mit Iminreduktasen
Von der Fakultät 4: Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart genehmigte Abhandlung zur Erlangung der Würde eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Vorgelegt von
Niels Borlinghaus
aus Wuppertal
Hauptberichter: Prof. Dr. Bernhard Hauer Mitberichter: Prof. Dr. Albert Jeltsch Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors
Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2019
Institut für Biochemie und Technische Biochemie Abteilung Technische Biochemie
III
Folgende Fachartikel wurden im Rahmen dieser Arbeit veröffentlicht:
M. Lenz, N. Borlinghaus, L. Weinmann, B. M. Nestl „Recent advances in imine reductase catalyzed reactions.“ World J. Microbiol. Biotechnol. 2017, 33, 199.
N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Switching the Cofactor Specificity of an Imine Reductase.“
ChemCatChem 2018, 10, 183–187.
N. Borlinghaus, S. Gergel, B. M. Nestl „Biocatalytic Access to Piperazines from Diamines
and Dicarbonyls.” ACS Catal. 2018, 8, 3727–3732.
A. Al-Shameri, N. Borlinghaus, L. Weinmann, P. N. Scheller, B. M. Nestl, L. Lauterbach „Synthesis of N-heterocycles from diamines via H2-driven NADPH recycling in the presence
of O2.“ Green Chem. 2019, 21, 1396–1400.
N. Borlinghaus, L. Weinmann, F. Krimpzer, P. Scheller, A. Al-Shameri, L. Lauterbach,
A.-S. Coquel, C. Lattemann, B. Hauer, B. Nestl „Cascade biotransformation to access 3-methylpiperidine in whole cells.“ ChemCatChem. 2019, 11, 5738– 5742.
N. Borlinghaus, S. Gergel, Bettina M. Nestl, F. Thol, H. Penders “Preparation of imine
reductases at 15L scale and their application in asymmetric piperazine synthesis”, accepted book chapter for „Practical methods for Biocatalysis and Biotransformations 3”, edited by J. Whittall and P. W. Sutton, published by Wiley-VCH.
N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Reductive Hydrazinations with Imine Reductases”
V
I. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel „Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen“ selbstständig verfasst habe, und dass ich keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle wörtlich oder sinngemäß aus anderen Werken übernommenen Aussagen sind als solche gekennzeichnet worden. Des Weiteren bestätige ich, dass die vorgelegte Arbeit nicht in gleicher oder ähnlicher Form bei einer anderen Institution zur Erlangung eines akademischen Grades eingereicht wurde
I. Declaration of Authorship:
I hereby declare that the present thesis entitled “Generation of saturated N-Heterocycles with imine reductases” is the result of my own work, that all sources used or quoted have been indicated, and that I have not used any illegitimate means. I further declare that I have not submitted this thesis for a degree in some form or another.
Korntal, 05.07.2019
VI
II. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herr Prof. Dr. Bernhard Hauer bedanken, der mich als Doktorand in seinen Arbeitskreis aufgenommen hat und mir die Bearbeitung dieses spannenden Themas überlassen hat. Weiterhin möchte ich mich für die Unterstützung und die Ermutigung während meiner Arbeit bedanken. Auch für die vielen Freiheiten, die ich in meiner Forschung hatte, und das damit verbundene Vertrauen, möchte ich mich bedanken.
Herrn Prof. Dr. Albert Jeltsch und Herrn Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors danke ich herzlich für die Übernahme des Zweitgutachters, bzw. für die Übernahme des Prüfungsvorsitzenden.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Bettina Nestl für die hervorragende Betreuung während meiner gesamten Zeit als Doktorand. Vor allem für die fachliche Unterstützung und den Austausch über theoretische und praktische Fragestellungen, sowie für die Überarbeitung von Manuskripten und die Überarbeitung dieser Arbeit möchte ich mich herzlich bedanken. Danken möchte ich auch für deine ständige und unermüdliche Motivation in allen Phasen dieses Projektes.
Ein weiterer Dank gilt Dr. Bernd Nebel für die fachliche Unterstützung bei analytischen Fragestellungen, sowie für die Sicherstellung einer funktionierenden Analytik.
Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Kooperationspartnern Dr. Oliver Lenz,
Dr. Lars Lauterbach und Ammar Al-Shameri an der TU Berlin. Hierbei möchte ich
mich vor allem für die enge und produktive Zusammenarbeit bedanken, sowie für den fachlichen Austausch. Auch für die herzliche Aufnahme bei meinen Aufenthalten in Berlin möchte ich mich bedanken.
Ein weiterer Dank geht an meine Kollegen aus dem IRED-Team (Maike Lenz, Philipp
Scheller, Leonie Weinmann und Bettina Nestl). Dies war eine sehr lehrreiche und
produktive Zusammenarbeit für mich.
Auch möchte ich mich bei den Kollegen des Rosalind-Franklin-Labors (Sebastian
Gergel, Benjamin Aberle, Ludwig Bengel, Maike Lenz, Julia Halder, Sara Hoffman, Lars Hinner) für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre und die vielen fachlichen
VII Darüber hinaus möchte ich mich bei allen Kolleginnen und Kollegen bedanken, mit denen ich in den letzten drei Jahren zusammen arbeiten durfte. Bei euch bedanke ich mich vor allem für die angenehme Atmosphäre und die Hilfsbereitschaft im Laboralltag, sowie für die Bereitschaft sich jederzeit über fachliche und technische Problemstellungen auszutauschen.
Bedanken möchte ich mich auch bei den Studenten Sebastian Gergel, Andreas Reichl,
Phillip Jegl und Steffen Bernhard, welche in verschieden Bereichen dieses Projektes
beteiligt waren und von mir betreut wurden.
Auch bedanken möchte ich mich bei der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) für die finanzielle Unterstützung dieses Projektes.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner großartigen Frau Mareike bedanken, die mich stets voll und ganz bei meiner Arbeit unterstützte.
VIII
III. Inhaltsverzeichnis
I. Eidesstattliche Erklärung ... V II. Danksagung ... VI III. Inhaltsverzeichnis ... VIII IV. Abkürzungsverzeichnis ... XIII V. Zusammenfassung ... XIV V. Abstract ... XVII
1. Einleitung ... 1
1.1. Biokatalyse ... 1
1.2. N-Heterozyklen ... 2
1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine ... 3
1.2.2. Piperazine ... 4
1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen ... 6
1.4. Iminreduktasen ... 7
1.4.1. Reaktionsmechanismus ... 9
1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen... 11
1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten ... 13
1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen ... 14
2. Motivation ... 16
3. Material und Methoden ... 17
3.1. Materialien ... 17 3.1.1. Chemikalien ... 17 3.1.2. Vewendete Enzyme ... 17 3.1.3. Verwendete Kits ... 18 3.1.4. Verwendete Plasmide ... 18 3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer ... 19
IX
3.1.6. Verwendete E. coli Stämme ... 21
3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen ... 22
3.2. Molekularbiologische Methoden ... 24
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 24
3.2.2. Klonierung mittels Gibson assembly ... 25
3.2.3. Ortsgerichtete Mutagenese mittels Gibson assembly ... 25
3.2.4. Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuikChangeTM ... 26
3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese ... 26
3.2.6. Herstellung chemisch kompetenter Zellen ... 27
3.2.7. Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen ... 27
3.2.8. Plasmidisolierung aus E. coli ... 28
3.2.9. DNA-Sequenzierung ... 29
3.3. Kultivierung und Protein-Expression ... 29
3.3.1. Verwendete Kulturmedien ... 29
3.3.2. Expression von IREDs im Schüttelkolben ... 30
3.3.3. Expression von PuOs im Schüttelkolben ... 31
3.3.4. Toxizitätsstudie in E. coli JW5510 ... 31
3.4. Proteinreinigung und Validierung ... 32
3.4.1. Zellaufschluss ... 32
3.4.2. Co2+-basierte Affinitätschromatographie ... 32
3.4.3. Proteinkonzentrationsbestimmung ... 34
3.4.4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 34
3.5. Bestimmung der Enzymaktivität... 35
3.5.1. Photometrischer NAD(P)H-Assay für IREDs ... 35
3.5.2. Photometrische Analyse kinetischer Parameter für IREDs ... 37
3.5.3. Photometrischer NAD(P)H -Assay für Alkoholdehydrogenasen ... 38
X
3.5.5. In vitro Biotransformationen mit IREDs ... 40
3.5.6. In vitro Biotransformationen mit kontinuierlicher Substratzugabe ... 43
3.5.7. In vitro Biotransformationen mit Enzymkaskaden ... 44
3.6. In vivo Biotransformation in E.coli JW5510 ... 46
