Erythrozytenindizes

Aus den beschriebenen Werten erfolgte die rechnerische Bestimmung von MCH, MCHC und MCV:

• MCH fmol = HB mmol/l / Erythrozytenzahl T/l

• MCHC mmol/l = HB mmol/l ×100 / Hkt l/l

• MCV fl = Hkt l/l ×10 / Erythrozytenzahl T/l

(KRAFT u. DÜRR 2005) 3.7.2 Differentialblutbild

Nach sorgfältigem Aufmischen (Blutmischgerät Heidolph Reax 2, Heidolph Instruments

GmbH & Co.KG, Schwabach) wurde das EDTA-Vollblut mittels einer 5-µl-Pipette (Transferpette^®, Fa. Brand, Wertheim) auf Objektträger (Super Frost weiß, 76 x 26 mm ISO Norm 8037/1, Fa. Carl Roth, Karlsruhe) aufgetragen und ausgestrichen und danach nach Pappenheim gefärbt:

• 5 min in May-Grünwald (gebrauchsfertige Eosin-Methylenblau-Lösung, Fa.

Merck KG aA, Darmstadt)

• In gepuffertem A. dest. (ph 7,2 Puffertabletten von Fa. Merck KG aA, Darmstadt) spülen

• 20 min in verdünnter Giemsa-Lösung (6 ml in 100 ml A. dest., Giemsa-Lösung Fa. Merck, Darmstadt)

Für das Differentialblutbild wurden pro Ausstrich zweihundert Zellen bei 630facher Vergrößerung Ölimmersion (Mikroskop Leica DM LB Typ 020-519.509 LB 100T BZ:00 von Fa. Leica Mikroskop und System GmbH, Wetzlar, Okular Leica 10fache Vergrößerung, Objektiv Leica 63fache Vergrößerung) ausgezählt. Differenziert wurden folgende Zellgruppen:

• Lymphozyten

• Segmentkernige neutrophile Granulozyten

• Stabkernige neutrophile Granulozyten, Metamyelozyten wurden als Stabkernige gewertet

• Eosinophile Granulozyten

• Basophile Granulozyten

• Monozyten

• Normoblasten

Die Zellfraktionen wurden in Prozent und in absoluten Zahlen bezogen auf die Leukozytenzahl angegeben. Die Normoblastenzahl wurde von der Leukozytenzahl abgezogen.

Anisozytose und Polychromasie der Erythrozyten wurden auf einer Skala zwischen null und drei bewertet.

3.8 Klinische Chemie

Das in 1,5 ml-Propylen-Reaktionsgefäßen bei –20°C eingefrorene Plasma und Serum wurde zur Bearbeitung zunächst bei Raumtemperatur lichtgeschützt aufgetaut, dann sorgfältig durch Aneinanderschlagen der Reaktionsgefässe gemischt und dann 10 min bei 12000 × g zentrifugiert (Pico 17 Centrifuge, Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode). Das so aufbereitete Plasma oder Serum wurde direkt aus dem Reaktionsgefäß zur Bestimmung der Parameter entnommen, wobei darauf geachtet wurde, dass weder Sediment noch aufschwimmende Fettschicht abpipettiert wurden.

3.8.1 Manuell durchgeführte Methoden am Fotometer

Im Zeitraum vom Frühjahr 2004 bis zur Evaluation des Autoanalysers Cobas Mira Plus im Sommer 2006 wurden die Parameter ALAT, ASAT, AP, LDH, γGT, CK, Harnstoff, Kreatinin und Gesamt-Bilirubin nur auf manuelle Weise bestimmt. Später wurden diese Parameter mit Hilfe des Cobas Mira Plus analysiert. Die Anzahl der manuell gemessenen Proben bis zum Sommer 2006 betrug 557, mit dem Cobas Mira Plus wurden 376 Proben ausgewertet.

Insgesamt wurden folgende Parameter manuell unter Verwendung von Halbmikro-Küvetten (Fa. Ratiolab Gmbh, Dreieich-Buchschlag) mit einem Zentimeter Schichtdicke aus dem Material PMMA (Polymethyl-Methacrylat) fotometrisch untersucht:

• Gesamt-Bilirubin, Direktes Bilirubin, Gesamt-Protein, Albumin, latente Eisenbindungsakapazität, Transferrin (errechnet aus totaler EBK / 0,2275)

• Enzyme: ASAT, ALAT, LDH, GLDH, CK, AP, γGT

• Substrate: Kreatinin, Harnstoff, Glukose, Laktat

• Mineralstoffe und Spurenelemente: Kalzium, Magnesium, Phosphat, Serum-Eisen, Kupfer und Zink.

Dabei kamen die Fotometer Uvikon 930 (Fa. Kontron Instruments Bio-Tek, Deutschland, Neufahrn) und Uvikon XL (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn) zum Einsatz.

