Manuell durchgeführte Methoden am Fotometer

Im Zeitraum vom Frühjahr 2004 bis zur Evaluation des Autoanalysers Cobas Mira Plus im Sommer 2006 wurden die Parameter ALAT, ASAT, AP, LDH, γGT, CK, Harnstoff, Kreatinin und Gesamt-Bilirubin nur auf manuelle Weise bestimmt. Später wurden diese Parameter mit Hilfe des Cobas Mira Plus analysiert. Die Anzahl der manuell gemessenen Proben bis zum Sommer 2006 betrug 557, mit dem Cobas Mira Plus wurden 376 Proben ausgewertet.

Insgesamt wurden folgende Parameter manuell unter Verwendung von Halbmikro-Küvetten (Fa. Ratiolab Gmbh, Dreieich-Buchschlag) mit einem Zentimeter Schichtdicke aus dem Material PMMA (Polymethyl-Methacrylat) fotometrisch untersucht:

• Gesamt-Bilirubin, Direktes Bilirubin, Gesamt-Protein, Albumin, latente Eisenbindungsakapazität, Transferrin (errechnet aus totaler EBK / 0,2275)

• Enzyme: ASAT, ALAT, LDH, GLDH, CK, AP, γGT

• Substrate: Kreatinin, Harnstoff, Glukose, Laktat

• Mineralstoffe und Spurenelemente: Kalzium, Magnesium, Phosphat, Serum-Eisen, Kupfer und Zink.

Dabei kamen die Fotometer Uvikon 930 (Fa. Kontron Instruments Bio-Tek, Deutschland, Neufahrn) und Uvikon XL (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn) zum Einsatz.

Zur Bestimmung der Enzyme und Laktat wurden vor Messbeginn die Reagenzien und PMMA-Küvetten auf 25 °C vortemperiert. Die Temperierung wurde während der Messdauer im Fotometer durch wassergewärmte Küvettenhalterungen fortgesetzt.

Für die Pipettierarbeiten von einem Probenvolumen bis zu 80 µl und einem Reagenzienvolumen von bis zu 1000 µl kam der Pipettierautomat MicroLab^® 1000 (Fa. HAMILTON Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz) zum Einsatz. Größere Volumina wurden von Hand pipettiert.

Die Reaktionsgemische zur Bestimmung von GLDH, Gesamt-Protein, Laktat und Phosphat wurden selbst hergestellt (Tabelle 3.8.3). Zur Glukose-Messung wurde das Test-Kit Gluco-quant ^® Glucose HK und zur Kalzium-Bestimmung das Kalzium-Test-Kit o-Kresolphthalein-Methode (Fa. Roche, Mannheim) verwendet. Alle anderen Test-Kits stammten von Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin (Fa. L+T, Berlin).

Die Feststoffchemikalien zur Herstellung der Reaktionsgemische für die Bestimmung von GLDH, Phosphat, Laktat und Protein (Tab. 3.8.3) wurden von Fa. Merck, Mannheim bezogen, die flüssigen Chemikalien stammten von Fa. Carl Roth, Karlsruhe. Die bei der Laktat-Bestimmung verwendeten Enzyme GPT und LDH wurden von Fa. Boehringer Ingelheim hergestellt.

Als Relativprobe mit bekannter Phosphat- und Kalzium-Konzentration diente der Multikalibrator für automatische Systeme der Fa. L+T, Berlin.

Zur Berechnung der Analytenkonzentration aus der gemessenen Extinktionsdifferenz wurde das Lambert-Beersche-Gesetz angewendet, nach dem die Absorbanz E bei

konstanter Schichtdicke d (cm) und Wellenlänge λ der Konzentration des Analyten c (mol/l) direkt proportional ist: Eλ = F × c × d und c = Eλ / ε mol × d

Berechnung der Faktoren F (Tab. 3.8.1) zur Ermittlung der Konzentration des Analyten aus der Extinktion:

d × Gesamtvolumen

F= ΔE × —————————————— × Verdünnung

Probenvolumen × ε mol

ΔE: Differenz zweier zu verschiedenen Zeitpunkten gemessenen Extinktionen

d: Schichtdicke der Küvette, hier 1 cm

Gesamtvolumen: Probenvolumen + Reaktionsgemischvolumen

ε mol: molarer Extinktionskoeffizient, Lichtabsorbtionsfähigkeit eines Analyten bei einer bestimmten Wellenlänge und Temperatur, abhängig von der Molekülstruktur, in L × mol^-1 × cm^-1

Die genaue Beschreibung der manuellen Durchführung klinisch-chemischer Bestimmungen erfolgt im Anhang (s. Kapitel 11.1).

In Tabelle 3.8.2 werden die manuellen Methoden der klinischen Chemie beschrieben. Wurde die Messtemperatur vom Hersteller mit Raumtemperatur angegeben, fand die Bestimmung je nach Jahreszeit im Labor bei Temperaturen zwischen 20-25°C statt. Die Angaben des relativen Variationskoeffizienten (VK%) stammen aus 20 Messwerten der Qualitätskontrolle Normal, Fa. L+T, Berlin.

