Kalibrierung. Das Kalorimeter wurde halbjährlich kalibriert. Die Kalibrierung erfolgte mittels sieben elektrischer Standardpulse. Die beiden Zellen waren dabei mit Wasser gefüllt.
Nummer des Pulses
Wärmepuls
(µcal/sec) Dauer (sec) Zeit zwischen den Pulsen (sec)
1 25 60 300
2 -25 60 300
3 15 60 300
4 -15 60 300
5 10 60 300
6 -10 60 300
7 25 300 600
Tabelle 6.3:Übersicht für die Wärmepulse zur Kalibrierung des MCS-ITC Kalorimeters.
Aus den Verhältnissen von gemessener Wärmemenge zu theoretisch erwarteter Wärmemenge für alle sieben Impulse wurde ein Mittelwert gebildet, der zur Anpassung der Kalibrierungskonstanten diente. Dabei wurde die neue Kalibrierungskonstante durch Multiplikation der alten Konstante mit diesem durchschnittlichen Verhältnis von erwarteter Wärmemenge zu gemessener Wärmemenge erhalten.
7
⋅
∑
= gemesseneWärmemenge
ärmemenge erwarteteW
nte AlteKonsta nte
NeueKonsta (Gleichung 6.2)
Allgemeine Meßvorschrift. Soweit nichts anderes beschrieben ist, wurden die Messungen bei 25°C durchgeführt. Dazu wurde der Thermostat des Kalorimeters auf 25°C eingestellt.
Für die Messungen mit Thrombin als Protein wurden 0.2 bis 0.4 mg Thrombin eingewogen, die in 2 ml eines oben beschriebenen Standardpuffers gelöst wurden. Man entgaste die Lösung im Wasserstrahlvakuum unter Rühren und füllte diese dann blasenfrei mit einer Hamiltionspritze langsam in die Meßzelle, die vorher mit dem gleichen Puffer zweimal vorgespült worden war. Die Thrombinkonzentration betrug 1.9 bis 3.8µmol/l.
Für die Trypsinmessungen wurden 1.0 bis 1.2 mg eingewogen, die in 2 ml eines Standard-puffers gelöst wurden. Die Trypsinkonzentration betrug daher 18.8 bis 22.6 µmol/l. Die weitere Probenaufbereitung entspricht der für Thrombin beschriebenen Aufbereitung.
Der zu messende Ligand wurde in demselben Standardpuffer wie das Protein gelöst und im Ultraschallbad bzw. im Wasserstrahlvakuum unter Rühren entgast.
Man zog die Spezialspritze für die kalorimetrische Messung blasenfrei mit der Liganden-lösung auf. Bei Benutzung der 250 µl Spritze war die Konzentration des Liganden in Lösung ca. 22-fach höher als die Konzentration des Proteins in der Meßzelle, bei Benutzung der 100µl Spritze ca. 9-fach höher, damit die Gesamtkonzentration des Liganden (gebunden und ungebunden) in der Meßzelle am Ende der Messung zweimal größer als die Gesamt-konzentration an Protein (frei und komplexiert) war und so das Protein nach den letzten Injek-tionen vollständig gesättigt war. Die einzelnen Injektionsvolumina betrugen für die 100 µl Spritze 8 bis 10µl und für die 250µl Spritze 15 bis 20µl in Abhängigkeit von der Größe der gemessenen Wärmetönung. Als Injektionszeiten wurden jeweils die von der MicroCal OBSERVER Software vorgegebenen Werte übernommen. Die Meßzeit zwischen zwei Injek-tionen betrug 240 Sekunden und die Rührgeschwindigkeit 300 Umdrehungen pro Minute.
Zur Auswertung der Meßergebnisse wurde die mitgelieferte Software MicroCal ORIGIN Version 2.9 mit Auswertungsskripten für die Meßdateien verwendet. Die Anpassung der Bindungsisothermen an die Meßpunkte erfolgte nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate („least squares fit“). Dabei wurde jede Messung dreimal durchgeführt. Für die
endgültige Bestimmung der thermodynamischen Parameter des Protein-Inhibitor-Komplexes nahm man den Durchschnitt der drei Messungen. Die Abweichung zwischen den Messungen betrug maximal 10 Prozent.
Die Wärmemenge, die durch die Verdünnung des Inhibitors entstand, lag wegen der geringen Inhibitorkonzentration unterhalb des Detektionslimit. Daher brauchte keine spezielle Korrektur bezüglich der Verdünnungswärmen zu erfolgen.
Die Verdünnungswärme für den Inhibitor wurde durch Injektion der Inhibitorlösung in die Meßzelle, in der die Pufferlösung (ohne Protein) vorlag, ermittelt. Als weitere Kontrolle dienten bei jeder Messung die Wärmemengen der letzten Injektionen, die nach vollständiger Sättigung des Proteins erfolgten.
Die Verdünnungswärme für das Protein in der Meßzelle wurde durch Injektion von Pufferlösung in die Meßzelle, in der das Protein in derselben Pufferlösung gelöst vorlag, ermittelt. Auch die Verdünnungswärme für das Protein war unterhalb der Sensitivität des Gerätes.