3.7. Probenaufarbeitung (Extraktion und Derivatisierung) ... 46
3.8. Screening-Systeme ... 50
3.8.1. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Kofaktorspezifität ... 50
3.8.2. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit erhöhter Aktivität für Substrate mit niedriger Anfangsaktivität ... 52
3.8.3. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Stereoselektivität ... 54
3.9. Analytische Methoden ... 55
3.9.1. Gaschromatographie (GC) ... 56
3.9.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ... 59
3.10. Bioinformatische Methoden ... 60
3.10.1. Erstellung eines Homologiemodells ... 60
3.10.2. Docking, Energieminimierung und MD-refinements mit Yasara ... 60
3.10.3. Multisequenzalignments ... 60
3.10.4. Strukturalignments ... 61
4. Ergebnisse ... 62
4.1. Asymmetrische Reduktion von zyklischen Iminen ... 62
4.1.1. Vergleich der kinetischen Parameter von R-IRED_Ms mit R-IRED_Sr für Modellsubstrate... 62
4.1.2. Testen neuer Iminsubstrate ... 63
4.2. Reduktive Aminierung ... 64
4.2.1. Reduktive Aminierung mit ausgewählten Beispielsubstraten ... 65
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4.3. Doppelte reduktive Aminierung ... 69
4.3.1. Studien zur Aufklärung des Reaktionsweges ... 72
4.3.2. Aktivitätsvergleich mit R-IRED_Sr und S-IRED_Pe ... 74
4.3.3. Untersuchung des Substratspektrums ... 75
4.3.4. Quantifizierung, Upscaling und Produktisolierung ... 77
4.3.5. Aktivitätssteigerung durch Verwendung von Additiven ... 79
4.3.6. Toxizitätsstudie ... 81
4.3.7. In vivo Biotransformationen ... 83
4.3.8. Verwendung von α-Ketosäureester an Stelle von Dicarbonylen ... 85
4.3.9. Verwendung von α-Hydroxycarbonylen an Stelle von Dicarbonylen ... 86
4.3.10. Doppelte reduktive Hydrazinierung ... 89
4.4. Bildung von N-Heterzyklen mithilfe von Enzymkaskaden ... 91
4.4.1. Enzymkaskade mit Putrescinoxidase und IRED ... 91
4.4.2. Enzymkaskade mit Alkoholdehydrogenasen oder Alkoholoxidasen und R-IRED_Ms ... 95
4.5. Entwicklung von NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Varianten ... 98
4.5.1. Weiterführende Untersuchung von Varianten V8 und V10 ... 100
4.5.2. Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und R-IRED_Ms-V8 ... 103
4.6. Mutationsstudie zur Identifizierung von Stereoselektivitäts-bestimmenden Aminosäurepositionen ... 104
5. Diskussion ... 111
5.1. Charakterisierung von R-IRED_Ms... 111
5.2. Reduktive Hydrazinierung... 113
5.3. Doppelte reduktive Aminierung ... 115
5.4. Doppelte reduktive Hydrazinierung ... 119
5.5. Verwendung von Additiven zur Steigerung der Enzymaktivität ... 119
XII
5.7. Änderung der Kofaktorspezifität ... 121
5.8. Änderung der Stereoselektivität... 126
6. Ausblick ... 131
7. Anhang ... 133
7.1. Archivierte Plasmide ... 133
7.2. Aminosäure- und DNA-Sequenzen ... 133
7.2.1. DNA-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus .... 133
7.2.2. Aminosäure-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus (WT) ... 134
7.2.3. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V8 ... 134
7.2.4. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V10 ... 134
7.2.5. Aminosäure-Sequenz von R-IRED_Ms-Variante 44A2 (veränderte Stereoselektivität) ... 135
7.2.6. Plasmidkarte von pBAD33_R-IRED_Ms-His6 ... 135
7.3. Beispielhafte SDS-Gele ... 136
7.4. Beispielhafte Chromatogramme ... 137
7.5. Mögliche Substratorientierungen für die Bildung von enantiokomlementären Produkten ... 140
8. Literaturverzeichnis ... 141
XIII
IV. Abkürzungsverzeichnis
Å Ångström 1 Å =10−10 m HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatograohie
ABTS 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) HRP horseradish peroxidase
ACN Acetonitril IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ADH Alkoholdehydrogenase IRED Iminreduktase
ADP Adenosindiphosphat kb Kilobasen
AO Alkoholoxidase KBE Koloniebildende Einheiten APS Ammoniumpersulfat kDa Kilodalton
ATP Adenosintriphosphat Kpi Kaliumphosphat AU Absorptionseinheiten LB lysogeny broth
β-HAD β-Hydroxysäuredehydrogenase M Molar (mol L-1)
BCA Bicinchoninsäure MeOH Methanol
BSA bovine serum albumin MD molecular dynamics
C Kohlenstoff MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure CMC Kritische Mizellbildungskonzentration MS Massenspektrometrie(-Detektor) Co Cobalt MTBE tert-Butyl-Methylether
CV Säulenvolumen N Stickstoff
DAD Diodenarray-Detektor NAD(P)H Nikotinamidadenindinukleotid(phosphat) DCM Dichlormethan NH3 Amoniak
ddH2O Doppelt deionisiertes Wasser NMR Kernspinresonanz(-Messung) de Diastereomerenüberschuss O2 Molekularer Sauerstoff
DHFR Dihydrofolatreduktase OD600 Optische Dichte bei λ = 600 nm
DMSO Dimethylsulfoxid P2CR Pyrrolin-2-carboxylatreduktase DNA Desoxyribonukleinsäure PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat PCR Polymerasenkettenreaktion
dr Diastereomerenverhältnis PDB Proteindatenbank DRR Dihydroreticulinreduktase PEG Polyethylenglycol DTT Dithiothreitol PP Pyrophosphat
E. coli Escherichia coli PuO Putrescinoxidase
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure rr Regioisomerenverhältnis
ee Enantiomerenüberschuss RT Raumtemperatur ELAA Ethyl-4-chloroacetoacetat SDS Natriumdodecylsulfat
EtOH Ethanol SDR short chain dehydrogenase/reductase
F420 Koenzym F420 SH Lösliche Hydrogenase
FDH Formiatdehydrogenase TAE TRIS-Acetat-EDTA FE Flächeneinheiten TB Terrific Broth
FID Flammenionisationsdetektor TIRED Thiazolinyl Iminreduktase G6P Glukose-6-phosphat TOF turnover frequency
G6PDH Glukose-6-phosphatdehydrogenase TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan GC Gaschromatograph(ie) U Unit (1 U ≙ 1µmol min-1)
H2 Molekularer Wasserstoff WT Wildtyp
XIV
V. Zusammenfassung
Gesättigte N-Heterozyklen sind sehr gefragte Verbindungen, die als Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika und Agrochemikalien eingesetzt werden. Insbesondere die Bereitstellung von chiralen Vorstufen gilt in der organischen Chemie als sehr herausfordernd. Immer häufiger setzt man deshalb Biokatalysatoren ein, welche sich durch ihre exzellente Stereo-, Regio- und Chemoselektivität auszeichnen. Für die enzymvermittelte Generierung von chiralen, gesättigten N-Heterozyklen sind nur wenige Enzyme bekannt, von denen die meisten zu spezifisch sind, um sie abseits ihrer natürlichen Funktion einzusetzen. Iminreduktasen (IREDs) hingegen erwiesen sich in letzter Zeit als sehr vielversprechende Biokatalysatoren mit vergleichsweise breitem Substratspektrum. Die Entwicklung von neuen und bereits bestehenden IRED-basierten Biotransformationen zur Herstellung chiraler N-Heterozyklen ist deshalb ein Forschungsgebiet mit großem Potenzial.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Reaktions- und Produktspektrum von IREDs erheblich erweitert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und die Erschließung neuer Substratfamilien ermöglichte die Bildung von N-Heterozyklen, welche zuvor enzymatisch nicht zugänglich waren. Erstmals wurde eine IRED katalysierte, doppelte reduktive Aminierung angewendet, bei welcher Diamine und Dicarbonyle zu Piperazin Heterozyklen oder Piperazin-ähnlichen Produkten umgesetzt wurden. Die verwendeten Substratgruppen stellen hochreaktive Substanzen dar, welche ohne die Anwesenheit von IREDs rasch zu diversen Nebenprodukten abreagieren. Durch die Verwendung von IREDs konnte die Nebenproduktbildung hingegen fast vollständig unterdrückt werden, da die Substrate kontrolliert und mit hoher Aktivität umgesetzt wurden. Dabei konnten ausgezeichnete Produktbildungen von bis zu > 99%, sowie Stereoselektivitäten von bis zu > 99% und Regioselektivitäten von bis zu > 99% erreicht werden. Die Durchführung von spezifischen Kontrollexperimenten führte außerdem zu ersten Hinweisen bezüglich der Abfolge der einzelnen Katalyseschritte. Eine besonders hohe Aktivität und ein sehr breites Substratspektrum gegenüber dieser neuartigen Applikation wurde bei der R-selektiven IRED aus Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms) festgestellt. So konnten 84 verschiedene Produkte gebildet werden. Neben Piperazinen konnten auch Homopiperazine (Diazepane), sowie bi- und trizyklische Produkte gebildet werden. Dabei war es möglich an allen sechs Positionen des Piperazinrings unterschiedliche
XV Substituenten einzuführen. In Up-Scaling Experimenten mit 50 mM Substrat konnten bis zu 8,1 g L-1 Produkt gebildet und eine isolierte Ausbeute von bis zu 87% erreicht werden.