Für die Bestimmung der Parameter GLDH, L-Laktat, Gesamt-Protein und Phosphat wurden keine Testkits, sondern Reaktionsgemische aus Eigenherstellung verwendet (Tab. 3.8.3).

Tabelle 3.8.1: Analysebedingungen für fotometrische Bestimmungsparameter unter Angabe des molaren Extinktionskoeffizienten und der Berechnungsfaktoren F

Parameter nm F Messtemp

°C Probe µl

Reagenz-gemisch µl εmol* Substrat

GLDH 365 2,21 25 80 520 3,4 NADH¹⁾

LDH 365 17,94 25 10 600 3,4 NADH

ASAT 365 2,13 25 80 500 3,4 NADH

ALAT 365 2,13 25 80 500 3,4 NADH

γGT 405 0,76 25 80 500 9,5

5-Amino-2-Nitrobenzoat

AP 405 3,29 25 10 600 18,53

pNitrophenyl-phosphat

CK 365 34,57 25 5 600 3,5 NADPH²⁾

Laktat 334 10,78 25 50 1:6 500 6,18 NADH

Protein 546 184,00 20-25 20 1000 2,77 Biuret

*ε mol: molarer Extinktionskoeffizient (bei jeweiliger Wellenlänge und 25°C in L × mol^-1 × cm^-1)

1)NADH: reduziertes Nicotinamidadenindinukleotid

2)NADPH: reduziertes Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

Parameter Methode Reaktion Probe (µl) λ (nm) T (°C) VK (%) GesBb Jendrassik-Grof

(Fa. L+T, Berlin) p-Aminobenzol-Sulfonsäure + Bilirubin Azofarbstoff Plasma 200 578 20-25 12,5 DirBb Jendrassik-Grof

(Fa. L+T, Berlin) p-Aminobenzol-Sulfonsäure + Bilirubin Azofarbstoff Plasma 200 546 20-25 14,8

GP Biuret nach

Weichselbaum Biuret-Reagenz (Cu-Ionen) + Tripeptid Voilettfarbstoff Plasma 40 546 20-25 4,1 Alb Bromkresolgrün

(Fa. L+T, Berlin) Albumin + BCG Albumin-BCG-Farbkomplex Plasma 10 578 20-25 11,0

ASAT opt. DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-Aspartat + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Oxalacetat,Oxalacetat

+ NADH +H⁺ L-Maleat + NAD⁺ Plasma 80 365 25 8,7

ALAT opt. DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-Alanin + α-Ketoglutarat ^ALT L-Glutamat + Pyruvat,

Pyruvat +NADH + H^{+ LDH} Lactat + NAD⁺ Plasma 80 365 25 11,2

GLDH nach Bergmeyer 2-Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD⁺+ H2O Plasma 80 365 25 10,7 LDH opt. DGKC 1972

P-LDH (Fa. L+T, Berlin) Pyruvat + NADH + H⁺ Lactat + NAD⁺ Plasma 10 365 25 7,3

AP opt. DGKC

(Fa. L+T, Berlin) p-Nitrophenylphosphat + H₂O Phosphat + Nitrophenol Plasma 10 405 25 5,7 CK NAC akt. IFCC

(Fa. L+T, Berlin)

Creatinphosphat +ADP Creatin + ATP, ATP+ Glucose Glucose-6-P +

ADP, Glucose-6-P + NADP Gluconat-6-P + NADPH + H⁺ Plasma 5 365 25 11,6

γGT SZASZ (1974) DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid + Glycylglycin

L-γ-Glutamylglycyl + 5-Amino-2-nitrobenzoat Plasma 80 405 25 7,2

T (°C): verwendete Inkubations-, Messtemperatur VK (%): relativer Variationskoeffizient, ermittelt aus 20 Messwerten der Qualitätskontrolle Normal

Parameter Methode Reaktion Probe (µl) λ ( nm) T (°C) VK (%) Krea PAP enzymatisch (Fa. L+T, Berlin) Abbau des Kreatinins zu Glycin und H2O2,

Glycin + ADPS Chinominin-Farbstoff Plasma 50 546 25 5,76

Hst UV, kinetisch (Fa. L+T, Berlin) Abbau des Hst zu Glutamat, dabei Verbrauch von NADH Plasma 5 365 25 10,3

L-Laktat abgewandelt nach Bergmeyer Laktat + NAD Pyruvat + NADH Plasma 50* 1:6 334 25 5,47

Gluk Gluco-quant Glucose/HK

(Fa. Roche, Basel, Schweiz) Glk+ATP G-6-P + ADP, G-6-P + NADP G-6 + NADPH Plasma 50* 1:6 334 20-25 2,76

