Korrektur des Pufferbeitrages

Um die intrinsische Bindungsenthalpie ∆H_bind zu bestimmen, wurden die ITC-Experimente bei pH 7.8 und 25°C in vier verschiedenen Puffern mit unterschiedlichen Ionisierungs-enthalpien∆H_iondurchgeführt: Pyrophosphat, HEPES, TRICINE und TRIS (Kapitel 6.8). Die jeweiligen Meßpuffer enthielten 50 mM Puffersubstanz, 100 mM Natriumchlorid und 0.1 Gew.-% Polyethylenglykol 8000. In Tabelle 3.11 sind die verwendeten Puffersubstanzen mit ihren entsprechenden Ionisierungsenthalpien∆H_ionaufgeführt (siehe Kapitel 2.3.5).

Puffersubstanz Ionisierungsenthalpie∆H_ion(kJ/mol)

Pyrophosphat 5.12

HEPES 21.07

TRICINE 31.97

TRIS 48.07

Tabelle 3.11:Übersicht über die verwendeten Ionisierungsenthalpien bei 25°C. Die Werte beziehen sich auf die Deprotonierung der Puffersubstanz.

Werden gleichzeitig mit der Bindungsreaktion Protonen vom untersuchten System aufgenommen oder abgegeben, müssen der enthalpische Beitrag des Puffers bzw. die enthalpischen Beiträge der ionisierbaren Protein- bzw. Ligandengruppen, auf die diese Proto-nierungsreaktionen zurückzuführen sind, von der gemessenen Gesamtenthalpie ∆Hges

abgezogen werden, um die intrinsische Bindungsenthalpie ∆Hbind zu erhalten. Nach Abzug der Ionisierungsenthalpie des Puffers erhält man die korrigierte Enthalpie ∆H_x. Erst nach der anschließenden Korrektur um den enthalpschen Beitrag der ionisierbaren Protein- bzw.

Ligandengruppe ergibt sich die intrinsische Enthalpie∆Hbind(siehe nächstes Kapitel).

Trypsininhibition. Für1a, 1bMe, 1c, 1cMe, 1dAc und 3sind die gemessenen ∆Hges-Werte unabhängig vom Puffer in allen vier Puffern praktisch konstant (Tabelle 3.12). Das bedeutet, daß bei der Bindung dieser sechs Inhibitoren an Trypsin keine Protonen zwischen den Bindungspartnern Inhibitor und Enzym bzw. Inhibitor/Enzym und Puffer ausgetauscht werden. Bei der weiteren Betrachtung und Diskussion der intrinsischen Enthalpien∆Hbindfür diese sechs Substanzen gegenüber Trypsin werden im folgenden die Enthalpien ∆Hges

herangezogen, die für den Puffer Pyrophosphat gemessen wurden.

Es wurde beobachtet, daß die gemessenen Enthalpien ∆H_ges für 1b, 1d und 2 gegenüber Trypsin eine Abhängigkeit von der verwendeten Puffersubstanz zeigen. Bemerkenswert ist die Tatsache, daß für2 bei der Meßtemperatur von 25°C eine endotherme Reaktion in TRIS-Puffer beobachtet wird, in HEPES- bzw. Pyrophosphatpuffer hingegen eine exotherme Reaktion abläuft. Unter den Meßbedingungen des TRICINE-Puffers kann bei einer Meßtemperatur von 25°C kein enthalpischer Betrag beobachtet werden. Deshalb ist es auch nicht möglich, in diesem Falle die Stöchiometrie und die Bindungskonstante K bzw. die Freie Enthalpie∆G zu bestimmen.

Die Art der Abhängigkeit der Enthalpie ∆H_ges von der Ionisierungsenthalpie ∆H_ionist für 1b und 2 gleich. Die größten Enthalpien wurden in TRIS-Puffer gemessen, während in Pyrophosphat-Puffer, der die kleinste Ioninisierungsenthalpie aufweist, die am stärksten negativen Enthalpien ∆H_ges gemessen wurden. Im Gegensatz dazu wurde für 1d in TRIS-Puffer die stärksten negative Enthalpie gemessen, während die gemessene Enthalpie in Pyrophosphatpuffer den größeren Wert aufweist.