Durch die Kombination von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen, sowie durch die Verwendung von Hydrazinen anstelle von Diaminen, konnte das Substrat- und Produktspektrum zusätzlich erweitert werden. So konnte beispielsweise erstmals (S)-2-Hydroxymethylpiperazin ausgehend von Dihydroxyaceton und Ethylendiamin gebildet werden. Des Weiteren gelang die Bildung von Hexahydropyridazinen und 1,2-Diazepanen mit Hilfe von Hydrazinen und Dicarbonylen.
Weitere sehr bedeutsame N-Heterozyklen sind Pyrrolidine und Piperidine. Durch die Anwendung einer Enzymkaskade mit einer Putrescinoxidase und einer IRED konnten verschiedene 1‘-, 2‘- und 3‘-substituierte Pyrrolidine und Piperidine ausgehend von Diaminen gebildet werden. Dabei konnten Produktbildungen von bis zu 99% und Stereoselektivitäten von bis zu 93% (ee) erreicht werden. Auf diesem Weg gelang auch die Bildung von N-Methylpyrrolidin, welches ein tertiäres, zyklisches Aminprodukt ist und durch andere alternative Enzymkaskaden bislang nicht zugänglich war.
Ein weiterer Schritt zur Verbesserung der Anwendbarkeit von IREDs war die Generierung einer NADH-abhängigen IRED-Variante. Bislang sind nur NADPH-abhängige IREDs bekannt, jedoch hat die Verwendung von NADH gegenüber NADPH einige Vorteile. So ist NADH deutlich günstiger und stabiler als NADPH. Außerdem stehen effizientere und kostengünstigere Kofaktor-Regenerationssysteme zur Verfügung.
Durch die Mutagenese der Aminosäurereste an den Positionen N32, R33, T34, K37, L67 und T71 in R-IRED_Ms, sowie durch die photometrische Untersuchung von über 1800 Kolonien konnten einige vielversprechende Varianten identifiziert werden. Die besten Varianten V8, V9 und V10 zeigten eine bis zu 2900-fach gesteigerte NADH/NADPH Spezifität, sowie bis zu 100% Aktivität mit NADH verglichen mit dem Wildtypenzym und NADPH.
Die durchgeführten Studien mit R-IRED_Ms zeigen ein einzigartiges Reaktions- und Substratspektrum. Für einige Pharmabausteine wird jedoch eine enantiokomplementäre IRED benötigt, um das gefragte Produktenantiomer zu bilden. Eine S-selektive IRED mit
XVI
ähnlichen Eigenschaften zu finden könnte jedoch sehr aufwendig sein. Es wurde deshalb versucht die Stereoselektivität von R-IRED_Ms durch enzyme engineering zu ändern, in der Hoffnung, dass die Eigenschaften gegenüber dem Substrat- und Reaktionsspektrum erhalten bleiben. In einem enantio-sensitiven Screening mit über 3000 Kolonien konnte eine neue Region identifiziert werden, welche einen starken Einfluss auf die Stereoselektivität des Enzyms hat. Die Variante 44A2 mit fünf Mutationen in dieser Region zeigte einen Enantiomerenüberschuss von 91% (S) gegenüber der Bildung von 2-Methylpyrrolidin. Im Vergleich zum Wildtyp (>99% R) wurde die Stereoselektivität somit fast vollständig umgekehrt. Es zeigte sich, dass die eingeführten Aminosäurereste in Variante 44A2 eine substratspezifische Stereoselektivitätsänderung bewirken. Es konnte jedoch noch nicht geklärt werden, welche Interaktionen letztendlich für die substratabhängige Änderung der Selektivität verantwortlich sind.
Insgesamt konnte durch diese Arbeit die Anwendbarkeit und das Verständnis gegenüber IREDs verbessert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und Reaktionen, sowie die Mutagenesestudien zeigen, dass IREDs sehr vielseitige Biokatalysatoren mit erstaunlichen Fähigkeiten sind. Vor allem für die Bildung von N-Heterozyklen weisen sie ein großartiges Potenzial auf, das im Bereich der Biokatalyse bislang einzigartig ist und in Zukunft stark an Bedeutung gewinnen könnte.
XVII
V. Abstract
Saturated N-heterocycles are highly demanded compounds that are used as building blocks for the synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In particular, the provision of chiral precursors is very challenging in organic chemistry. Therefore, biocatalysts with excellent stereo-, regio- and chemoselectivity are increasingly used. Only a few enzymes are known for the enzyme-mediated generation of chiral, saturated N-heterocycles. Most of them are very specific demonstrating activity towards the natural substrates. In contrast, imine reductases (IREDs) have recently proven to be very promising biocatalysts with a broad substrate scope. Therefore, the development of new and existing IREDs for the production of chiral N-heterocycles is a field of research with great potential.
In this work, the reaction and product spectrum of IREDs could be considerably expanded. The development of new methods and the use of new substrate families enabled the formation of N-heterocycles, which were previously not accessible by biocatalytic approaches. For the first time, an IRED-catalyzed double reductive amination was applied, in which diamines and dicarbonyls were directly converted to piperazine heterocycles or piperazine-like products. The used substrates represent highly reactive substances which rapidly react, without the presence of IREDs, to various by-products. By using IREDs, however, the by-product formation could be almost completely suppressed because the substrates were controlled and reacted with high activity. Excellent product formations of up to > 99%, stereoselectivities of up to > 99% as well as regioselectivities of up to > 99% were achieved. The performance of specific control experiments also led to initial indications regarding the sequence of the individual catalysis steps. Particularly high activity and a broad substrate spectrum were observed for the R-selective IRED from Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms). Thus 84 different products could be formed. In addition to piperazines and homopiperazines (diazepanes), bi- and tricyclic products could also be generated. Thereby, it was possible to introduce different substituents at all six positions of the piperazine moiety. In up-scaling experiments with 50 mM substrate, up to 8.1 g L-1 product could be formed, and an isolated yield of up to 87% could be achieved.
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The combination of α-hydroxycarbonyls with diamines, as well as the use of hydrazines instead of diamines, further expanded the substrate and product spectrum. For example, (S)-2-hydroxymethyl piperazine could be formed for the first time from dihydroxyacetone and ethylenediamine. Furthermore, hexahydropyridazines and 1,2-diazepanes were formed from hydrazines and dicarbonyls.
Other very important N-heterocycles are pyrrolidines and piperidines. By applying an enzyme cascade combining a putrescine oxidase with an IRED, different 1'-, 2'- and 3'-substituted pyrrolidines and piperidines could be formed from diamines. Product formations of up to 99% and stereoselectivities of up to 93% (ee) could be achieved. In this way, the formation of N-methyl pyrrolidine, which is a tertiary cyclic amine product and has not been accessible through other alternative enzyme cascades, was also successfully generated.
A further step to improve the applicability of IREDs was the generation of an NADH-dependent IRED variant. So far only NADPH-NADH-dependent IREDs are known, but the use of NADH has some advantages over NADPH. NADH is much cheaper and more stable than NADPH. Besides, more efficient and cost-effective cofactor regeneration systems are available.
By mutagenesis of amino acid residues at positions N32, R33, T34, K37, L67 and T71 in R-IRED_Ms, and by photometric analysis of over 1800 colonies, promising variants could be identified. The best variants V8, V9, and V10 showed up to 2900-fold increased NADH/NADPH specificity and up to 100% activity with NADH compared to wild type enzyme and NADPH.
The studies performed with R-IRED_Ms show a remarkable reaction and substrate spectrum. However, for some pharmaceutical building blocks, enantiocomplementary IREDs are required to form the desired S- as well as R-product enantiomers. In this light, finding an S-selective IRED with similar properties remains challenging. As an alternative, the stereoselectivity of R-IRED_Ms was changed with enzyme engineering. In an enantio-sensitive screening with over 3000 colonies, a new region could be identified, which has a strong influence on the stereoselectivity. The variant 44A2 with five mutations in this region showed an enantiomeric excess of 91% (S) for the formation of 2-methylpyrrolidine. Thus, the stereoselectivity was almost completely reversed compared to the wild type (> 99% R). By further experiments, it was shown
XIX that the amino acid residues introduced in variant 44A2 caused a substrate-specific change in stereoselectivity. However, it has not yet been clarified, which specific interactions are responsible for the substrate-dependent change in selectivity.