Messung von Wärmekapazitätsänderungen. Zur Bestimmung der Wärmekapazitäts-änderung ∆Cp durch die Komplexbildung wurden die Enthalpiewerte wie oben beschrieben bei verschiedenen Meßtemperaturen gemessen: für Thrombinmessungen bei 20, 25, 30 und 35°C, für Trypsinmessungen bei 15, 20, 25 und 30°C. Für die Messung bei 15 °C wurde das Kalorimeter mit Hilfe des Wasserbads auf 10 °C gekühlt und der Thermostat des Gerätes auf 15 °C eingestellt. Die Lösungen und Spritzen kühlte man für einige Minuten kurz vor der Messung im Kühlschrank bei etwa 5°C vor.
Der∆Cp-Wert wurde durch Auftragung der gemessenen Enthalpie gegen die Temperatur und anschließender linearer Regression bestimmt.
Messungen des Protonenaustausches. Um die Anzahl der Protonen zu messen, die während der Komplexbildung aufgenommen oder abgegeben wurden, führte man die Messungen in vier verschiedenen Standardpuffern (HEPES-, Pyrophosphat-, TRICINE- und TRIS-Puffer, siehe oben) bei konstantem pH-Wert durch.
Durch Auftragung der gemessenen Gesamtenthalpien gegen die Ionisierungsenthalpien der Puffersubstanzen und anschließender linearer Regression wurde aus der Steigung der resultierenden Gerade die Anzahl n der Protonen, die aufgenommen bzw. abgegeben wurden, und aus dem Achsenabschnitt der Ordinate die korrigierte Enthalpie ∆Hx bestimmt (siehe auch Kapitel 2.3.5).
Die genauen Ionisierungsenthalpien der unterschiedlichen Puffersubstanzen wurden der Literatur entnommen.
Puffersubstanz
Ionisierungsenthalpie
∆Hion(kJ/mol) Literaturquelle
Pyrophosphat 5.12 Fukada & Takahashi, 1998
HEPES 21.07 Fukada & Takahashi, 1998
TRICINE 31.97 Fukada & Takahashi, 1998
TRIS 48.07 Christensenet al., 1976
Tabelle 6.4: Übersicht über die verwendeten Ionisierungsenthalpien (Protonenabgabe der Puffersubstanz) mit Angabe der Literaturquelle.
Bestimmung von Ionisierungsenthalpien. Eine 50 mM Lösung der Modellverbindung wurde auf den pH-Wert eingestellt, der dem pKa-Wert der Verbindung entsprach (Kapitel 6.9). Man entgaste die Lösung und legte diese in der Meßzelle des ITC-Gerätes vor.
Anschließend wurden mit der 100 µl Spritze 10 Aliquote je 10 µl Volumen einer 1 mM Salzsäure injiziert. Aus den gemessenen Enthalpien je Injektion bildete man den Mittelwert.
Zur Bestimmung der Verdünnungsenthalpie injizierte man die 1 mM Salzsäure nach dem gleichen Protokoll in eine mit Wasser gefüllte Zelle. Die gemessene Ionisierungenthalpie wurde danach um den Betrag der Verdünnungsenthalpie korrigiert.
Für die Korrektur der gemessenen Enthalpien um dem Wärmebeitrag, der durch die Protonierung bzw. Deprotonierung der Gruppe des Liganden entstand, wurden die Ionisierungsenthalpien von folgenden Modellverbindungen bestimmt:
NH O C OH
H3 O
N O C H3
OH O
N NH O
C H3
N-Acetylglycin N-Acetylpipecolinsäure N-Acetylpiperazin
Abbildung 6.4:Modellsubstanzen für die Messung der Ionisierungsenthalpien der Inbibitoren1b,1dund2. Die Substanz N-Acetylpipecolinsäure wurde nach einer Vorschrift von Zalucky et al. (1995) aus Pipecolin-säureethylester synthetisiert.
N-Acetylglycin diente als Modellsubstanz für die Säuregruppe von 2 (Napsagatran), N-Acetylpipecolinsäure als Modell für die Carboxylatgruppe von 1b und N-Acetylpiperazin als Modellverbindung für die sekundäre Aminogruppe von1d.
Modellverbindung pKa-Wert Ionisierungsenthalpie∆Hi(kJ/mol)
N-Acetylglycin 3.31±0.04 0.84±0.34
N-Acetylpipecolinsäure 3.45±0.01 2.26±0.56
N-Acetylpiperazin 8.10±0.01 35.16±0.98
Tabelle 6.5:Drei Modellverbindungen für die Bestimmung von Ionisierungsenthalpien in einer Übersicht. Die pKa-Werte wurden entsprechend der Vorschrift aus Kapitel 6.9 gemessen.
Sonstige Messungen. Messungen in anderen als den oben beschriebenen Standardpuffern wurden entsprechend der allgemeinen Meßvorschrift durchgeführt. Die Pufferzusammen-setzungen werden explizit in den betreffenden Kapiteln dieser Arbeit beschrieben.