGACGCTG NNK AGTCTGGAAGCTCATAAC R: GAGCTTCCAGACT MNN CAGCGTCTGAGCGTCTG
M13X V8 2 A V: GTTATTGGCGCTGGCCGT NNK GGCTCCGCACTG R: CAGTGCGGAGCC MNN ACGGCCAGCGCCAATAAC
P124X V8 2 A V: CGATCATGGCCACC NNK GATTTTATTGGCCAGGC R: GCCTGGCCAATAAAATC MNN GGTGGCCATGATCG
A245X V8 2 A V: GGAAGCTCATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATGAGCTTCC
L170X, D171Y,
S172Q V8 1+2 A V: CATGCCTCAGCACTG NNK TAC CAG GCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGC CTG GTA MNN CAGTGCTGAGGCATG
A245X 15B7 2 A V: GGAAGTTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTCAAATATTCC
A241X,
H242X 110D2 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGTTGTTCC GGAACAACACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG
A241X 15B7 2 C
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA NDT TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA VHG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA TGG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG
H242X 15B7 2 C
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT NDT AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT VHG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT TGG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG
A241M,
H242X V8 1+2 C
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG NDT AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG VHG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG TGG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG
E240X,
N243X 15B7 3 B V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTG KHT GTTTAT KHT GTGGCGTTCCA ACACCTGCTGGCC
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG
V244X,
F246X 110C2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC
V244X, 15B7 1+3 A V: GTCTGGAAGTTTATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATAAACTTCCAGAC
21 A245C,
F246X V244X,
F246X 110D2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC
V244X, A245L,
F246X 24E4 1+3 A V: GTCTGGAAATTTATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATAAATTTCCAGAC
A245L D171Y 1 A V: GGAAGCTCATAACGTG TTG TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA CAA CACGTTATGAGCTTCC
A245X 24E4 2 A V: GTCTGGAAATTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATAAATTTCCAGAC
G96D,
S79X V8 1+2 A V: GTTCAGCTGACCAGC GAT NNK CCGGCACTGGCTC R: GAGCCAGTGCCGG MNN ATC GCTGGTCAGCTGAAC
T94X, G96D,
S79X V8 1+3 A V: CTGGTTCAGCTG KHT AGCGAT KHT CCGGCACTGGCTG R: CAGCCAGTGCCGG ADM ATCGCT ADM CAGCTGAACCAG
F246X 110D2 2 A V: GAAGCTCATAACGTG TTG NNK CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG MNN CAA CACGTTATGAGCTTC
A241X 23B3 2 A V: GCTGGCAAGTCTGGAA NNK TATAACGTGTTGTTCC R: GGAACAACACGTTATA MNN TTCCAGACTTGCCAGC
H242X 23B3 2 A V: GGCAAGTCTGGAAGTT NNK AACGTGTTGTTCCAAC R: GTTGGAACAACACGTT MNN AACTTCCAGACTTGCC
N243X 23B3 2 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT NNK GTGTTGTTCCAACACC R: GGTGTTGGAACAACAC MNN ATAAACTTCCAGACTTG
N243X
V244X 23B3 3 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT KHT KHT TTGTTCCAACACCTGC R: GCAGGTGTTGGAACAA ADM ADM ATAAACTTCCAGACTTG a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:
1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an zwei Positionen gleichzeitig.
b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:
A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly; C) Gibson assembly kombiniert mit „22c-trick”.[158]
3.1.6. Verwendete E. coli Stämme
Das Gen für R-IRED_Ms wurde im Rahmen eines früheren Projektes von GenSkript (Piscataway, US) synthetisiert und in einem pET28a(+)-Vektor geliefert. Deshalb wurde zunächst mit einem passenden Expressionsstamm (E. coli BL21(DE3)) gearbeitet, welcher das Gen für die nötige T7-Polymerase trägt. Für die Klonierungsarbeiten mit pET28a(+) wurde außerdem der Klonierungsstamm E. coli DH5α verwendet. Im weiteren Verlauf wurde das Gen in einen pBAD33-Vektor überführt. In diesem Plasmid standen auch weitere IREDs zur Verfügung, welche bereits in Vorarbeiten kloniert wurden. Für pBAD-Plasmide wurde der Stamm E. coli JW5510 aus der Keio-Collection[159] herangezogen, bei welchem die Gene der Abbauenzyme von
L(+)-Arabinose ausgeschaltet sind. Auch für die Arbeiten mit PuOs, welche in einem
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pBAD18-Vektor integriert waren, wurde E. coli JW5510 verwendet. Neben der Expression von IREDs und PuOs wurden auch sämtliche Klonierungsarbeiten in diesem Stamm durchgeführt. Tabelle 6 zeigt den Genotyp der verwendeten Stämme.
Tabelle 6: Genotypen der verwendeten E. coli Stämme.
Stamm Genotyp
E. coli DH5α F- fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17
E. coli BL21(DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
E. coli JW5510 F- Δ(araD-araB)567 ΔlacZ4787(::rrnB-3)λ-ΔygjG763::kann rph-1 Δ(rhaD-rhaB)568 hsdR5rph-14
3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen
3.1.7.1. Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen (RbCl-Methode)
Tabelle 7: Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen.
TFBI-Puffer TFBII-Puffer
Kaliumacetat 0,59 g MOPS 0,21 g
RbCl 2,42 g RbCl 0,12 g
CaCl2 0,29 g CaCl2 1,1 g
MgCl2·4H2O 2,0 g Glycerin 37,8 g
Glycerin 37,8 g ddH2O 200 mL
ddH2O 200 mL pH 6,5 mit NaOH
pH 5,8 mit Essigsäure
3.1.7.2. Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese
Tabelle 8: Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese.
DNA-Ladepuffer 50x TAE-Puffer 0,7%ige Agaroselösung
Saccharose 4 g TRIS 0,21 g Agarose 3,5 g
Orange G 20 mg Essigsäure 57,1 mL 1x TAE-Puffer Ad 500 mL
ddH2O 10 mL EDTA 18,6 g
ddH2O ad 1 L
23 3.1.7.3. Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung
Tabelle 9: Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung.
Bindepuffer
Waschpuffer (5 mM Imidazol)
Elutionspuffer (500 mM Imidazol)
KCl 22,4 g KCl 22,4 g KCl 22,4 g
Kpi-Puffer
(50 mM) ad 1 L Imidazol 342 mg Imidazol 34,2 g Kpi-Puffer
(50 mM) ad 1 L Kpi-Puffer
(50 mM) ad 1 L
3.1.7.4. Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE
Tabelle 10: Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE
6x SDS-Ladepuffer Coomassie
Färbelösung Coomassie Entfärbelösung
DTT 926 mg Ethanol 300 mL Ethanol 300 mL
Glycerin 3,78 g Essigsäure 100 mL Essigsäure 100 mL
SDS 1 g Coomassie 1 g ddH2O 600 mL
Bromphenol-blau 12 mg ddH2O 600 mL TRIS-HCl Puffer
pH 8,0 (350 mM) 10 mL
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