Overall, this work improved the applicability and understanding of IREDs. The development of new methods and reactions as well as the mutagenesis studies show that IREDs are very versatile biocatalysts with incredible capabilities. Especially for the formation of N-heterocycles, they show great potential, which is unique in the field of biocatalysis and could gain more and more importance in the future.
1
1. Einleitung
Der weltweite Bedarf an Feinchemikalien ist enorm. Insbesondere in der pharmazeutischen Industrie werden ständig neue komplexe chemische Bausteine benötigt, sodass auch neue Herstellungsverfahren entwickelt werden müssen.[1] Besonders herausfordernd ist dabei der Umstieg auf nachwachsende Rohstoffe, da die meisten etablierten chemischen Prozesse auf fossilen Ressourcen basieren.[2,3] Außerdem müssen für die Herstellung von komplexen Feinchemikalien oft zahlreiche Prozessschritte mit teils niedriger Effizienz und hohem Energiebedarf angewendet werden, was die Nachhaltigkeit zusätzlich verschlechtert.[4] Die Nachfrage für alternative, bioökonomische Prozesse ist deshalb sehr hoch, sodass chemische Verfahren zunehmend durch biotechnologische Ansätze ersetzt werden.[5–7] Die Verwendung von Enzymen oder ganzen Zellen als Biokatalysatoren gewinnt deshalb in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung.[8–15]
1.1. Biokatalyse
Im Fokus der Biokatalyse stehen Enzyme und deren Fähigkeit spezifische Reaktionen katalysieren zu können.[16,17] Es handelt sich somit um ein naturwissenschaftliches Feld, das die Fachbereiche Biotechnologie und Chemie verbindet. Der größte Vorteil von enzymvermittelten Reaktionen gegenüber chemischen Reaktionen ist die meist hohe natürliche Selektivität von Enzymen. So können chemo-, regio- und stereoselektive Biotransformationen gewährleistet werden.[18–21] Des Weiteren bietet eine biokatalytische Applikation die Möglichkeit zu nachhaltigeren und umweltfreundlicheren Prozessen.[7,22,23] Weitere Vorteile sind die Evolvierbarkeit und Kombinierbarkeit von Enzymen.[18,24] Dennoch gibt es auch einige Nachteile von Biokatalysatoren gegenüber chemischen Katalysatoren. Die Verfügbarkeit von Enzymen ist beschränkt und häufig weisen sie ein vergleichsweise schmales Substratspektrum auf.[17] Auch die Stabilität und Aktivität von Enzymen unter nicht natürlichen Gegebenheiten ist oft ein limitierender Faktor.[25] Einige Enzyme sind außerdem abhängig von teuren Kofaktoren, sodass diese in einem Prozess bereitgestellt werden müssen.[17] Durch den Einsatz von Ganzzellsystemen oder enzymatischen Kofaktor-Regenerationssystemen kann die Bereitstellung von Kofaktoren zwar deutlich reduziert werden,[26–29] jedoch ist dies nicht immer erfolgreich.
2
Weltweit arbeiten Forschergruppen an der Verbesserung von biokatalytischen Systemen um die Anwendbarkeit von Enzymen zu verbessern. Durch ein sogenanntes „enzyme engineering“ können einige der erwähnten Schwachstellen adressiert werden. Die zur Verfügung stehenden Technologien für die Entwicklung von Enzymen haben sich in den letzten Jahren maßgeblich verbessert, was zuletzt sogar zur Verleihung des Chemienobelpreis an Prof. Frances H. Arnold geführt hat.[30] Das Prinzip beim enzyme engineering ist die zyklische Anwendung von Mutagenese, Genexpression und Selektion, um die Eigenschaften von Enzymen gezielt zu verändern.[31–34] Zahlreiche Studien zeigen, dass beispielsweise Stabilität und Aktivität deutlich verbessert werden können.[35,36] Auch das Substratspektrum und die Selektivität von Enzymen kann über ein enzyme engineering verändert und erweitert werden.[37–41] Zusätzlich sorgt die Identifizierung neuer natürlich vorkommender Enzyme für eine stetig steigende Verfügbarkeit von Biokatalysatoren. Auch die Entwicklung nicht natürlicher Enzymaktivitäten,[42–44] sowie die Entwicklung von artifiziellen Enzymen (denovo design)[45] tragen dazu bei, dass immer mehr neue und verbesserte Enzymsysteme für industrielle Applikationen zur Verfügung stehen.[13]
1.2. N-Heterozyklen
N-Heterozyklen sind zyklische organische Verbindungen, deren Ringsysteme neben Kohlenstoffen aus mindestens einem Stickstoffatom bestehen. Solche Verbindungen sind in der Natur weit verbreitet und für Organismen jeglicher Art lebensnotwendig.[46] Das Vorkommen von N-Heterozyklen in Lebewesen ist breit gefächert. Essentielle Komponenten sind z.B. die Pyrimidin- und Purinbasen der DNA, die Aminosäuren Prolin, Histidin und Tryptophan, sowie verschiedene Porphyrine und andere Kofaktoren. Daneben gibt es eine Vielzahl an komplexen Sekundärmetaboliten, bei denen N-Heterozyklen als Grundbausteine auftreten.[47] Solche Verbindungen machen einen Großteil der sogenannten Alkaloide aus und haben typischerweise sehr spezifische biologische Wirkungen.[48,49] Besonders bekannt sind beispielsweise einige Opioide, welche durch ihre spezifische Bindung an verschiedenen Rezeptoren des Nervensystems eine schmerzlindernde Wirkung erzeugen.[50] Über 20.000 Alkaloide sind bereits beschrieben worden.[51] Die meisten dieser Verbindungen enthalten die im Folgenden abgebildeten N-Heterozyklen (Abb.1).[49,52]
3 Abbildung 1: Häufig auftretende N-Heterozyklen in Alkaloiden. Die wichtigsten Alkaloid-Gruppen
wurden anhand der strukturellen Verwandtschaft (ohne Berücksichtigung des Biosynthesewegs) zugeordnet. Weitere wichtige Alkaloid-Gruppen sind die Phenylethylamino-Alkaloide, welche in der Regel keinen N-Heterozyklus enthalten, sowie die Terpenoid- und Stereoid-Alkaloide, welche nicht zu einem bestimmten N-Heterozyklus zugeordnet werden können.
1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine
Auch in der Entwicklung von pharmazeutischen Wirkstoffen macht man sich die biologische Wirksamkeit von N-Heterozyklen zu Nutze. So enthalten drei Viertel der 120 umsatzstärksten niedermolekularen Pharmazeutika aus 2018 einen N-Heterozyklus.[53] Ein wichtiger Ausgangspunkt für nachfolgende Syntheseschritte in der Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen ist deshalb die Bildung eines N-Heterozyklus. Hierfür existieren teilweise gut etablierte chemische Verfahren. Häufig werden vor allem fünf- und sechsgliedrige Heterozyklen mit unterschiedlichen Sättigungsgraden benötigt (Abb.2).[54] Die chemische Herstellung aromatischer N-Heterozyklen kann z.B. über eine Paal-Knorr- Synthese[55] oder eine Michael-Addition[56] erfolgen. Für nicht aromatische N-Heterozyklen existieren andere chemische Verfahren, die häufig miteinander kombiniert werden müssen. Der mehrstufige Prozess beinhaltet dabei zum Beispiel Metall katalysierte Zyklisierungen, C-H-Aminierungen, Hydroaminierungen, Ring-Transformationen, oder Imin- bzw. Enamin- Reduktionen.[57–59]
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Abbildung 2: Die fünf häufigsten N-Heterozyklen bezogen auf 640 N-heterozyklische Pharmazeutika
(modifiziert nach E. Vitaku et al.).[54] Neben Pyridinen (blau, aromatisch) zählen vier nicht aromatische N-Heterozyklen (Piperidine, Piperazine, Cepheme, Pyrrolidine, rot) zu den fünf häufigsten Vertretern. Der
angegebene prozentuale Anteil bezieht sich auf die 640 analysierten N-heterozyklischen Pharmazeutika (zugelassen in den USA).
Eine zusätzliche Herausforderung sind C-substituierte gesättigte Heterozyklen, da bei diesen Verbindungen Stereozentren existieren. Somit müssen stereoselektive Verfahren eingesetzt werden um ein pharmazeutisches Endprodukt mit möglichst hoher Enantiomerenreinheit zu erhalten.[60] Dies ist jedoch in einem rein chemischen Prozess meist aufwendig und nur mit Hilfe von aufwendigen Verfahren oder teuren Katalysatoren realisierbar.[57,58,61,62] Die Identifizierung und Entwicklung von Enzymen zur biokatalytischen Herstellung von chiralen N-Heterozyklen ist daher eine vielversprechende Alternative.
