Kopplung von GDP-Fuc-Synthese und Fucosyltransfer im SatzreaktorSatzreaktor

In diesem Abschnitt werden die Ergebnisse der Satzreaktorversuche vorgestellt, die eine Fu-cosylierung der beiden Akzeptoren LNFP III und LNT, ausgehend von der GDP-Man und NADPH, erm¨oglichen. Als Cofaktor wurde stets NADPH eingesetzt. Der reduzierte Cofak-tor hat dabei zwei Funktionen: zum einen aktiviert er die GMD, zum anderen liefert er die notwendigen Reduktions¨aquivalente f¨ur die GFS zur Generierung von GDP-Fuc ausgehend von GKDM. Die Akzeptoren sowie NADPH wurden in zweifachem ¨Uberschuß zur Reaktion gegeben. Alle durchgef¨uhrtenbatch-Versuche wurden im analytischen Maßstab durchgef¨uhrt, der Verlauf der Reaktionen wurde mit HPLC verfolgt.

Abbildung 7.4 zeigt die Eintopfsynthese eines fucosylierten Oligosaccharids mit der parti-ell aufgereinigten α1,2-FucT. LNFP III ist der Akzeptor. Das fucosylierte Produkt (Lewis^Y Lactose) wird in einer Konzentration von etwa 1 mM gebildet.¹ Dies entspricht einer quanti-tativen Ausbeute bezogen auf GDP-Man. Demnach wurde die im System gebildete GDP-Fuc vollst¨andig zur Fucosylierung des Akzeptors genutzt.

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0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

GDP-Man GKDM GDP-Fuc Lewis^YLactose

Zeit [h]

Konzentration[mM]

Abbildung 7.4: Synthese von Lewis^Y-Lactose, ausgehend vonLewis^X-Lactose (LNFP III), mit aufgereinigterα1,2-FucT.

Bedingungen: 1 mM GDP-Man, 2 mM NADPH, 2 mM LNFP III, 100 mU GMD, 68 mU GFS, 17 mU FucT; 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 5 mM MnCl2, 1 mM DTT, pH 8, T = 30°C, V = 1 mL, Enzymaktivit¨aten nach Standard-Assays (s. Kapitel 10). Start der Reaktion mit GDP-Man.

Die Konzentrationen der Nucleotidzucker zeigen den f¨ur Folgereaktionen typischen Verlauf.

GDP-Man ist nach 1 Stunde quantitativ verbraucht, GKDM ist kaum zu detektieren, da es

1Die angegebene Produktkonzentration ¨uber 1 mM liegt in einem Fehler der HPLC-Analytik begr¨undet.

sofort weiter zu GDP-Fuc umgesetzt wird. Die GDP-Fuc-Konzentration zeigt ihr Maximum nach etwa 1 Stunde. Die stetige Produktbildung durch die FucT-Reaktion l¨asst die GDP-Fuc-Konzentration wieder absinken.

In einem zweiten batch-Versuch (Abbildung 7.5) sollte untersucht werden, ob auch FucT-rekombinante E. coli-Zellen den Akzeptor LNFP III in gleicher Weise fucosylieren k¨onnen.

Die Reaktionsbedingungen ebenso wie die eingesetzten Enzymaktivit¨aten entsprechen denen des ersten Experiments.

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0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

GDP-Man GKDM GDP-Fuc Lewis^YLactose

Zeit [h]

Konzentration[mM]

Abbildung 7.5: Synthese von Lewis^Y-Lactose, ausgehend von Lewis^X-Lactose (LNFP III), mitα1,2-FucT-rek.E. coli-Zellen.

Bedingungen: 1 mM GDP-Man, 2 mM NADPH, 2 mM LNFP III, 100 mU GMD, 68 mU GFS, 15 mU FucT; 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 5 mM MnCl2, 1 mM DTT, pH 8, T = 30°C, V = 1 mL, Enzymaktivit¨aten nach Standard-Assays (s. Kapitel 10). Start der Reaktion mit GDP-Man.

Der Verlauf der Reaktion zeigt, dass mit den Zellen eine nur wesentlich geringere Produkt-konzentration von 0,2 mMLewis^Y-Lactose erzielt werden kann. GDP-Man wird zwar zu 80%

umgesetzt, eine Bilanzierung von Substrat und Produkten ist aber nicht m¨oglich. GDP-Man wird nicht quantitativ zu GDP-Fuc umgesetzt, zudem kann gebildete GDP-Fuc offensichtlich nicht zur weiteren Fucosylierung des Akzeptors genutzt werden. Als Ursache f¨ur die L¨ucke in der Massenbilanz erscheint die hohe, eingesetzteE. coli-Zellkonzentration von etwa 40 mg/mL plausibel, da die Adsorption bzw. Aufnahme von GDP-Man durch die permeabilisierten Zel-len m¨oglich sein sollte. Im Unterschied zum ersten Experiment konnte beobachtet werden, dass eingesetztes NADPH bereits zu Beginn der Reaktion gr¨oßtenteils zu NADP oxidiert war (etwa 1 mM, nicht dargestellt). Dies k¨onnte auf eine noch hohe Stoffwechselaktivit¨at der Zellen zur¨uckgef¨uhrt werden. Als Folge stehen die Reduktions¨aquivalente nicht mehr f¨ur die GDP-Fuc-Synthese zur Verf¨ugung.

