3.1 Herstellung der PCL- und P(3HB)/P(4HB)- Folien
Die Herstellung der Polymerfolien erfolgte im Institut für Biomedizintechnik der Universität Rostock, Rostock (Deutschland), wie in der Studie 1 (ROLAND et al. 2015) beschrieben.
Damit sie in eine 96-Well Platte eingebracht werden konnten, wurden Kreise mit einem Durchmesser von 0,64 cm ausgestanzt. Diese wurden mit 70 % Äthanol sterilisiert.
3.2 Laserstrahlschmelzen von Titan- und Magnesiumimplantaten
Die Titanimplantate mit einer Porengröße von 600 µm stellte die SLM Solutions GmbH, Lübeck Deutschland aus einer TiAl6V4 Legierung mit einem SLM® 280HL Selective Laser Melting Maschinensystem her (ROLAND et al. 2015).
Mit einem SLM® 125HL Selective Laser Melting Maschinensystem konnten im Laser Zentrum Hannover Magnesiumimplantate aus ATOULTRA 325 Magnesium Pulver mit einer Porengröße von 600 µm hergestellt werden (MATENA et al. 2015b).
3.3 PCL Beschichtung von Titan und Magnesiumimplantaten
Die Beschichtung der porösen Titan- und Magnesiumimplantate erfolgte mit einem Tauchverfahren. Mit einer speziell dafür angefertigten Halterung wurden die Implantate achtmal in eine PCL-Chloroform-Lösung getaucht. (ROLAND et al. 2015).
3.4 Inkorporation von VEGF und HMGB1 in PCL-beschichtete Titan- und Magnesiumimplantate
Die Funktionalisierung der mit PCL-beschichteten Titan- und Magnesiumimplantate mit den proangiogenen Faktoren VEGF und HMGB1 erfolgte über Physisorption (ROLAND et al.
2015). VEGF in einer Konzentration von 1 µg/ml bzw. HMGB1 in einer Konzentration von 10 µg/ml lagen gelöst in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 vor. Die Ergebnisse der Studie 1 machten die Anpassung der Konzentrationen für weitere Versuche erforderlich. (ROLAND et al. 2015). Die für die Studie Roland et al. 2016 verwendeten Proteinkonzentrationen in dem Carbonatpuffer betrugen für VEGF 10 µg/ml und für HMGB1 100 µg/ml (ROLAND et al. 2016). Bei der Kombination beider Faktoren wurden die gleichen Konzentrationen wie bei den Einzelfaktoren gewählt.
Material und Methoden
3.5 Isolation von murinen Osteoblasten und murinen GFP-Osteoblasten
Die Isolation und Kultivierung der murinen Osteoblasten und murinen GFP-Osteoblasten erfolgte nach einem etablierten Protokoll (X. D. CHEN et al. 1999; ROLAND et al. 2015) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5% CO2.
3.6 Vitalitäts- und Proliferationsassay mit murinen Osteoblasten
Für die Bestimmung der Proliferation wurden murine Osteoblasten aus den Passagen acht bis zehn (P 8-10) mit dem CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Protokoll der Firma gefärbt (ROLAND et al. 2015).
CFSE in seiner ursprünglichen Form ist membranpermeabel und nicht fluoreszierend. Nach der Diffusion in die Zelle wird durch eine unspezifische Esterase das CFSE so gespalten, dass es fluoresziert, nicht mehr permeabel ist und über Tage im Zytoplasma der Zelle verbleibt.
Somit wird der Farbstoff bei jeder Zellteilung zur Hälfte an die Tochterzelle abgegeben.
Anhand der Intensität des Farbstoffes in den gemessenen Zellen kann ermittelt werden, wie viele Zellteilungen stattgefunden haben.