1.2.2. Piperazine
Piperazine sind privilegierte Bausteine der Pharmaindustrie, welche in über 6% aller oral verabreichten Medikamente enthalten sind.[63,64] Damit gilt Piperazin als der dritt häufigste Heterozyklus in allen Pharmazeutika.[54,65] Umso erstaunlicher ist es, dass Piperazine in der Natur quasi nicht vorkommen. Nur eine Hand voll Piperazin-haltiger Naturstoffe konnten bislang gefunden werden.[66–71] Die Biosynthese dieser Stoffe lässt sich nach derzeitigem Wissensstand auf die Dimerisierung von Aminoaldehyden bzw. Aminosäuren zurückführen.[66,68,70] Hierfür spricht vor allem eine symmetrische Anordnung der Substituenten an Position 2 und 5 des Piperazinrings, sowie die Aufklärung des Biosynthesewegs von Herquilin A in Penicillium herquei.[66] Im Gegensatz zur natürlichen Bildung von Piperazin gibt es zahlreiche chemische Verfahren zur Bildung von Piperazinen, welche sich aufgrund der hohen Nachfrage etabliert haben.
5 Neben der Reduktion von Pyrazinen oder Diketopiperazinen werden auch Metall-vermittelte oder Metall-katalysierte Zyklisierungsreaktionen angewendet.[64,72–79] Bekannte Beispiele für Piperazin-haltige Pharmazeutika sind das Bruskrebs-Medikament Palbociclib, die Leukämie-Bruskrebs-Medikamente Dasatinib und Imatinib, die Schizophrenie-Medikamente Aripiprazol und Brexpiprazol, das Herzmedikament Ranolazin oder das Potenzmittel Sildenafil.[53] Besonders häufig weisen Piperazin-haltige Verbindungen psychoaktive Wirkungen auf, sodass einige Piperazinvorstufen auch für die Herstellung von verschiedenen Drogen missbraucht werden.[80]
Meistens werden Piperazine ohne C-Substituenten als Vorstufe benötigt. Doch auch chiral substituierte Piperazine werden immer häufiger in der Entwicklung von Pharmazeutika eingesetzt.[81–86] Bekannte Beispiele sind die HIV-Medikamente Indinavir und Vicriciroc, das Antidepressivum Mirtazapin, das Beruhigungsmittel Vestipiant oder das Antibiotikum Sparfloxacin (Abb.3).[87–91] Hier werden chirale C-substituierte Piperazine als Pharmabausteine benötigt, deren chemische Bereitstellung sehr herausfordernd ist.[73,92]
Abbildung 3: Beispiele für bekannte Pharmazeutika, bei welchen chirale C-substituierte Piperazine (rot
6
1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen
Aufgrund der signifikanten Präsenz von N-Heterozyklen in Lebewesen, gibt es zahlreiche Enzyme die bei deren Biosynthese beteiligt sind. Dabei sind für eine biotechnologische Applikation vor allem solche Enzyme interessant, die die Bildung von chiralen N-Heterozyklen ermöglichen. In den meisten bekannten Biosynthesewegen werden hierfür Reduktasen eingesetzt, welche die stereoselektive Reduktion eines prochiralen zyklischen Imins katalysieren. Ein sehr bekanntes Beispiel hierfür findet man im Primärstoffwechsel in der Biosynthese von L-Prolin.[93–95] Wie alle proteinogenen Aminosäuren wird auch L-Prolin mit einer exzellenten
Enantiomerenreinheit gebildet. In manchen Biosynthesewegen wird das Stereozentrum schon durch die Vorstufe L-Ornithin oder L-Glutaminsäure vorgegeben. Besonders
interessant ist jedoch die Biosynthese mittels Pyrrolidin-2-carboxylatreduktase (P2CR). Dieses Enzym ist in der Lage eine prochirale zyklische Imin-Zwischenstufe stereoselektiv zu reduzieren, sodass ausschließlich L-Prolin entsteht (Abb.4, A).[96] Die P2CR gehört zu der Familie der Ketimin-Reduktasen, welche auch für die Reduktion von weiteren zyklischen Iminen genutzt werden können. Jedoch sind sie auf Substrate mit einem 2‘-Carboxylsubstituent angewiesen.[97,98]
Daneben sind ein paar Enzyme des Sekundärstoffwechsels bekannt, welche ebenfalls die Reduktion von zyklischen Iminen katalysieren. Ein Beispiel ist die Dihydrofolatreduktase (DHFR), welche die selektive Reduktion von 7,8-Dihydrofolat zu (S)-5,6,7,8-Tetrahydrofolat katalysiert (Abb.4, B).[99] Die Thiazolinyl Iminreduktase (TIRED) katalysiert die Reduktion eines Thiazolinrings in der Biosynthese der Siderophore Pyochelin und Yersiniabactin (Abb.4, C).[100,101] Auch in der Biosynthese von Morphin wird ein zyklisches Imin reduziert. Hier katalysiert die Dihydroreticulinreduktase (DRR) die Reduktion eines Dihydroquinolinrings (Abb.4, D).[102,103] Ein weiteres Enzym, das an dieser Stelle zu erwähnen ist, ist die F420-abhängige Reduktase (TomJ) im Biosyntheseweg von Tomaymycin, welche eine Pyrrolin-ähnliche Struktur reduziert (Abb.4, E).[104] Jedoch wird bei diesem Schritt kein Stereozentrum erzeugt.
Im Gegensatz zu diesen sehr spezifischen Enzymen (A-E) weisen Iminreduktasen (IREDs) ein deutlich breiteres Substratspektrum auf, sodass eine Vielzahl zyklischer Iminsubstrate selektiv reduziert werden können (Abb.4, F).[105] Die natürliche Funktion
7 dieser Enzymfamilie ist bislang nicht bekannt. Aufgrund des breiten Substratspektrums ist die Beteiligung in einem einzigen spezifischen Biosyntheseweg eher unwahrscheinlich.
Abbildung 4: Die Abbildung zeigt verschiedene bekannte Enzyme, welche die stereoselektive Reduktion
von zyklischen Iminen katalysieren können und damit zur Bildung von chiralen N-Heterozyklen beitragen.
1.4. Iminreduktasen
Lange Zeit gab es kaum biokatalytische Möglichkeiten um chirale gesättigte N-Heterozyklen herzustellen, da entsprechende Enzyme noch nicht beschrieben
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wurden. Erst 2010 wurde die Enzymfamilie der Iminreduktasen (IREDs) entdeckt, sodass neue enzymatische Ansätze möglich waren.[106] 2011 wurden die ersten IREDs aus Streptomyces-Stämmen erfolgreich isoliert und charakterisiert.[107] Seit 2013 kennt man außerdem die ersten Röntgenstrukturen von IREDs (Abb. 5).[108] IREDs sind homodimere Proteine mit je einem N-terminalen NADPH-Bindemotiv (Rossmannfaltung). Eine Besonderheit ist, dass die beiden Monomere sehr stark ineinander verschränkt sind. Nach der N-terminalen Domäne durchdringt eine lange α-Helix die C-terminale Domäne des jeweils anderen Monomers. Anschließend folgt der C-terminale Teil, welcher wiederum von der langen α-Helix des anderen Monomers durchdrungen wird. Es handelt sich also nicht um zwei Monomere, die über eine Oberflächeninteraktion miteinander verbunden sind. Stattdessen sind die Monomere so sehr ineinander verflochten, dass eine Dissoziation unter Beibehaltung der Proteinfaltung kaum möglich scheint.
Abbildung 5: Darstellung der Röntgenstruktur der R-selektiven IRED aus Streptomyces kanamyceticus,
welche 2013 gelöst wurde (pdb-ID = 3zhb).[108] Gezeigt ist sowohl die Sekundärstrukturdarstellung (A) als
auch die Oberflächendarstellung (B). Die beiden (Homo-)Monomere sind in Grau und Beige dargestellt. Die beiden gebundenen NADP+-Moleküle sind ebenfalls gezeigt. Die Darstellung erfolgte mit Pymol.