In einer dritten Eintopfsynthese sollte das Konzept der in situ Fucosylierung mit einem

anderen Akzeptor ¨uberpr¨uft werden. Abbildung 7.6 zeigt den Reaktionsverlauf mit LNT als Substrat f¨ur die partiell aufgereinigte FucT. Das fucosylierte Produkt (Lacto-N-Fucopentao-se I, LNFP I) wird bis zu einer Konzentration von 0,7 mM gebildet. Bezogen auf die einge-setzte GDP-Man entspricht dies einer Ausbeute von 70%. Da aber die eingeeinge-setzte GDP-Man sowie gebildete GDP-Fuc vollst¨andig umgesetzt werden, besteht auch hier eine L¨ucke in der Massenbilanz. Mit LNFP III als Akzeptor (vgl. Abbildung 7.4) wurden unter identischen Bedingungen nahezu 100% Ausbeute erzielt. Ein hoher Fehler der HPLC-Analytik f¨ur die Oligosaccharide k¨onnte eine Erkl¨arung f¨ur diese Diskrepanz sein.

0 1 2 3 4 5 6

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

GDP-Man GKDM GDP-Fuc LNFP I

Zeit [h]

Konzentration[mM]

Abbildung 7.6:Synthese von LNFP I ausgehend von LNT mit aufgereinigterα1,2-FucT.

Bedingungen: 1 mM GDP-Man, 2 mM NADPH, 2 mM LNT, 100 mU GMD, 68 mU GFS, 15 mU FucT; 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 5 mM MnCl2, 1 mM DTT, pH 8, T = 30°C, V = 1 mL, Enzymaktivit¨aten nach Standard-Assays (s. Kapitel 10). Start der Reaktion mit GDP-Man.

Wie auch im Falle des LNFP III, resultierte aus dem Einsatz der FucT-rek. Zellen - ver-glichen mit dem Einsatz des aufgereinigten Enzyms (nicht gezeigt) - eine deutlich geringere Effizienz der Eintopf-Fucosylierung von LNT.

Zur Kontrolle der durchgef¨uhrtenbatch-Experimenten wurden alle Versuche auch in Abwe-senheit des jeweiligen Akzeptors durchgef¨uhrt. Auf diese Weise sollten eventuell auftretende Nebenaktivit¨aten der FucT-Pr¨aparation erkannt werden. Ohne Akzeptor in der Reaktionsl¨o-sung sollte die Synthese von GDP-Fuc, aufgrund der wieder auftretenden feedback-Inhibie-rung der GMD, nicht m¨oglich sein. ¨Uberraschenderweise zeigte sich aber, dass unter den o.g.

Reaktionsbedingungen GDP-Man nach 2 h zu 90% zu GDP-Fuc umgesetzt werden konnte.

Abbildung 7.7 auf der n¨achsten Seite zeigt den Verlauf einer solchen Reaktion in Abwesenheit eines Akzeptors.

0 1 2 3 4 5 6 0,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

GDP-Man GKDM GDP-Fuc NADP

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Zeit [h]

Konzentration[mM] Ausbeute[–]

Abbildung 7.7:Gekoppeltes System in Abwesenheit eines Akzeptors f¨ur dieα1,2-FucT.

Bedingungen entsprechend Abbildung 7.4 bzw. 7.6 jedochohneAkzeptor. Enzymaktivit¨aten nach Stan-dard-Assays (s. Kapitel 10). Start der Reaktion mit GDP-Man.

Eine Erkl¨arung f¨ur diese Beobachtung kann bisher nicht gegeben werden. Vergleicht man die Bedingungen der Experimente mit jenen zuvor durchgef¨uhrter, so wurden zwei Parameter ge¨andert:

• Da die volumenspezifische Aktivit¨at der FucT-Pr¨aparation (50% Glycerin) sehr gering war, mussten große Mengen der Enzyml¨osung eingesetzt werden. Der Glyceringehalt in den Eintopfreaktionen lag daher bei bis zu 25% (v/v).

• Fucosyltransferasen ben¨otigen Mn²⁺-Ionen f¨ur die Katalyse. Dieser Cofaktor wurde bis-her nicht f¨ur die GDP-Fuc-Synthese eingesetzt.

Um einen m¨oglichen Einfluß dieser Komponenten auf die Reaktionsfolge GDP-Man → GKDM→GDP-Fuc zu erkennen, wurden verschiedene Versuche zur Eintopfsynthese mit der GMD und GFS durchgef¨uhrt (Daten nicht gezeigt). Dabei konnte reproduziert werden, dass, in Anwesenheit hoher Mengen an Glycerin sowie in Anwesenheit von Mn²⁺-Ionen, GDP-Fuc ausgehend von GDP-Man sehr viel schneller gebildet wird als in Abwesenheit dieser beiden Komponenten. 1 mM GDP-Man wurde jeweils nach 2 h quantitativ zu GDP-Fuc umgesetzt.