Enthalpie∆H_ges(kJ/mol) gegen Trypsin Substanz

TRIS TRICINE HEPES Pyrophosphat

1a -28.8±0.6 -27.8±1.2 -24.4±0.4 -27.1±1.1

1b -3.0±0.8 -16.9±0.3 -30.0±1.8 -42.0±0.8

1bMe -16.4±0.7 -15.9±0.5 -16.0±0.5 -16.9±0.8

1c -25.5±0.5 -- -25.5±0.8 -26.8±0.8

1cMe -40.7±0.6 -- -37.9±1.0 -39.6±1.0

1d -39.6±0.7 -30.1±1.0 -26.8±1.3 -16.4±1.0

1dAc -36.8±0.7 -- -34.4±0.8 -34.5±1.0

2 10.0±1.1 ~ 0 -10.0±0.9 -30.1±1.0

3 -25.6±0.5 -25.9±1.0 -24.7±1.2 -27.7±0.5

Tabelle 3.12:Gemessene Enthalpien∆H_gesfür verschiedene Inhibitoren in unterschiedlichen Puffern bei 25°C gegenüber Trypsin.*: Nicht bestimmt.

Thrombininhibition. Die Enthalpiewerte für 2Et und 3, die in TRIS-Puffer gemessen wurden, weichen von den jeweils anderen drei Enthalpiewerten, die in TRICINE-, HEPES-und Pyrophosphatpuffer gemessen wurden ab. Für 2Et wurde ein Wert von –34.7 kJ/mol gemessen, der maximal um 10.3 kJ/mol von dem größten der anderen gemessenen Enthalpien abweicht. Bei 3 beträgt der gemessene Wert ∆H_ges –57.7 kJ/mol und weicht maximal 9.2 kJ/mol von dem größten der anderen drei Enthalpiewerten ab. Während der in TRIS-Puffer gemessene Wert für4im Rahmen des Meßfehlers gleich den anderen Meßwerten für4 ist, weicht die Enthalpie, die für 5 in TRIS-Puffer gemessen wurde, um maximal 6.2 kJ/mol von dem kleinsten der anderen gemessenen Enthalpien ab.

Die drei Meßwerte in TRICINE-, HEPES- und Pyrophosphatpuffer sind im Rahmen der üblichen Meßungenauigkeit als gleich anzusehen. Eine Erklärung für die abweichenden Enthalpien (außer für4) aus dem TRIS-Puffer könnte der Ladungszustand der Puffersubstanz

sein, der die Eigenschaften des Enzyms möglicherweise beeinflußt. Der TRIS-Puffer unterscheidet sich durch seine positive Gesamtladung von allen anderen verwendeten Puffersubstanzen. Der TRICINE- bzw. HEPES-Puffer stellen bei pH=7.8 zwitterionische Verbindungen dar. Die Ionisierungsstufen des Pyrophosphats sind unter den angewandten pH-Bedingungen alle negativ geladene Spezies.

Allerdings werden nicht systematisch kleinere oder größere Werte für die Messungen in TRIS-Puffer gefunden. Daher scheint die Erklärung auf molekularer Ebene sehr komplex zu sein. Wegen dieses ungeklärten Phänomens sollen die TRIS-Werte der Thrombinbindung für die folgenden Betrachtungen nicht weiter berücksichtigt werden.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Ausnahmen bedeutet dies, daß bei der Bindung von 2Et, 3, 4 und 5 an Thrombin keine Protonen zwischen den Bindungspartnern Inhibitor und Enzym einerseits und dem Puffer andererseits ausgetauscht werden. Bei der weiteren Betrachtung und Diskussion der intrinsischen Enthalpien ∆Hbind dieser vier Substanzen gegenüber Thrombin werden im folgenden die Enthalpien ∆Hges verwendet, die für den Pyrophosphatpuffer gemessen wurden.

Enthalpie∆Hges(kJ/mol) gegen Thrombin Substanz

TRIS TRICINE HEPES Pyrophosphat

2 -41.9±0.9 -46.0±2.5 -57.7±0.6 -70.0±2.1

2Et -34.7±1.0 -24.9±0.7 -26.6±1.0 -24.4±0.9

3 -57.7±1.4 -50.8±0.6 -49.9±1.0 -48.5±1.0

4 -56.6±1.2 -55.6±1.0 -53.9±0.7 -57.8±2.0

5 -30.8±1.2 -34.9±1.1 -35.3±0.7 -37.0±1.2

Tabelle 3.13: Gemessene Enthalpien ∆H für verschiedene Inhibitoren in unterschiedlichen Puffern bei 25°C gegenüber Thrombin.