9 Das aktive Zentrum wird jeweils aus der N-terminalen Domäne des einen Monomers und der C-terminalen Domäne des anderen Monomers gebildet. Erste Hinweise weisen darauf hin, dass es einen „offenen“ und „geschlossenen“ Zustand des aktiven Zentrums gibt, bei welchen sich die beiden Domänen in einem unterschiedlichen Abstand zueinander befinden.[109] Dies hängt auch davon ab, ob NADPH gebunden ist oder nicht. Die Kristallstrukturen von unterschiedlichen Enzymkonformationen bestätigen, dass das aktive Zentrum einer starken Dynamik unterliegt.[109]
Die Funktionen der konservierten Aminosäurereste im aktiven Zentrum sind bislang weitestgehend ungeklärt. Die Position 171 (Nummerierung bezogen auf die R-selektive IRED aus Myxococcus stipitatus, R-IRED_Ms) wurde bereits mehrfach als katalytisch aktive Aminosäure beschrieben. Sie befindet sich auf der gleichen Domäne wie die NADPH Bindetasche. Hier ist in den meisten R-selektiven IREDs eine Asparaginsäure (D-Typ) und in den meisten S-selektiven IREDs ein Tyrosin (Y-Typ) konserviert.[110] Aufgrund der Ausrichtung und der Konservierung dieser Position, vermutet man eine Beteiligung an der Protonierung des Substrates.[108,111] Allerdings könnte die Protonierung auch über ein aktiviertes Wassermolekül ablaufen.[105,111] Bei Negativkontrollen mit einer Mutation an dieser Stelle wurden unterschiedliche Beobachtungen gemacht. Häufig zeigte sich eine drastisch reduzierte Aktivität.[112] Teilweise wurden jedoch auch erhebliche Restaktivitäten detektiert.[113] Es könnte sein, dass die katalytische Beteiligung von Position 171 nur auf einen Teil der IREDs zutrifft. Hierfür spricht auch die Tatsache, dass manche IREDs an dieser Stelle Aminosäuren aufweisen, welche keine Protonierung übernehmen können (z.B. Phenylalanin, Alanin oder Asparagin).[114]
1.4.1. Reaktionsmechanismus
Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass der Katalysemechanismus von Iminreduktasen (Abb. 6) ähnlich wie bei den Ketoreduktasen, bzw. wie bei der Reduktionsreaktion von Alkoholdehydrogenasen abläuft.[109,115–117]
Der entscheidende Schritt im Reaktionsmechanismus von IREDs ist der nukleophile Angriff des Hydrids von NADPH auf den positiv teilgeladenen und damit elektrophilen Kohlenstoff der Iminbindung. Bei diesem Schritt wird außerdem die Stereoselektivität
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determiniert. Abhängig davon, ob der Angriff des Hydrids von der Re- oder Si-Seite erfolgt, entsteht das S- oder R-Enantiomer.[118] Mit diesem Schritt verbunden ist eine Elektronenumlagerung im Nikotinamid-Teil, sodass NADP+ entsteht. Das π-Elektronenpaar der Imin-Doppelbindung klappt zum Stickstoff. Dieser wird protoniert, sodass aus dem Iminsubstrat schließlich ein Aminprodukt gebildet wird. Falls die Protonierung durch einen Aminosäurerest erfolgt, muss dieser anschließend wieder regeneriert werden. Bevor ein weiterer Katalysezyklus durchlaufen werden kann, muss der verbrauchte Kofaktor (NADP+) diffusiv durch NADPH ersetzt werden. Außerdem muss das Produkt aus dem aktiven Zentrum entlassen werden, um die Aufnahme eines neuen Substrates zu ermöglichen.
Abbildung 6: Vorgeschlagener Katalysezyklus für Iminreduktasen am Beispiel der Reduktion von
2-Methylpyrrolin zu (R)- oder (S)-2-Methylprrolidin. 1) Hydridtransfer und Protonierung; 2) Gegebenenfalls Regenerierung der katalytischen Aminosäure durch Protonierung.
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1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen
Die Reduktion von Iminen ist der namensgebende Reaktionstyp welcher durch IREDs katalysiert wird (Abb. 7). Die Herausforderung bei Iminen ist, dass sie Hydrolyse-labil sind und in eine Carbonyl- und Aminkomponente zerfallen können.[119] Im wässrigen Milieu stellt sich ein pH-abhängiges Gleichgewicht zwischen dem Imin und dem Hydrolyseprodukt ein, wobei die Hydrolyse bei hohen pH-Werten vermindert stattfindet.[120] Azyklische Imine sind im Vergleich zu zyklischen Iminen meist deutlich instabiler. Durch Substituenten mit einem +I- oder +M-Effekt kann die Imingruppe stabilisiert werden.[119,121]
Die IRED katalysierte Reduktion des Imins zum Amin hat ebenfalls einen Einfluss auf das Hydrolysegleichgewicht. Das Imin wird dem Gleichgewicht entzogen, sodass sich dieses zu Gunsten der IRED verschiebt.
Abbildung 7: IRED katalysierte Reduktion von zyklischen bzw. azyklischen Iminen, sowie das
Hydrolysegleichgewicht des Iminsubstrats. Als Beispiele wurden die Substrate 2-Methylpyrrolin (zyklisches Imin) und N-Benzylidenmethylamin (azyklisches Imin) dargestellt.
Um die Stabilität des Iminsubstrats zu gewährleisten wurden zunächst nur zyklische Imine oder durch Phenylgruppen stabilisierte azyklische Imine eingesetzt.[107,113,122–124] So wurden mit IREDs anfangs hauptsächlich Pyrrolidine, Piperidine, Tetrahydroisoquinoline, Indoline oder Hexahydro-β-carboline gebildet.[112,125–127] Dabei wurden neben zyklischen Iminen auch zyklische Iminium-Ionen eingesetzt. Später
12
stellte man fest, dass auch instabile Imine von IREDs umgesetzt werden können. Hierfür setzt man jedoch nicht das Imin sondern das Carbonyl- und Aminsubstrat ein.[98,128] Beide Substrate stehen in einem Gleichgewicht mit dem Imin, welches durch die IRED reduziert werden kann (Abb. 8). Diese Art der Anwendung wird als reduktive Aminierung bezeichnet und bietet extrem viele Möglichkeiten im Vergleich zur normalen Imin Reduktion.[98,109,128–131] Im Gegensatz zu Iminsubstraten stehen vielzählige stabile und kostengünstige Substrate zur Verfügung, welche miteinander kombiniert werden können.[132,133]
Abbildung 8: Reaktionsschema der IRED katalysierten Iminreduktion (blau) ausgehend vom
Iminsubstrat, sowie die reduktive Aminierung (orange) ausgehend vom Carbonyl- und Aminsubstrat.
Eine interessante Thematik bezüglich der reduktiven Aminierung ist auch die Fragestellung, ob IREDs einen Einfluss auf die Kondensationsreaktion haben. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass zumindest manche IREDs die Fähigkeit besitzen, die Kondensation katalytisch zu beschleunigen. Anhand von Kristallstrukturen von Enzym-Substrat-Komplexen wurde eine Tyrosinrest-vermittelte Aktivierung der Carbonylgruppe bei einer IRED aus Aspergillus terreus postuliert.[109] Es wird deshalb angenommen, dass auch die Kondensationsreaktion enzymatisch beschleunigt wird, sodass beide Reaktionsschritte der reduktiven Aminierung unter dem Einfluss der Iminreduktase stehen. In diesem Zusammenhang wird deshalb auch die Bezeichnung „reduktive Aminase“ anstelle von Iminreduktase verwendet.[109,132]
Auch die Rückreaktion, also die Oxidation eines Amins zu einem Imin, kann durch IREDs katalysiert werden, wobei hierfür höhere pH-Werte (<10,0) benötigt werden.[134] In diesem Fall ist es außerdem förderlich ein Amin auszuwählen, dessen Imin-Analogon sehr instabil ist, und somit sofort hydrolysiert. So wird das Gleichgewicht zu Gunsten der Oxidation verschoben.[134]
Neben den Imin reduzierenden Aktivitäten konnte auch eine promiskuitive Aktivität von IREDs gegenüber der Reduktion einer aktivierten Carbonylverbindung beobachtet
13 werden. Jedoch konnte dies bislang nur für ein Substrat (2,2,2-Trifluoroacetophenon) gezeigt werden, welches stereoselektiv zum entsprechenden Akloholprodukt umgesetzt wurde.[135]
1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten
Abseits der IREDs wurden mittlerweile in weiteren Enzymfamilien Imin-reduzierende Aktivitäten detektiert. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um die natürliche Funktion, sondern um eine promiskuitive Aktivität, welche in der Regel auch nicht sehr stark ausgeprägt ist. Eine nah verwandte Enzymfamilie der IREDs sind die β-Hydroxysäuredehydrogenasen.[114] Sie katalysieren normalerweise die Oxidation von Hydroxygruppen oder die Reduktion von Carbonylgruppen. Jedoch weisen sie zusätzlich eine, wenn auch schwache, promiskuitive Aktivität für die Reduktion von zyklischen Iminen auf. Dies konnte am Beispiel von 2-Methylpyrrolin gezeigt werden.[115] Durch einen gezielten Austausch einer Aminosäure im aktiven Zentrum von β-HADs konnte diese Anfangsaktivität außerdem um das 12-fache gesteigert werden.[115]
Des Weiteren zeigt die Glutamatdehydrogenase eine reduzierende Aktivität gegenüber Pyrrolin-2-carboxylat und Piperidin-2-carboxylat. Dabei wird ähnlich wie bei der P2CR die stereoselektive Bildung von L-Prolin bzw. L-Pipecolinsäure beobachtet.[136] Eine weitere promiskuitive Aktivität wurde bei der Glukosedehydrogenase gegenüber Dihydroisoquinolin-Derivaten festgestellt.[137] Die Glukosedehydrogenase gehört zu der großen Enzymfamilie der kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs) mit über 168 000 bekannten Proteinen.[138] Es ist also wahrscheinlich, dass noch weitere Enzyme dieser Familie existieren, die eine ähnliche promiskuitive Aktivität aufweisen.