Zur Bestimmung der Enzyme und Laktat wurden vor Messbeginn die Reagenzien und PMMA-Küvetten auf 25 °C vortemperiert. Die Temperierung wurde während der Messdauer im Fotometer durch wassergewärmte Küvettenhalterungen fortgesetzt.

Für die Pipettierarbeiten von einem Probenvolumen bis zu 80 µl und einem Reagenzienvolumen von bis zu 1000 µl kam der Pipettierautomat MicroLab^® 1000 (Fa. HAMILTON Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz) zum Einsatz. Größere Volumina wurden von Hand pipettiert.

Die Reaktionsgemische zur Bestimmung von GLDH, Gesamt-Protein, Laktat und Phosphat wurden selbst hergestellt (Tabelle 3.8.3). Zur Glukose-Messung wurde das Test-Kit Gluco-quant ^® Glucose HK und zur Kalzium-Bestimmung das Kalzium-Test-Kit o-Kresolphthalein-Methode (Fa. Roche, Mannheim) verwendet. Alle anderen Test-Kits stammten von Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin (Fa. L+T, Berlin).

Die Feststoffchemikalien zur Herstellung der Reaktionsgemische für die Bestimmung von GLDH, Phosphat, Laktat und Protein (Tab. 3.8.3) wurden von Fa. Merck, Mannheim bezogen, die flüssigen Chemikalien stammten von Fa. Carl Roth, Karlsruhe. Die bei der Laktat-Bestimmung verwendeten Enzyme GPT und LDH wurden von Fa. Boehringer Ingelheim hergestellt.

Als Relativprobe mit bekannter Phosphat- und Kalzium-Konzentration diente der Multikalibrator für automatische Systeme der Fa. L+T, Berlin.

Zur Berechnung der Analytenkonzentration aus der gemessenen Extinktionsdifferenz wurde das Lambert-Beersche-Gesetz angewendet, nach dem die Absorbanz E bei

konstanter Schichtdicke d (cm) und Wellenlänge λ der Konzentration des Analyten c (mol/l) direkt proportional ist: Eλ = F × c × d und c = Eλ / ε mol × d

Berechnung der Faktoren F (Tab. 3.8.1) zur Ermittlung der Konzentration des Analyten aus der Extinktion:

d × Gesamtvolumen

F= ΔE × —————————————— × Verdünnung

Probenvolumen × ε mol

ΔE: Differenz zweier zu verschiedenen Zeitpunkten gemessenen Extinktionen

d: Schichtdicke der Küvette, hier 1 cm

Gesamtvolumen: Probenvolumen + Reaktionsgemischvolumen

ε mol: molarer Extinktionskoeffizient, Lichtabsorbtionsfähigkeit eines Analyten bei einer bestimmten Wellenlänge und Temperatur, abhängig von der Molekülstruktur, in L × mol^-1 × cm^-1

Die genaue Beschreibung der manuellen Durchführung klinisch-chemischer Bestimmungen erfolgt im Anhang (s. Kapitel 11.1).

In Tabelle 3.8.2 werden die manuellen Methoden der klinischen Chemie beschrieben. Wurde die Messtemperatur vom Hersteller mit Raumtemperatur angegeben, fand die Bestimmung je nach Jahreszeit im Labor bei Temperaturen zwischen 20-25°C statt. Die Angaben des relativen Variationskoeffizienten (VK%) stammen aus 20 Messwerten der Qualitätskontrolle Normal, Fa. L+T, Berlin.

Für die Bestimmung der Parameter GLDH, L-Laktat, Gesamt-Protein und Phosphat wurden keine Testkits, sondern Reaktionsgemische aus Eigenherstellung verwendet (Tab. 3.8.3).

Tabelle 3.8.1: Analysebedingungen für fotometrische Bestimmungsparameter unter Angabe des molaren Extinktionskoeffizienten und der Berechnungsfaktoren F

Parameter nm F Messtemp

°C Probe µl

Reagenz-gemisch µl εmol* Substrat

GLDH 365 2,21 25 80 520 3,4 NADH¹⁾

LDH 365 17,94 25 10 600 3,4 NADH

ASAT 365 2,13 25 80 500 3,4 NADH

ALAT 365 2,13 25 80 500 3,4 NADH

γGT 405 0,76 25 80 500 9,5

5-Amino-2-Nitrobenzoat

AP 405 3,29 25 10 600 18,53

pNitrophenyl-phosphat

CK 365 34,57 25 5 600 3,5 NADPH²⁾

Laktat 334 10,78 25 50 1:6 500 6,18 NADH

Protein 546 184,00 20-25 20 1000 2,77 Biuret

*ε mol: molarer Extinktionskoeffizient (bei jeweiliger Wellenlänge und 25°C in L × mol^-1 × cm^-1)

1)NADH: reduziertes Nicotinamidadenindinukleotid

2)NADPH: reduziertes Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

Parameter Methode Reaktion Probe (µl) λ (nm) T (°C) VK (%) GesBb Jendrassik-Grof

(Fa. L+T, Berlin) p-Aminobenzol-Sulfonsäure + Bilirubin Azofarbstoff Plasma 200 578 20-25 12,5 DirBb Jendrassik-Grof