Ca Kresolphthalein (Fa. Roche, Basel,

Schweiz) Ca+o-Kresolphthalein Ca-o-Kresolphthalein-Komplex Plasma 10 546 20-25 3,49

Mg Calmagit (Fa. L+T, Berlin) Mg + Calmagit Mg-Calmagit-Komplex Plasma 10 546 20-25 3,31

P Molybdänblau Phos-Molybdänsäure-Komplex, Reduktion mit Ascorbat zu

Molybdänblau Plasma 100 578 20-25 3,82

Fe ^Ferrozine® ohne Enteiweissung (Fa. L+T, Berlin)

Freisetzen des Fe vom Transferrin, Reduktion mit Ascorbat,

Eisen-Ferrozine-Farbkomplex Serum 80 546 20-25 4,38

lEBK Fällungsreagenz (Fa. L+T, Berlin) Sättigung des Transferrins mit Fe-Überschuss, Absorbtion

ungebundenen Fe an MgCO3, Fe-Transferrin-Komplexe Serum 250 578 20-25 7,12

K Flammfotometrie Anregung der Atome in der Flamme,

Messung der Emissionsstrahlung Plasma 100 - - 0,92

Na Flammfotometrie Anregung der Atome in der Flamme,

Messung der Emissionsstrahlung Plasma 100 - - 0,57

Cu 3,5-DiBr-PAESA (Fa. L+T, Berlin) Freisetzung des an Coeruloplasmin gebundenen Cu,

Farbkomplex mit 3,5DiBr-PAESA Plasma 50 578 20-25 14,49

Zn Chromogen 5-Br-PAPS ohne Enteiw. (Fa. L+T, Berlin)

Freisetzung des Zn aus Proteinbindung,

Farbkomplex mit 5Br-PAPS Plasma 60 546 20-25 11,78

Hämolyse zur Phospor-Korrektur:

Cyan-Methämoglobin Hexacyanoferrat zu Cyan-Met-Hämoglobin (brauner Farbstoff) Plasma 100 546 20-25

-*100 µl Plasma in 500 µl HCLO4 (1:6), 10 min zentrifugieren bei 13×g und Überstand zur Laktat- u. Glukose-Bestimmung einsetzen

Tabelle 3.8.3: Manuelle Methoden in der klinischen Chemie mit Reaktionsgemischen aus Eigenherstellung

GLDH L-Laktat n.

Bergmeyer

Gesamt-Protein (Biuret)

Phosphat (Molybdänblau) Puffer: 1,467 g

TRAP-EDTA (pH 8,0 TRAP 79 mM, EDTA 3,95 mM) + 0,147 g

EDTA-NaTitriplex in 80 ml A.

dest. lösen, mit 1,6 ml 2 Kupfer-Sulfat, auflösen, +0,5 g Kalium-Jodid, mit 0,2 n NaOH ad 100 ml

Pyrosulfit-Borat: 10 g Natrium-Tetraborat 381,37 Mol + 9 g

Natrium-Pyrosulfit 190,11 Mol ad 500 ml A. dest.

Molybdänsäure: 25 g Ammoniumheptamo- lybdat in 1N H2SO4 ad 500 ml

NADH: 10 mg (13,4 mM) + 1 ml 1% NaHCO3

1 N NaOH Hydrochinon-Ascorbat:

250 mg Hydrochinon 90 mM + 25 mg Ascorbat 5 mM mit A.dest. ad 25 ml NH₃-Acetat: 608 mg

(1,58 M) + 5 ml A. dest.

NAD Carbonat-Sulfit: 3,5 g

Natrium-Sulfit + 21 g Natrium-Carbonat mit A.

dest. ad 500 ml α-Ketoglutarat: 30 mg

(0,273 M) + 0,6 ml A.

dest. + 0,4 ml 1n NaOH

HClO₄ zum

Enteiweißen der Probe 1:6

L-Glutaminsäure+ 0,3 ml 1N NaOH+ 1,246 ml GPT 10 µl/Probe

20 ml Stammlösung mit Verdünnungslösung ad inkubieren, +20 µl α-Ketoglutarat

50 µl 1:6 Probe+ 500 µl Gemisch,

20 µl Probe + 1000 µl Gemisch, Proben-Leerwert mit 1000 µl 0,2n NaOH

1 ml Pyrosulfit-Borat + 100 µl Probe + 0,25 ml Molybdat + 0,25 ml Hydrochinon, 15 min inkub., +2,5 ml Carbonat-Sulfit

546 nm, 20-25°C, gegen Proben-Leerwert, Reagenzien-Leerwert subtrahieren, F=184

578 nm, 20-25°C, gegen Reagenzien-Leerwert, Ermittlung über die bekannte Konzentration eines mitgemessenen Multikalibrators

Reaktionsgemisch-Rezepturen

3.8.2 Klinische Chemie mit automatisierten Messmethoden, Methodenvergleich

Im Dokument Aktualisierung von Blutparametern beim Schwein (Seite 96-103)