Neben promiskuitiven Aktivitäten konnten auch schon artifizielle Enzymaktivitäten für die Reduktion von zyklischen Iminen erzeugt werden. Dies gelang mit Hilfe von artifiziellen Metalloenzymen.[139–141] Hierbei konnten jedoch nur moderate Stereoselektivitäten erreicht werden.[141]
Auch für die reduktive Aminierung wurden bereits weitere Enzymfamilien gefunden, welche diese Reaktion promiskuitiv katalysieren können. Hierzu gehört die Opinsäuredehydrogenase, sowie die Ketiminreduktasen und die Amin
14
Dehydrogenasen.[142–146] Die Möglichkeiten sind im Vergleich zu IREDs jedoch deutlich beschränkter, vor allem in der Wahl des Aminsubstrates.
1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen
Eine wichtige Voraussetzung für eine wirtschaftliche Anwendung von Biotransformationen ist die Zugänglichkeit der Ausgangsverbindungen. In diesem Zusammenhang sind Multienzymsysteme sehr förderlich.[147] So können komplexe Strukturen schrittweise ausgehend von einfachen Verbindungen aufgebaut werden. Die Aneinanderreihung von mehreren biokatalytischen Schritten wird dabei als Enzymkaskade bezeichnet. Auch für die Generierung von gesättigten N-Heterozyklen wurden bereits einige Enzymkaskaden mit IREDs entwickelt (Abb. 9).[148–151] Die Anwendung von zusätzlichen Enzymen ermöglicht die Verwendung von sehr einfachen linearen Ausgangsverbindungen.
Abbildung 9: Verschiedene Enzymkaskaden zur Bildung von gesättigten N-Heterozyklen ausgehend von
einfachen linearen Verbindungen. Als Ausgangsverbindung können Diamine (A,B), Dicarbonyle (C) oder Ketosäuren (D) verwendet werden.
15 Ausgehend von Diaminen (A, B), Dicarbonylen (C) oder Ketosäuren (D) können Aminoaldehyde in ein oder zwei Schritten enzymatisch gebildet werden. Die Aminoaldehyde reagieren spontan unter Abspaltung von Wasser zu zyklischen Iminen, welche schließlich durch eine IRED reduziert werden können, sodass gesättigte N-Heterozyklen entstehen. Die abgebildeten Enzymkaskaden A, C und D konnten außerdem auch im Ganzzell-System (E. coli) durchgeführt werden.
Die angewendete Route über eine Aminoaldehyd Zwischenstufe erinnert stark an die natürlichen Biosynthesewege von gesättigten N-Heterozyklen. Auch hier verläuft die Synthese in der Regel über ein Aminoaldehyd.[93,94,152–156]
16
2. Motivation
Die Untersuchung und Entwicklung von Iminreduktasen (IREDs) führte in den letzten neun Jahren zu beeindruckenden Ergebnissen. Vor allem durch die reduktive Aminierung konnte die Anwendbarkeit von IREDs erheblich gesteigert werden, sodass nun die Bildung von vielzähligen chiralen primären, sekundären und tertiären Aminen möglich ist. Der Zugang zu N-Heterozyklen ist jedoch immer noch sehr beschränkt. Zwar können einige zyklische Imine stereoselektiv reduziert werden, jedoch sind für viele wichtige N-Heterozyklen entsprechende Iminvorstufen nicht verfügbar. Piperazin ist beispielsweise der zweithäufigste gesättigte N-Heterozyklus in Pharmazeutika. Dennoch gibt es (abseits dieser Arbeit) bislang keine biokatalytischen Methoden um Piperazine mit unterschiedlichem Substituierungsmuster aufzubauen.
Ziel dieser Arbeit war es, den enzymatischen Zugang zu neuen N-Heterozyklen zu schaffen. Hierfür sollten insbesondere IREDs sowie IRED-basierte Enzymkaskaden eingesetzt werden.
Für die Anwendung von Enzymkaskaden sollten unter anderem unterschiedliche Kofaktorregenerationssysteme in Betracht gezogen werden. Hierbei ist jedoch die strikte NADPH Abhängigkeit von IREDs eine große Einschränkung. Um dies zu umgehen sollte eine NADH abhängige IRED mittels ortsgerichteter Mutagenese entwickelt werden, sodass neue Möglichkeiten eröffnet werden.
Neben Enzymkaskaden sollten auch neue Substrate und Reaktionen mit IREDs getestet werden. Ein besonderes Augenmerk sollte dabei dem Aufbau von Piperazingerüsten gelten, da dies sehr gefragte Pharmabausteine sind. Des Weiteren sollten analog zu Aminen auch Hydrazine als neuartige IRED-Substrate getestet werden. Auch sollte geprüft werden, ob sich diese für die IRED katalysierte Bildung von N-Heterozyklen eignen.
Zuletzt sollten außerdem Aminosäurepositionen in der aktiven Tasche identifiziert werden, welche zur Stereoselektivität von IREDs beitragen. Die identifizierten Positionen sollten schließlich für ein beispielhaftes enzyme engineering herangezogen werden, um die Stereoselektivität einer ausgewählten Iminreduktase vollständig umzukehren. So sollte auch das Verständnis über die Funktion verschiedener selektivitätsbestimmender Aminosäuren im aktiven Zentrum verbessert werden.
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3. Material und Methoden
3.1. Materialien
3.1.1. ChemikalienAlle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Sigma Aldrich und Fluka (Steinheim, DE), abcr GmbH (Karlsruhe, DE), VWR (Darmstadt, DE), Thermo Fisher (Braunschweig, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE), Fluorochem (Hadfield, UK) und Prozomix (Haltwhistle, UK) bezogen.
3.1.2. Vewendete Enzyme
Neben den selbst hergestellten Enzymen kamen auch einige kommerziell erhältliche Enzyme zum Einsatz (Tab. 1).
Tabelle 1: Verwendete Enzyme und deren Verwendung.
Enzym Herkunft Verwendung
PfuUltraII Fusion HS
DNA-Polymerase Agilent (Santa Clara, US) PCR, QuikChange-PCR Phusion High-Fidelity
DNA-Polymerase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly T5-Exonuclease NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly Taq DNA-Ligase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly
Dpn1 NEB (Frankfurt, DE) Verdau von DNA-Templat
DNAseI (Rind) Sigma Aldrich (Steinheim, DE) Enzymatischer Zellaufschluss Lysozym aus Hühnereiweiß AppliChem GmbH (Darmstadt, DE) Enzymatischer Zellaufschluss Peroxidase (Meerrettich) AppliChem GmbH (Darmstadt, DE) Aktivitäts-Assay für Oxidasen
Glukose-6-P-Dehydrogenase aus
Leuconostoc mesenteroides
Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) Regeneration von NADPH und NADH Formiat-Dehydrogenase
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3.1.3. Verwendete Kits
Für verschiedene molekular- und mikrobiologische Techniken wurden Anwendungsspezifische Kits verwendet, welche im Folgenden aufgeführt sind (Tab. 2). Tabelle 2: Verwendete Kits und deren Verwendung.
Kit Herkunft Verwendung
ZyppyTM Plasmid Miniprep
Kit Zymo Research (Irvine, US) Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli DNA Clean and
ConcentratorTM
Zymo Research
(Irvine, US) DNA-Reinigung ZymocleanTM Gel DNA
Recovery Kit Zymo Research (Irvine, US) Extraktion von DNA aus einem Agarosegel PierceTM BCATM Protein
Assay Kit
Thermo Fisher (Braunschweig, DE)
Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration
3.1.4. Verwendete Plasmide
Für die heterologe Expression und Herstellung von Iminreduktasen (IREDs) und Putrescinoxidasen (PuOs) wurden drei verschiedene Expressionssysteme verwendet, sodass auch drei verschiedene Plasmide eingesetzt wurden (Tab 3).
Tabelle 3: Verwendete Plasmide.
Plasmid Empfänger-stamm Resistenz-marker Operon Verwendeter Induktor An-wendung
pET28a(+) E. coli DH5α / E. coli BL21(DE3)
Kanamycin-Resistenz Lactose-Operon IPTG IREDs
pBAD18[157] E. coli JW5510
Ampicillin-Resistenz Arabinose-Operon LArabinose (+)- PuOs
pBAD33[157] E. coli JW5510
Chlor- amphenicol-Resistenz
19
3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer
Für das Einfügen von zielgerichteten Mutationen wurden verschiedene Techniken angewendet, wobei spezifische Oligonukleotide (Primer) eingesetzt wurden (Tab 4,5). Alle Primer wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) bezogen.