(Fa. L+T, Berlin) p-Aminobenzol-Sulfonsäure + Bilirubin Azofarbstoff Plasma 200 546 20-25 14,8

GP Biuret nach

Weichselbaum Biuret-Reagenz (Cu-Ionen) + Tripeptid Voilettfarbstoff Plasma 40 546 20-25 4,1 Alb Bromkresolgrün

(Fa. L+T, Berlin) Albumin + BCG Albumin-BCG-Farbkomplex Plasma 10 578 20-25 11,0

ASAT opt. DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-Aspartat + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Oxalacetat,Oxalacetat

+ NADH +H⁺ L-Maleat + NAD⁺ Plasma 80 365 25 8,7

ALAT opt. DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-Alanin + α-Ketoglutarat ^ALT L-Glutamat + Pyruvat,

Pyruvat +NADH + H^{+ LDH} Lactat + NAD⁺ Plasma 80 365 25 11,2

GLDH nach Bergmeyer 2-Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD⁺+ H2O Plasma 80 365 25 10,7 LDH opt. DGKC 1972

P-LDH (Fa. L+T, Berlin) Pyruvat + NADH + H⁺ Lactat + NAD⁺ Plasma 10 365 25 7,3

AP opt. DGKC

(Fa. L+T, Berlin) p-Nitrophenylphosphat + H₂O Phosphat + Nitrophenol Plasma 10 405 25 5,7 CK NAC akt. IFCC

(Fa. L+T, Berlin)

Creatinphosphat +ADP Creatin + ATP, ATP+ Glucose Glucose-6-P +

ADP, Glucose-6-P + NADP Gluconat-6-P + NADPH + H⁺ Plasma 5 365 25 11,6

γGT SZASZ (1974) DGKC (Fa. L+T, Berlin)

L-γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid + Glycylglycin

L-γ-Glutamylglycyl + 5-Amino-2-nitrobenzoat Plasma 80 405 25 7,2

T (°C): verwendete Inkubations-, Messtemperatur VK (%): relativer Variationskoeffizient, ermittelt aus 20 Messwerten der Qualitätskontrolle Normal

Parameter Methode Reaktion Probe (µl) λ ( nm) T (°C) VK (%) Krea PAP enzymatisch (Fa. L+T, Berlin) Abbau des Kreatinins zu Glycin und H2O2,

Glycin + ADPS Chinominin-Farbstoff Plasma 50 546 25 5,76

Hst UV, kinetisch (Fa. L+T, Berlin) Abbau des Hst zu Glutamat, dabei Verbrauch von NADH Plasma 5 365 25 10,3

L-Laktat abgewandelt nach Bergmeyer Laktat + NAD Pyruvat + NADH Plasma 50* 1:6 334 25 5,47

Gluk Gluco-quant Glucose/HK

(Fa. Roche, Basel, Schweiz) Glk+ATP G-6-P + ADP, G-6-P + NADP G-6 + NADPH Plasma 50* 1:6 334 20-25 2,76

Ca Kresolphthalein (Fa. Roche, Basel,

Schweiz) Ca+o-Kresolphthalein Ca-o-Kresolphthalein-Komplex Plasma 10 546 20-25 3,49

Mg Calmagit (Fa. L+T, Berlin) Mg + Calmagit Mg-Calmagit-Komplex Plasma 10 546 20-25 3,31

P Molybdänblau Phos-Molybdänsäure-Komplex, Reduktion mit Ascorbat zu

Molybdänblau Plasma 100 578 20-25 3,82

Fe ^Ferrozine® ohne Enteiweissung (Fa. L+T, Berlin)

Freisetzen des Fe vom Transferrin, Reduktion mit Ascorbat,

Eisen-Ferrozine-Farbkomplex Serum 80 546 20-25 4,38

lEBK Fällungsreagenz (Fa. L+T, Berlin) Sättigung des Transferrins mit Fe-Überschuss, Absorbtion

ungebundenen Fe an MgCO3, Fe-Transferrin-Komplexe Serum 250 578 20-25 7,12

K Flammfotometrie Anregung der Atome in der Flamme,

Messung der Emissionsstrahlung Plasma 100 - - 0,92

Na Flammfotometrie Anregung der Atome in der Flamme,

Messung der Emissionsstrahlung Plasma 100 - - 0,57

Cu 3,5-DiBr-PAESA (Fa. L+T, Berlin) Freisetzung des an Coeruloplasmin gebundenen Cu,

Farbkomplex mit 3,5DiBr-PAESA Plasma 50 578 20-25 14,49

Zn Chromogen 5-Br-PAPS ohne Enteiw. (Fa. L+T, Berlin)

Freisetzung des Zn aus Proteinbindung,

Farbkomplex mit 5Br-PAPS Plasma 60 546 20-25 11,78

Hämolyse zur Phospor-Korrektur:

Cyan-Methämoglobin Hexacyanoferrat zu Cyan-Met-Hämoglobin (brauner Farbstoff) Plasma 100 546 20-25

-*100 µl Plasma in 500 µl HCLO4 (1:6), 10 min zentrifugieren bei 13×g und Überstand zur Laktat- u. Glukose-Bestimmung einsetzen

Tabelle 3.8.3: Manuelle Methoden in der klinischen Chemie mit Reaktionsgemischen aus Eigenherstellung

GLDH L-Laktat n.