Napsagatran2zeigt gegenüber Thrombin gleiches Verhalten wie bei der Bindung an Trypsin.

Die in TRIS-Puffer gemessene Enthalpie ∆H_ges ist am kleinsten, dagegen tritt in Pyro-phosphatpuffer der am stärksten negative Wert auf.

Korrektur. Um die korrigierte Bindungsenthalpie ∆Hx zu bestimmen, wurden die ITC-Messungen bei pH=7.8 in Pufferlösungen mit unterschiedlichen Ionisierungsenergien durchgeführt (Christensen, 1976; Fukada, 1998). In Tabelle 3.11 sind die jeweiligen Ionisierungsenthalpien für die Puffersubstanzen aufgeführt (siehe auch Kapitel 6.8). Die Ionisierungsenthalpien ∆Hion beziehen sich jeweils auf die Deprotonierung der betrachteten funktionellen Gruppe (siehe Kapitel 2.3.5).

0 10 20 30 40 50

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10

HEPES Pyrophosphat

TRIS TRICINE

∆Hges(kJ/mol)

∆H_ion(kJ/mol)

Abbildung 3.11: Auftragung der gemessenen Enthalpie ∆H_ges gegen die Ionisierungsenthalpie ∆H_ion und anschließende lineare Regression. Die Anzahl n der vom Puffer übertragenen Protonen ergibt sich aus der Steigung der Regressionsgeraden und die korrigierte Enthalpie∆H_xaus dem Achsenabschnitt auf der Ordinate

∆H_ges. Eine positive Steigung der Regressionsgeraden bedeutet eine Protonenabgabe des Puffers und eine Protonenaufnahme des Enzym-Liganden-Systems. ¦ 1b-Trypsin, ?1d-Trypsin, ? 2-Trypsin, ? 2-Thrombin.

Nach Auftragung der gemessenen Wärmetönung ∆H_gesgegen die Ionisierungsenthalpie ∆H_ion des Puffers können durch lineare Regressionsanalyse die Anzahl der vom Puffer auf das Protein-Ligand-System übertragenen Protonen (Größe n) und die Enthalpie∆Hxder Reaktion, die die um∆Hionkorrigierte Reaktionsenthalpie∆Hgesdarstellt, bestimmt werden.

Die Größe n ergibt sich nach Gleichung 2.26 aus der Steigung der Regressionsgeraden und

∆Hxals Achsenabschnitt auf der Ordinate∆Hges(Abbildung 3.11).

Weil die gemessene Enthalpien ∆Hges für die Reaktion von 1b, 1d und 2gegenüber Trypsin und für die Reaktion von 2 gegenüber Thrombin vom verwendeten Puffer abhängig waren, wurde für diese Reaktionen die beschriebene Enthalpiekorrektur durchgeführt.

Es zeigt sich durch Auswertung der Abbildung 3.11, daß bei der Reaktion von1bmit Trypsin sowie bei den Reaktionen von 2 mit Trypsin und Thrombin Protonen vom Puffer abgegeben werden, die wiederum vom Enzym-Ligand-System aufgenommen werden, während bei der Komplexbildung von 1d mit Trypsin im Mittel 0.53 (±0.04) Protonen während des Bindungsschritts vom Enzym-Ligand-System an den Puffer abgegeben werden (Tabelle 3.14).

Ligand Enzym n ∆Hx

(kJ mol^-1)

1b Trypsin 0.90±0.06 -47.6±1.9

1d Trypsin -0.53±0.04 -14.3±1.3

2 Trypsin 0.93±0.12 -32.3±3.6

2 Thrombin 0.88±0.08 -75.1±1.8

Tabelle 3.14: Korrektur (∆Hx=∆Hges-n∆Hion ) der gemessenen Wärmetönungen ∆Hges um die Ionisierungs-enthalpien ∆H_ion, die vom verwendeten Puffer herrühren. Die Werte sind die linearen Regressionsanalyse in Abbildung 3.8 entnommen. Positive n-Werte deuten auf eine Protonenaufnahme des Systems hin.