7 Verifizierung der Wirksamkeit der aus Passiflora incarnata L. isolierten
9.1 Allgemeine Methoden und Materialien
9.1.1 Ligandenfischen
9.1.1.8 Ligandenfischversuche mit IGF-1-RTK
170 9 Experimenteller Teil
Tab. 27: Pipettierschema Ligandenfischen mit Pegenon und Desoxypeganin
Probe 51 51 Blind 52 52 Blind
TGT 50 µl /
800 pmol
- 50 µl / 800 pmol
-
Substanzlösung 1 100 µl 100 µl - -
Substanzlösung 2 - - 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 02) 150 µl 200 µl 150 µl 200 µl
Inkubationstemperatur 37 °C 37 °C 37 °C 37 °C
Inkubationszeit 60 min 60 min 60 min 60 min
Filtrationsmethode U 01 U 01 U 01 U 01
Proben gelöst in Anfangsbedingungen 20 µl 20 µl 50 µl 50 µl HPLC-Methode zur Probenvermessung K 04 K 04 K 04 K 04 Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl 0,300 µl 0,300 µl
Kinase-Assay-9 Experimenteller Teil 171
Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Ü-berstand verwendet
Tab. 28: Pipettierschema Ligandenfischen aus Centellae asiaticae herba-Extrakten
Probe 53 53
Blind
54 54
Blind
55 55
Blind
IGF-1-RTK 200 µl /
400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
-
Extraktlösung 1 100 µl 100 µl - - - -
Extraktlösung 2 - - 100 µl 100 µl - -
Extraktlösung 3 - - - - 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl - 200 µl - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C Inkubationszeit 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min Filtrationsmethode U 04 U 04 U 05 U 05 U 04 U 04 Proben gelöst in
Anfangsbedingungen
20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl HPLC-Methode
zur Probenvermes-sung
K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04
Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 9.1.1.8.2 Ligandenfischen aus Extrakten aus Liquiritiae radix
Extraktlösung 1: 3,67 mg des Dichlormethanextraktes aus Liquiritiae radix gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer (PL 03) mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Ü-berstand verwendet
Extraktlösung 2: 1,08 mg des Dichlormethanextraktes aus Liquiritiae radix mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler in 150 µl Ethanol ge-löst; langsame Zugabe von insgesamt 850 µl Pufferlösung PL 03;
Filtration durch HPLC-Spritzenfilter S&S Spartan 13 mm/0,2 µm RC; Filtrat verwendet
Extraktlösung 3: 4,67 mg bzw. 3,96 mg des Methanolextraktes aus Liquiritiae radix mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler in 1 ml Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifu-giert; Überstand verwendet
172 9 Experimenteller Teil
Tab. 29: Pipettierschema Ligandenfischen aus Liquiritiae radix-Extrakten
Probe 56 56
Blind 57 57
Blind 58 58
Blind
IGF-1-RTK 200 µl /
400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
-
Extraktlösung 1 100 µl 100 µl - - - -
Extraktlösung 2 - - 100 µl 100 µl - -
Extraktlösung 3 - - - - 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl - 200 µl - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C Inkubationszeit 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min Filtrationsmethode U 05 U 04 U 05 U 05 U 04 U 04 Proben gelöst in
Anfangsbedingungen 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl HPLC-Methode zur
Probenvermessung
K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 9.1.1.8.3 Ligandenfischen aus Extrakten aus Lichen islandicus
Extraktlösung 1: 3,14 mg des Dichlormethanextraktes aus Lichen islandicus mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler in 150 µl Ethanol ge-löst; langsame Zugabe von insgesamt 850 µl Pufferlösung PL 03;
Filtration durch HPLC-Spritzenfilter S&S Spartan 13 mm/0,2 µm RC; Filtrat verwendet
Extraktlösung 2: 4,74 mg des Methanolextraktes aus Lichen islandicus mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler in 1 ml Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwendet
9 Experimenteller Teil 173
Tab. 30: Pipettierschema Ligandenfischen aus Lichen islandicus-Extrakten
Probe 59 59 Blind 60 60 Blind
IGF-1-RTK 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
-
Extraktlösung 1 100 µl 100 µl - -
Extraktlösung 2 - - 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C
Inkubationszeit 60 min 60 min 60 min 60 min
Filtrationsmethode U 05 U 05 U 04 U 04
Proben gelöst in
An-fangsbedingungen 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl
HPLC-Methode zur Probenvermessung
K 04 K 04 K 04 K 04
Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 9.1.1.8.4 Ligandenfischen aus Opiumtinktur
Lösung: 4,69 mg des nach Abrotieren des Lösungsmittels verbliebenen Rückstandes der Tinktur gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer (PL 03) mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler; unlösliche Be-standteile abzentrifugiert; Überstand verwendet
Tab. 31: Pipettierschema Ligandenfischen aus Opiumtinktur
Probe 61 61 Blind
IGF-1-RTK 200 µl / 400 pmol -
Lösung 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C
Inkubationszeit 60 min 60 min
Filtrationsmethode U 05 U 05
Proben gelöst in Anfangsbedingungen 20 µl 20 µl
HPLC-Methode zur Probenvermessung K 04 K 04
Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl
9.1.1.8.5 Ligandenfischen aus einem Extrakt aus Passiflorae herba
Extrakt: Passiflorae e herb. sicc.; Finzelberg GmbH & Co. KG; Ander-nach, Ch.-B.: 99120349
174 9 Experimenteller Teil
Extraktlösung: 4,66 mg mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler in 1 ml Pufferlösung PL 03 gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifu-giert; Überstand verwendet
Tab. 32: Pipettierschema Ligandenfischen aus einem Passiflorae herba-Extrakt
Probe 62 62 Blind
IGF-1-RTK 200 µl / 400 pmol -
Extraktlösung 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C
Inkubationszeit 60 min 60 min
Filtrationsmethode U 05 U 04
Proben gelöst in Anfangsbedingungen 100 µl bzw. 20 µl 100 µl bzw. 20 µl
HPLC-Methode zur Probenvermessung K 04 K 04
Einspritzvolumen 0,750 µl bzw.