Bergmeyer

Gesamt-Protein (Biuret)

Phosphat (Molybdänblau) Puffer: 1,467 g

TRAP-EDTA (pH 8,0 TRAP 79 mM, EDTA 3,95 mM) + 0,147 g

EDTA-NaTitriplex in 80 ml A.

dest. lösen, mit 1,6 ml 2 Kupfer-Sulfat, auflösen, +0,5 g Kalium-Jodid, mit 0,2 n NaOH ad 100 ml

Pyrosulfit-Borat: 10 g Natrium-Tetraborat 381,37 Mol + 9 g

Natrium-Pyrosulfit 190,11 Mol ad 500 ml A. dest.

Molybdänsäure: 25 g Ammoniumheptamo- lybdat in 1N H2SO4 ad 500 ml

NADH: 10 mg (13,4 mM) + 1 ml 1% NaHCO3

1 N NaOH Hydrochinon-Ascorbat:

250 mg Hydrochinon 90 mM + 25 mg Ascorbat 5 mM mit A.dest. ad 25 ml NH₃-Acetat: 608 mg

(1,58 M) + 5 ml A. dest.

NAD Carbonat-Sulfit: 3,5 g

Natrium-Sulfit + 21 g Natrium-Carbonat mit A.

dest. ad 500 ml α-Ketoglutarat: 30 mg

(0,273 M) + 0,6 ml A.

dest. + 0,4 ml 1n NaOH

HClO₄ zum

Enteiweißen der Probe 1:6

L-Glutaminsäure+ 0,3 ml 1N NaOH+ 1,246 ml GPT 10 µl/Probe

20 ml Stammlösung mit Verdünnungslösung ad inkubieren, +20 µl α-Ketoglutarat

50 µl 1:6 Probe+ 500 µl Gemisch,

20 µl Probe + 1000 µl Gemisch, Proben-Leerwert mit 1000 µl 0,2n NaOH

1 ml Pyrosulfit-Borat + 100 µl Probe + 0,25 ml Molybdat + 0,25 ml Hydrochinon, 15 min inkub., +2,5 ml Carbonat-Sulfit

546 nm, 20-25°C, gegen Proben-Leerwert, Reagenzien-Leerwert subtrahieren, F=184

578 nm, 20-25°C, gegen Reagenzien-Leerwert, Ermittlung über die bekannte Konzentration eines mitgemessenen Multikalibrators

Reaktionsgemisch-Rezepturen

3.8.2 Klinische Chemie mit automatisierten Messmethoden, Methodenvergleich manuell vs. automatisch

Ab Januar 2006 wurden die Enzyme ASAT, ALAT, AP, γGT, CK, LDH und die Parameter Gesamt-Bilirubin, Kreatinin und Harnstoff bei 37°C mit dem Autoanalyser Cobas Mira Plus (Fa. Roche, Mannheim) gemessen. Es wurden wie für die manuellen Methoden die Reagenzien der Fa. L+T, Berlin verwendet. Lediglich zur Bestimmung der AP wurde ein Reagenz der Fa. WAK Chemie GmbH, Steinfeld verwendet.

Vor Beginn der Messungen wurde über Doppelbestimmungen von 60 Proben, welche sich nach Möglichkeit über das gesamte Messspektrum verteilten, manuell und am Cobas Mira Plus die Gleichwertigkeit der Methoden überprüft und Korrelation, Bestimmtheitsmass und ein linearer Zusammenhang ermittelt.

Korrelationen mit r (spearman)>0,80 wurden als ausreichend bewertet und die Messwerte verwendet.

In Tabelle 3.8.4 werden die automatisiert durchgeführten Messmethoden beschrieben. Alle Messungen wurden bei 37°C durchgeführt und die Messwerte für die gemeinsame Auswertung mit den Daten aus der manuellen Bestimmung anschliessend auf 25°C umgerechnet.

Aus 20 Messwerten des Qualitätskontrollserums Normal, Fa. LT, Berlin wurde der relative Variationskoeffizient (VK%) für den jeweiligen Blutmesswert ermittelt (Tab.

3.8.4).

Tabelle 3.8.4: Methoden der automatisierten klinischen Chemie (Cobas Mira Plus) und Angabe der ermittelten Variationskoeffizienten (VK %)

Parameter Methode Reaktionssubstrate Probe λ (nm) T (°C) VK (%)

GesBb Jendrassik-Grof

(Fa. L+T, Berlin) p-Aminobenzolsäure 20 µl Plasma 550 37°C 3,03

ASAT opt. DGKC (Fa.