Tabelle 4: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter
Kofaktorspezifität. Ziel- Mutation Verwen-detes Templat Muta-genese Strategiea Ange-wendete Technikb Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts R33X, T34X, K37X WT 3 B V: GTGGAACHVCRMKAAAGCCDAKAGCGAACCGCTGGCAAAACTG R: GTTCGCTMTHGGCTTTMKYGBDGTTCCACACCGTGGTCGTGTAG N32X V1 2 A V: CACGACCACGGTGTGGNNKTACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTAMNNCCACACCGTGGTCGTG K37X V1 2 A V: GAACTACGAGAAAGCCNNKAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTMNNGGCTTTCTCGTAGTTC L67X V5 2 A V: CGTGGTTAATGTGNNKGATTATGACACCTCTGATC R: GATCAGAGGTGTCATAATCMNNCACATTAACCACG T71X V5 2 A V: GTGCTGGATTATGACNNKTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGAMNNGTCATAATCCAGCAC L75X V8 2 A V: GACACCTCTGATCAGNNKCTGCGCCAAGACGAAG R: CTTCGTCTTGGCGCAGMNNCTGATCAGAGGTGTC N32E V3 1 A V: CACGACCACGGTGTGGGAATACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTATTCCCACACCGTGGTCGTG R33Y WT 1 A V: CCACGGTGTGGAACTACACCAAAGCCAAAAGCG R: CGCTTTTGGCTTTGGTGTAGTTCCACACCGTGG R37A V8 1 A V: GAATACGAGAAAGCCGCGAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTCGCGGCTTTCTCGTATTC L67I V7 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG T71V WT 1 A V: GTGCTGGATTATGACGTGTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGACACGTCATAATCCAGCAC T71V V6 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG
a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:
1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an drei Positionen gleichzeitig.
b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:
A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly.
Tabelle 5: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter
Stereoselektivität. Die Mutationsstelle im Primer ist grau markiert.
Ziel-
Mutation Verwen-detes Templat Muta-genese Strategiea Ange-wendete Technikb Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts A122V, T123P, P124A V8 1 A V: CGGTGCGATCATG GTT CCG GCG GATTTTATTGGCCAG R: CTGGCCAATAAAATC CGC CGG AAC CATGATCGCACCG D171Y V8 1 A V: CATGCCTCAGCACTG TAT AGCGCCCTGCTGTTTCAG
R: CTGAAACAGCAGGGCGCT ATA CAGTGCTGAGGCATG M178F V8 1 A V: CCTGCTGTTTCAG TTC TGGGGCACCCTGTTC
20 Q234D, T235V,
L236D V8 1 A
V: CTGACCGCAGACGCT GAT GTG GAT GCAAGTCTGGAAGG R: CCTTCCAGACTTGC ATC CAC ATC AGCGTCTGCGGTCAG H242G V8 1 A V: CAAGTCTGGAAGCT GGT AACGTGGCGTTC
R: GAACGCCACGTT ACC AGCTTCCAGACTTG S95X,
D171X V8 3 B
V: CAGCTGACC KHT GGTTCTCCGGCACTGGC R: CAGGGCGCT ADM CAGTGCTGAGGCATGACC V: CTCAGCACTG KHT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CGGAGAACC ADM GGTCAGCTGAACCAGCAG I120X,
M121X V8 3 A V: CTGGACGGTGCG KHT KHT GCCACCCCGGATTTTATTG R: CAATAAAATCCGGGGTGGC ADM ADM CGCACCGTCCAG A122X,
T123X V8 3 A V: GACGGTGCGATCATG KHT KHT CCGGATTTTATTGGC R: GCCAATAAAATCCGG ADM ADM CATGATCGCACCGTC L175X,
M178X V8 3 A V: GACAGCGCCCTG KHC TTTCAG KHT TGGGGCACCCTG R: CAGGGTGCCCCA ADM CTGAAA GDM CAGGGCGCTGTC A241X,
H242X V8 3 A
V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGGCGTTCC R: GGAACGCCACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG V212X V8 2 A V: CTGACCGAACCG NNK ACCCAGGGTGCCGTTG
R: CGGCACCCTGGGT MNN CGGTTCGGTCAGTTTG A237X V8 2 A V: GACGCTCAGACGCTG NNK AGTCTGGAAGCTCATAAC
R: GAGCTTCCAGACT MNN CAGCGTCTGAGCGTCTG M13X V8 2 A V: GTTATTGGCGCTGGCCGT NNK GGCTCCGCACTG R: CAGTGCGGAGCC MNN ACGGCCAGCGCCAATAAC P124X V8 2 A V: CGATCATGGCCACC NNK GATTTTATTGGCCAGGC
R: GCCTGGCCAATAAAATC MNN GGTGGCCATGATCG A245X V8 2 A V: GGAAGCTCATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG
R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATGAGCTTCC L170X,
D171Y,
S172Q V8 1+2 A
V: CATGCCTCAGCACTG NNK TAC CAG GCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGC CTG GTA MNN CAGTGCTGAGGCATG A245X 15B7 2 A V: GGAAGTTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG
R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTCAAATATTCC A241X,
H242X 110D2 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGTTGTTCC GGAACAACACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG
A241X 15B7 2 C V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA NDT TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA VHG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA TGG TATAACGTGGCGTTCCAA CACCTGC R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG H242X 15B7 2 C V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT NDT AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT VHG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT TGG AACGTGGCGTTCCAA CACCTGCTG R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG A241M, H242X V8 1+2 C
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG NDT AACGTGGCGTTCCAA
CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG VHG AACGTGGCGTTCCAA
CACCTGCTG
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG TGG AACGTGGCGTTCCAA
CACCTGCTG
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG E240X,
N243X 15B7 3 B
V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTG KHT GTTTAT KHT GTGGCGTTCCA
ACACCTGCTGGCC
R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG V244X,
F246X 110C2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC V244X, 15B7 1+3 A V: GTCTGGAAGTTTATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC
21 A245C,
F246X V244X,
F246X 110D2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC V244X,
A245L,
F246X 24E4 1+3 A
V: GTCTGGAAATTTATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATAAATTTCCAGAC A245L D171Y 1 A V: GGAAGCTCATAACGTG TTG TTCCAACACCTGCTGG
R: CCAGCAGGTGTTGGAA CAA CACGTTATGAGCTTCC A245X 24E4 2 A V: GTCTGGAAATTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTGG
R: CCAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATAAATTTCCAGAC G96D,
S79X V8 1+2 A
V: GTTCAGCTGACCAGC GAT NNK CCGGCACTGGCTC R: GAGCCAGTGCCGG MNN ATC GCTGGTCAGCTGAAC T94X,
G96D,
S79X V8 1+3 A
V: CTGGTTCAGCTG KHT AGCGAT KHT CCGGCACTGGCTG R: CAGCCAGTGCCGG ADM ATCGCT ADM CAGCTGAACCAG F246X 110D2 2 A V: GAAGCTCATAACGTG TTG NNK CAACACCTGCTGGCC
R: GGCCAGCAGGTGTTG MNN CAA CACGTTATGAGCTTC A241X 23B3 2 A V: GCTGGCAAGTCTGGAA NNK TATAACGTGTTGTTCC
R: GGAACAACACGTTATA MNN TTCCAGACTTGCCAGC H242X 23B3 2 A V: GGCAAGTCTGGAAGTT NNK AACGTGTTGTTCCAAC R: GTTGGAACAACACGTT MNN AACTTCCAGACTTGCC N243X 23B3 2 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT NNK GTGTTGTTCCAACACC R: GGTGTTGGAACAACAC MNN ATAAACTTCCAGACTTG N243X
V244X 23B3 3 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT KHT KHT TTGTTCCAACACCTGC R: GCAGGTGTTGGAACAA ADM ADM ATAAACTTCCAGACTTG
a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz:
1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an zwei Positionen gleichzeitig.
b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:
A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly; C) Gibson assembly kombiniert mit „22c-trick”.[158]
3.1.6. Verwendete E. coli Stämme
Das Gen für R-IRED_Ms wurde im Rahmen eines früheren Projektes von GenSkript (Piscataway, US) synthetisiert und in einem pET28a(+)-Vektor geliefert. Deshalb wurde zunächst mit einem passenden Expressionsstamm (E. coli BL21(DE3)) gearbeitet, welcher das Gen für die nötige T7-Polymerase trägt. Für die Klonierungsarbeiten mit pET28a(+) wurde außerdem der Klonierungsstamm E. coli DH5α verwendet. Im weiteren Verlauf wurde das Gen in einen pBAD33-Vektor überführt. In diesem Plasmid standen auch weitere IREDs zur Verfügung, welche bereits in Vorarbeiten kloniert wurden. Für pBAD-Plasmide wurde der Stamm E. coli JW5510 aus der Keio-Collection[159] herangezogen, bei welchem die Gene der Abbauenzyme von