0,150 µl
0,750 µl bzw.
0,150 µl
9.1.1.8.6 Ligandenfischen aus einem selektiven Dichlormethanextrakt aus der Rinde von Prunus africana (HOOK. F.) KALKM.
Extrakt: Extraktgewinnung durch S. Schleich; genaue Angaben dazu in Literatur [102]
Extraktlösung: 3,77 mg des Dichlormethanextraktes aus der Rinde von Prunus africana (HOOK. F.) KALKM. gelöst in 150 µl Ethanol mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler; langsame Zugabe von insge-samt 850 µl Pufferlösung PL 03; Filtration durch HPLC- Spritzen-filter S&S Spartan 13 mm/0,2 µm RC; Filtrat verwendet
9 Experimenteller Teil 175
Tab. 33: Pipettierschema Ligandenfischen aus einem Extrakt der Rinde von Prunus africana (HOOK. F.) KALM.
Probe 63 63 Blind
IGF-1-RTK 200 µl / 400 pmol -
Extraktlösung 100 µl 100 µl
Pufferlösung (PL 04) - 200 µl
Inkubationstemperatur 30 °C 30 °C
Inkubationszeit 60 min 60 min
Filtrationsmethode U 05 U 05
Proben gelöst in Anfangsbedingungen 20 µl 20 µl
HPLC-Methode zur Probenvermessung K 04 K 04
Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl
9.1.1.8.7 Ligandenfischen aus selektiven Extrakten aus Quebracho cortex sowie deren Fraktionen
Methode 1
Extraktlösung 1: 4,88 mg des selektiven Wasserextraktes aus dem analytischen Ansatz mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer PL 03; unlösliche Bestandteile ab-zentrifugiert; Überstand verwendet
Extraktlösung 2: 5,25 mg, 4,62 mg, 4,36 mg, 1,04 mg, 0,47 mg, 1,07 mg bzw.
0,51 mg des selektiven Methanolextraktes aus dem analytischen Ansatz mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer PL 03; unlösliche Bestandteile ab-zentrifugiert; Überstand verwendet
Extraktlösung 3: 5,05 mg, 4,60 mg bzw. 5,17 mg des selektiven Methanol-Wasserextraktes aus dem analytischen Ansatz mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer PL 03; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwendet
Extraktlösung 4: 2,61 mg des selektiven Dichlormethanextraktes aus dem analyti-schen Ansatz mit Hilfe von Ultraschall und Probenschüttler gelöst in 1 ml Kinase-Assay-Puffer PL 03; unlösliche Bestandteile ab-zentrifugiert; Überstand verwendet
Tab. 34: Pipettierschema Ligandenfischen aus selektiven Extrakten aus Quebracho cortex Probe 64 64 Blind 65 65 Blind 66 66 Blind 67 67 Blind 68 68 Blind 69 69 Blind IGF-1-RTK 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- 200 µl / 400 pmol
- Extraktlösung 1 100 µl 100 µl - - - Extraktlösung 2 - - 100 µl 100 µl - - - - 100 µl 100 µl - - Extraktlösung 3 - - - - 100 µl 100 µl - - - - 100 µl 100 µl Extraktlösung 4 - - - 100 µl 100 µl - - - - Pufferlösung (PL 03) - 200 µl - 200 µl - 200 µl - 200 µl - - - - Pufferlösung (PL 04) - - - 200 µl - 200 µl Inkubationstempera- tur 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C 30 °C Inkubationszeit 60 min 60 min60 min60 min60 min60 min60 min60 min60 min 60 min 60 min 60 min Filtrationsmethode U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 U 04 Proben gelöst in Anfangsbedingungen 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl HPLC-Methode zur Probenvermes- sung
K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 K 04 Einspritzvolumen 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl 0,150 µl
176 9 Experimenteller Teil
9 Experimenteller Teil 177
Methode 2
Extraktlösung 1: Gesamtmenge an Fraktion 4 des selektiven Methanolextraktes aus Quebracho cortex aus analytischem Ansatz mit Hilfe von Ultra-schall und Probenschüttler in 330 µl Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwen-det
Extraktlösung 2: Gesamtmenge an Fraktion 5 des selektiven Methanolextraktes aus Quebracho cortex aus analytischem Ansatz mit Hilfe von Ultra-schall und Probenschüttler in 330 µl Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwen-det
Extraktlösung 3: Gesamtmenge an Fraktion 6 des selektiven Methanolextraktes aus Quebracho cortex aus analytischem Ansatz mit Hilfe von Ultra-schall und Probenschüttler in 330 µl Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwen-det
Extraktlösung 4: Gesamtmenge an Fraktion 7 des selektiven Methanolextraktes aus Quebracho cortex aus analytischem Ansatz mit Hilfe von Ultra-schall und Probenschüttler in 330 µl Kinase-Assay-Puffer (PL 03) gelöst; unlösliche Bestandteile abzentrifugiert; Überstand verwen-det