L-Alanin + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Pyruvat,

Kreatinphosphat + ADP Kreatin + ATP, ATP + Glukose Glukose-6-P + ADP, Glukose-6-P + NADP

Glukonat-6-P + NADPH + H⁺ L-y-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid + Glycylglycin

L-y-Glutamylglycyl + 5-Amino-2-nitrobenzoat

5 µl Plasma 405 37°C 2,42

Krea PAP enzymatisch (Fa. L+T, Berlin)

EHSPT, Creatininase,

Sarcosinoxidase 10 µl Plasma 550 37°C 5,60

Hst UV kinetisch (Fa. L+T, Berlin)

NADH-Abnahme, Urease,

GLDH 20 µl Plasma 340 37°C 4,47

Tabelle 3.8.5: Vergleich der manuellen Analysemethoden mit den automatisierten Methoden (Cobas Mira Plus)

Manuell Automatisch Manuell Automatisch Manuell Automatisch Methode

CK NAC akt.

IFCC

CK NAC akt.

IFCC opt. DGKC opt. DGKC opt. DGKC opt. DGKC

Probvol (μl) 5 8 10 8 80 20

Reagvol (μl) 600 200 600 200 500 200

λ (nm) 365 340 405 405 365 340

T (°C) 25 37 25 37 25 37

Manuell Automatisch Manuell Automatisch Manuell Automatisch Methode opt. DGKC opt. DGKC

SZASZ

Reagvol (μl) 500 200 500 200 600 200

λ (nm) 365 340 405 405 365 340

T (°C) 25 37 25 37 25 37

Manuell Automatisch Manuell Automatisch Manuell Automatisch Methode

enzymatisch UV kinetisch UV kinetisch

Probvol (μl) 200 8 50 10 5 20

Reagvol (μl) 820 200 500+100 150+50 600 200

λ (nm) 578 550 546 550 365 340

3.9 Flammfotometrie, Bestimmung von Natrium und Kalium im Plasma

Bei der Flammfotometrie wurde das Plasma verdampft und dabei die Elektrolyte atomisiert. Die Elektronen der Atome absorbierten in einer Propangasflamme Energie, die sie später wieder als Licht einer für das jeweilige Element

charakteristischen Wellenlänge abstrahlten und dessen Intensität proportional zur Konzentration des Elements war.

Die Elektrolyte Natrium und Kalium wurden mit Hilfe des Flammfotometers Typ 480 Flame Fotometer (Fa. CIBA Corning Diagnostics GmbH, Halstead Essex, England) ermittelt.

Zur Einfärbung der Flamme wurde ein Lithium-Standard (Fa. Bayer Health Care UC, East Wale Pole, USA) verwendet.

Die Eichung erfolgte vor jeder Inbetriebnahme mit A. dest. als Nullwert und mit dem MultiCal^TM (Fa. Bayer HealthCare, Leverkusen) mit bekannter Kalium- und Natriumkonzentration.

3.10 Qualitätskontrolle

Als Richtigkeitskontrolle wurden die Kontrollseren Normal und Abnormal von Fa.

L+T, Berlin verwendet. Diese wurden bei jeder Serie mitgeführt. Lag der gemessene Wert außerhalb des 2s-Bereichs, wurde die Messung wiederholt.

Als Präzisionskontrolle diente ein laborinterner Serum-Standard aus Eigenherstellung, bei dem bereits aus Wiederholungsmessungen über einen vierwöchigen Zeitraum ein 2s-Bereich ermittelt worden war. Dieser Präzisionsstandard wurde bei jeder vierten Messung mitgeführt. Es wurden nur Werte innerhalb des 2s-Bereichs akzeptiert.

Die Berechnung der relativen Variationskoeffizienten (VK%) erfolgte aus 20 Messwerten des Kontrollserums Normal an verschiedenen Tagen.

Lagen die Kontrollen trotz Einhaltung der „good laboratory practice“ ausserhalb des 2s-Bereiches, wurde zunächst die betreffende Serie wiederholt. Bei erneuter Fehlermessung wurden die Reagenzien und das A. dest. erneuert und ein neuer Kontrollstandard verwendet, ggf. wurden Gefäße, Messtemperatur, Fotometereichung und Pipettenvolumina überprüft.

Alle Messungen wurden dokumentiert und die Messdaten archiviert.

Der Autoanalyser Cobas Mira Plus wurde täglich bei Inbetriebnahme mit dem Multikalibrator für automatische Systeme (Fa. L+T, Berlin) bei 37°C kalibriert und mit der Kontrollserum Human und Human High (Fa. SERO AS, Billingstad, Norwegen) sowie dem laborinternen Präzisionsstandard überprüft. Darüber hinaus wurden bei jeder Messreihe auch die Kontrollseren Normal und Abnormal (Fa. L+T, Berlin) mitgeführt.