3.6.1 Polymere PCL und P(3HB)/P(4HB)
Zur Prüfung der Zytokompatibilität der Polymere PCL bzw. P(3HB)/P(4HB) wurden mit CFSE gefärbte murine Osteoblasten auf den jeweiligen Folien bzw. auf Wellboden als Positivkontrolle für 48h, 72h und 96h ausgesät. Die Proliferation und die Vitalität der Osteoblasten konnten mit einem FACS-Durchflusszytometer (FACSCalibur, BDBiosciences, Heidelberg, Deutschland) gemessen und mit Hilfe der Software FlowJo 7.6.1 ausgewertet werden(ROLAND et al. 2015).
3.6.2 Titanimplantate
Die Prüfung der Zytokompatibilität der Titanimplantate erfolgte nach dem gleichen Protokoll, wie die Vitalitäts- und Proliferationsassays auf den Polymerfolien (ROLAND et al. 2015).
Material und Methoden
3.7 Live Cell Imaging auf PCL-beschichteten und unbeschichteten Titanimplantaten Um den Einfluss einer PCL Beschichtung auf das Wachstumsverhalten von Osteoblasten auf Titanimplantaten mit einer Porengröße von 600 µm beurteilen zu können, wurde ein Live Cell Imaging (LCI) mit Mediumwechsel über sieben Tage durchgeführt. Dieses wurde bereits in früheren Studien etabliert und ermöglicht die Verfolgung von Zellen auf Implantatoberflächen (MATENA et al. 2013). Von GFP-Osteoblasten auf drei PCL-beschichteten und drei unbeschichteten Titanimplantaten wurden mit einem LCI-Mikroskop (DMI6000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) über einen Zeitraum von sieben Tagen in 100-facher Vergrößerung täglich jeweils Fotos von fünf verschiedenen Stellen pro Implantat aufgenommen. Die Zellzahl und Zellflächenbesiedlung konnten anhand der aufgenommenen Fotos von Wimasis Image Analysis GmbH, München, Deutschland ausgewertet werden. Die Versuchsdurchführung wurde detailliert in Roland et al. 2015 beschrieben (ROLAND et al.
2015).
3.8 Angiogenese Assay
Der Angiogenese Assay wurde wie in Roland et al. 2015 und Roland et al. 2016 beschrieben nach dem Protokoll des Herstellers, jedoch mit metallischen Implantaten als Testkomponente durchgeführt. Er beinhaltet eine Co-Kultur aus humanen Endothelzellen (HUVEC) und dermalen Fibroblasten (HDF), die über einen Zeitraum von 14 Tagen kultiviert werden. An Tag zwei der Ausführung wurden die Implantate eingesetzt. Nach 14 Tagen erfolgte die abschließende Darstellung der Tubuli-Strukturen über eine Färbung mit mouse anti-human CD31 Primär-Antikörper, goat anti-mouse IgG AP Sekundärantikörper und BCIP/NBT-Substrat (TCSCellworks, Buckingham, Großbritannien). Aufnahmen in 100-facher Vergrößerung wurden mit der Software AngioSys2.0 ausgewertet (ROLAND et al. 2015).
Sowohl funktionalisierte Implantate als auch die beiden Faktoren VEGF und HMGB1 alleine durchliefen den Test, um ihren Einfluss auf die Angiogenese zu evaluieren.
3.9 Migrations Assay
Für den Migrations-Assay wurden bovine Endothelzellen auf Transwell-Einsätze in einer 12-Well Platte ausgesät. Unter die Transwells wurde der Mediumüberstand von den jeweils funktionalisierten Implantaten gegeben um zu prüfen, ob die darin gelösten Faktoren nach
Material und Methoden
ihrer Freisetzung aus den Implantaten noch eine chemotaktische Wirkung auf Endothelzellen besitzen. Nach 75 Minuten wurden die migrierten Zellen mit eiskaltem Methanol fixiert und mit 1%iger Kristall-Violett-Lösung gefärbt. Zur Dokumentation der Ergebnisse erfolgten fünf Aufnahmen in 40-facher Vergrößerung von jedem Transwell mit dem Live Cell Imaging Mikroskop, auf denen die fixierten und gefärbten Zellen manuell ausgezählt werden konnten.
Ergebnisse
4 Ergebnisse