3.11 Statistische Bearbeitung

Die Auswertung und statistische Bearbeitung erfolgte mit den Programmen Excel®

Version 2003 (Fa. Microsoft GmbH, Unterschleißheim) und SAS Version 9.1 2006 (Fa. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

3.11.1 Selektion der Ausreißer

Zunächst wurde das Verhältnis eines auffälligen Einzelwertes zur Verteilung aller 933 Messwerte in einem Histogramm beurteilt. Erhärtete sich so der Verdacht, dass es sich um einen Ausreisser handelte, wurde der sog. Dixon Range angewendet: Werte, deren Abstand zum nächst höheren bzw. niedrigeren Wert mehr als ein Drittel der gesamten Spannweite überschritten, wurden als Ausreißer betrachtet und a priori aussortiert. Diese Methode wird von der IFCC empfohlen, da sie auch bei moderater Abweichung von der Normalverteilung angewendet werden kann. Starke Hämolyse sowie Lipämie führten ebenfalls zum Ausschluss der betroffenen Proben. Insgesamt wurden 16 Proben (1,7%) ganz aus der Studie herausgenommen, da das Blutbild Hinweise auf eine pathologisches Geschehen erbrachte. 57 Einzelmesswerte (0,18%) kamen ebenfalls nicht zur Auswertung. Entweder war eine korrekte Bestimmung des Wertes aus technischen Gründen (Gerinnung, starke Hämolyse oder Lipämie) nicht möglich oder der Wert überschritt den oben beschriebenen Abstand zum nächsten Wert.

3.11.2 Test auf Unterteilungsnotwendigkeit

Um die verschiedenen Probengruppen in jedem Parameter auf Unterschiedlichkeit zu testen, wurde ein nicht-parametrischer Test für nicht normalverteilte unverbundene Stichprobengruppen (PROC NPAR1WAY WILCOXON, SAS)

verwendet. Die große Zahl von Vergleichen (49/2 × (49-1) 1176 × 39 = 45864 bei 49 Probengruppen und 39 Blutparametern) hatte eine starke Absenkung des Signifikanzniveaus durch die α-Adjustierung nach Bonferroni für die versuchsbezogene Irrtumswahrscheinlichkeit zur Folge, so dass es nicht möglich war, Unterschiede zwischen allen Probengruppen zu ermitteln. Deshalb wurden zunächst für jede der 49 Probengruppen und jeden Blutparameter separate Referenzintervalle erstellt. Diese Intervalle wurden nach ihrer Ähnlichkeit sortiert und anschließend Gruppen mit gleichenden Intervallen so zusammengefasst, dass praktikable Referenzintervalle für die wichtigsten Alters- und Reproduktionsstadien entstanden. Der Rasseeinfluss wurde dabei z. T. vernachlässigt, um dem Alterseinfluss vorrangig Rechnung zu tragen. Aus den 49 Probengruppen wurden so 18 Referenzgruppen nach dem Shema in Tab. 3.11.2 gebildet.

3.11.3 Test der Verteilungsart und Ermittlung von Referenzintervallen

Die Verteilungssymmetrie jedes Parameters wurde optisch mit Hilfe von Histogrammen und Boxplots (PROC UNIVARIATE, SAS) beurteilt. Da die meisten Parameter jedoch nicht normalverteilt waren, wurden für Stichprobengruppen alle Referenzintervalle einheitlich nicht-parametrisch als zentrales 95 %-Intervall angegeben (SOLBERG 1983). Das bedeutet für einseitige Parameter, deren untere Referenzgrenze null ist, dass die obere Referenzgrenze beim 95 %-Quantil liegt (0-95%), während Parameter, deren untere Grenze nicht null ist, als obere Referenzgrenze das 97,5 %-Quantil haben (2,5 - 97,5 %). Für Stichprobengruppen mit n< 40 wurden Minimum-Maximum-Intervalle angegeben.

3.11.4 Test des Einflusses von Alter, Rasse und Reproduktionsstadium

Zunächst wurde der Einfluss des Alters auf die Blutparameter bzw. der Einfluss von Rasse und Reproduktionsstadium über möglichst gleichaltrige Tiere durch die Überprüfung der Globalhypothese (Kruskal-Wallis-Test, PROC NPAR1WAY, SAS) getestet. Danach wurden für Blutparameter mit einer offensichtlichen Änderung mit dem Lebensalter Diagramme (Excel, Fa. MS) erstellt, bei denen die Messwerte gegen das Lebensalter aufgetragen wurden und Boxplots (SAS) erstellt, indem die Referenzindividuen in eigens für diesen Zweck neu definierten Altersgruppen 1-5 (bis

90. Lebenstag) bzw. 1-12 (bis 1163. Lebenstag) zusammengefasst wurden, die nicht mit den Referenzgruppen übereinstimmen. Es wurden Altersabhängigkeiten nur für diejenigen Blutparameter genauer untersucht und deren Veränderung mit dem Lebensalter dargestellt, welche offensichtlich gravierende Änderungen mit steigendem Lebensalter erfuhren. Benachbarte Altersgruppen wurden mittels Wilcoxon-Test (SAS, NPAR1WAY WILCOXON) auf signifikante Unterschiede untersucht. Da es sich größtenteils um nicht normalverteilte Parameter handelt, wurde statt des Mittelwertes der Median (50%-Wert) angegeben. p-Werte aus dem Wilcoxon-Test kleiner als 0,05 werden als signifikant und unter 0,005 als hochsignifikant betrachtet.

Für Parameter, die sich in der Globalhypothese als signifikant von der Rasse beeinflusst gezeigt hatten, wurden signifikante Unterschiede zwischen BHZP- und PIC-Genetik für die jeweiligen Altersgruppen (Saugferkel, Zuchtsauen und Mastschwein) mittels statistischem Vergleich im Wilcoxon-Test ermittelt. Für die Unterschiede zwischen den BHZP-Reinzuchtlinien 01, 03, 05 und 06 wurden die Signifikanzen aus dem Kruskal-Wallis-Test verwendet und eine descriptive Statistik zugefügt.

Der Einfluss des Reproduktionsstadiums (güst, hochtragend, laktierend) wurde ebenfalls mit dem Kruskal-Wallis-Test ermittelt (Tab. 3.11.1).

3.11.5 Methodenvergleich

Zum Vergleich der Messwerte der manuellen und der automatisierten Messmethoden der Parameter ASAT, ALAT, LDH, AP, CK, γGT, Harnstoff, Gesamt-Bilirubin und Kreatinin wurde ein F-Test und eine Korrelationsberechnung nach Spearman für nicht normal verteilte Stichprobengruppen durchgeführt (PROC KORR SPEARMAN, SAS). Anschliessend wurde mit Excel eine lineare Regression ermittelt.

Die Diagramme wurden ebenfalls mit Excel erstellt.

Tabelle 3.11.1: Statistische Ermittlung des Einflusses einer Variablen (Alter, Rasse, Reproduktionsstatus) mittels Kruskal-Wallis-Test und Test auf Unterschiedlichkeit zweier nicht normalverteilter Gruppen in einer Variablen mittels Wilcoxon-Test

Gruppe Alters-/Reprod.-Gruppe Variable Test

alle alle Alter Kruskal-Wallis

Altersgruppen 1-12 alle Alter Wilcoxon*

1, 2, 13, 14 BHZP-/PIC-Saugferkel Rasse Kruskal-Wallis

1, 2 vs.13, 14 BHZP-/PIC-Saugferkel Rasse Wilcoxon*

46, 47, 48, 49 BHZP-/PIC-Mast Rasse Kruskal-Wallis

46, 47 vs. 48, 49 BHZP-/PIC-Mast Rasse Wilcoxon*

5-7, 17-19 güste u. hochtrag.

BHZP-/PIC-JS Rasse Kruskal-Wallis

5, 6, 7 vs.17,18, 19 güste u. hochtrag.

BHZP-/PIC-JS Rasse Wilcoxon*

8, 10, 12, 20, 22, 24 lakt. BHZP-/PIC-Sauen Rasse Kruskal-Wallis 8, 10, 12 vs. 20, 22, 24 lakt. BHZP-/PIC-Sauen Rasse Wilcoxon*

25, 27, 29, 31 BHZP-Reinzuchtlinien güst Rasse Kruskal-Wallis 26, 28, 30, 32 BHZP-Reinzuchtlinien

hochtragend Rasse Kruskal-Wallis

5-12, 17-24 BHZP-/PIC-Zuchtsauen Reprod Kruskal-Wallis

*ohne α-Adjustierung nach Bonferroni

Tabelle 3.11.2: Bildung von 18 Referenzgruppen aus 49 Probengruppen

Gruppe n Genetik Linie/Alter Gruppe n Genetik/

Linie

Forts. Tab. 3.11.2: Bildung von 18 Referenzgruppen aus 49 Probengruppen

Gruppe n Genetik Linie/Alter Gruppe n Genetik/

Linie Alter/Reprod LT ⎯x

Probengruppen Referenzgruppen

Eber 230 LT 226

37 5 BHZP Eber Pi PP

230. LT

39 10 BHZP Eber 65 220.

LT

38 9 BHZP Eber Ha 230.

LT 16 9 Hampshire Eber 230 LT 227

8 24 BHZP JS lakt

18 17 Deutsche

Landrasse

Eber 365-730 LT

4 Ergebnisse

4.1 Referenzintervalle

Alle Angaben für Referenzintervalle erfolgen für Stichprobengruppen mit n≥40 als zentrales 95 %-Intervall. Für Stichprobengruppen n<40 erfolgen die Angaben als Minimum-Maximum-Intervall. Da nicht immer alle Proben zur Untersuchung gelangten bzw. das Messergebnis in die Statistik einbezogen werden konnte, variieren die n-Zahlen für die Einzelparameter.

Alle Referenzintervalle gelten für eine Messtemperatur bei 25°C (Enzyme, Hst, Krea, Lakt) bzw. Raumtemperatur (GesBili, DirBili, GP, Alb, Gluk, Ca, Mg, P, Fe, lEBK, Cu, Zn).

4.1.1 Hämatologie

Im Folgenden sind in den Tabellen 4.1.1 bis 4.1.6 die Referenzintervalle für die hämatologischen Parameter aufgeführt.

Tabelle 4.1.1: Referenzintervalle für Hämoglobin (Hb), Hämatokrit (Hkt) und Erythrozyten (Ery)

Genetik Alter/Reprod LT ⎯x LT

min-max n Hb mmol/l Hkt l/l Ery T/l

31 BHZP Aufzucht 110 LT

5,59-8,50 0,28-0,41 5,27-7,33

BHZP/PIC Saugf 5.-27. LT 15,6 5-27 49-64 Endprodukt

BHZP/PIC Saugf 2. LT 1,8 1-3

Endprodukt 01, 03 BHZP JS 230 LTgüst 224 197-237

250 180-360

47-48 05, 06 BHZP JS 230 LT güst 229 223-230

31 BHZP,

23 PIC JS Laktation 377 350-431

46-47 23 PIC AS 2./3.Trächtigk 525 450-661 49-51 31 BHZP AS 2./3.Trächtigk 522 418-637

23-26 05, 06 BHZP AS 2./3.Trächtigk 493 333-633 20-24 01, 03 BHZP AS 2./3.Trächtigk 547 446-739

43-45 23 PIC AS 2./3. Lakt. 576 476-722 46-47 31 BHZP AS 2./3. Lakt. 570 480-757

16-24

Hampshire Eber 230 LT 227 218-230 5-9 Piétrain

NN/NP/PP, 65 BHZP

Eber 230 LT 226 201-258

32-34 Deutsche

Landrasse Eber 365-730 LT 706 353-1163 16-17 Piétrain

NN/NP/PP Eber 365-730 LT 798 442-1115

Tabelle 4.1.2: Referenzintervalle für Erythrozytenindizes MCHC, MCH und MCV

Genetik Alter/Reprod LT ⎯x LT

min-max n MCHC

mmol/l MCH fmol MCV fl

31 BHZP Aufzucht 110 LT

32-34 Deutsche

Landrasse Eber 365-730 LT 706 353-1163 16-17 Piétrain

NN/NP/PP Eber 365-730 LT 798 442-1115

16-24

Hampshire Eber 230 LT 227 218-230 5-9 Piétrain

NN/NP/PP 65 BHZP

Eber 230 LT 226 201-258

43-45 23 PIC AS 2./3. Lakt. 576 476-722 46-47 31 BHZP AS 2./3. Lakt. 570 480-757

23-26 05, 06 BHZP AS 2./3.Trächtigk 493 333-633 20-24 01, 03 BHZP AS 2./3.Trächtigk 547 446-739

46-47 23 PIC AS 2./3.Trächtigk 525 450-661 49-51 31 BHZP AS 2./3.Trächtigk 522 418-637

47-48 05, 06 BHZP JS 230 LT güst 229 223-230

31 BHZP,

23 PIC JS Laktation 377 350-431

25 31 BHZP,

23 PIC

JS 180 LT

23-24 01, 03 BHZP JS 230 LTgüst 224 197-237

250 180-360

BHZP/PIC Saugf 5.-27. LT 15,6 5-27 49-64 Endprodukt

BHZP/PIC Saugf 2. LT 1,8 1-3

18,62-34,38 1,07-1,47 36,62-76,52

Tabelle 4.1.3: Referenzintervalle für Leukozyten (Leuk) und Thrombozyten (Thromb)

Genetik Alter/Reprod LT ⎯x LT min-max n Leuk G/l Thromb G/l

31 BHZP Aufzucht 110 LT

11,8-22,2 246-646

Landrasse Eber 365-730 LT 706 353-1163 16-17 Piétrain

NN/NP/PP Eber 365-730 LT 798 442-1115

4,1-17,2 166-520 3,9-19,7 282-946

16-24

Hampshire Eber 230 LT 227 218-230 5-9

Piétrain NN/NP/PP, 65 BHZP

Eber 230 LT 226 201-258

43-45 23 PIC AS 2./3. Lakt. 576 476-722 46-47 31 BHZP AS 2./3. Lakt. 570 480-757

23-26 05, 06 BHZP AS 2./3.Trächtigk 493 333-633 20-24 46-47 23 PIC AS 2./3.Trächtigk 525 450-661 49-51

223-230 31 BHZP,

23 PIC

01, 03 BHZP AS 2./3.Trächtigk 547 446-739

01, 03 BHZP AS 2./3.Trächtigk 547 446-739

Im Dokument Aktualisierung von Blutparametern beim Schwein (Seite 94-0)