Tris-HCl, pH 8 MOPS, pH 7
3. FucT
10.1 Analytik
aufge-tragen. Die resultierenden Kalibriergeraden wurden zur Berechnung der Analytkonzentratio-nen eingesetzt. Abbildung 10.1 zeigt exemplarisch eine Kalibriergerade zur Bestimmung der GDP-Man Konzentration.
0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4
5 Lineare Regression:
c (GDP-Man) = 1,0996 * (GDP-Man:IS) R = 0,999
Fl¨achenverh¨altnis (GDP-Man:IS) [–]
c(GDP-Man)[mM]
Abbildung 10.1: CE-Kalibriergerade f¨ur GDP-Man.
CE-Methodenentwicklung Alle CE-Experimente wurden mit den entsprechenden Metho-den, die der genetische Algorithmus vorgegeben hatte, doppelt durchgef¨uhrt. Die Standard-L¨osung der ersten Optimierung enthielt die sieben Analyte (GMP, GDP, GTP, NADP, NADPH, GDP-Man und GDP-Fuc) in einer Konzentration von jeweils 0,5 mM. Bei der zwei-ten Optimierung lagen jeweils GDP-Man, GDP-Fuc und Uridin (Interner Standard) in einer Konzentration von 0,5 mM vor.
Entsprechend den vorgegebenen Werten f¨ur Puffer- und DIME-β-CD-Konzentration der einzelnen Individuen durch den GA wurden pro Individuum 1600 µL des jeweiligen Trenn-puffers angesetzt. Dabei wurde von folgenden Stamml¨osungen ausgegangen:
DIME-β-CD = 200 mM
KPi-Puffer = 400 mM
Borat-Puffer = 400 mM
Die zu pipettierenden Volumina ergeben sich daraus zu:
Vol.T rennpuf f er = 1600 µL (10.1)
Vol.β−CD [µL] = 1600
(200mM/cges) (10.2)
Vol.Kpi [µL] = 1600
(400mM/cges) ·%P
100 (10.3)
Vol.Borat [µL] = 1600
(400mM/cges) ·100−%P
100 (10.4)
Vol.W asser [µL] = 1600−Vol.β−CD−Vol.Kpi−Vol.Borat (10.5)
cges entspricht dem VariationsparameterPufferkonzentration (Kpi + Borat) des GA und %P dem Anteil an Phosphat im Puffer. Nach Pipettieren der einzelnen L¨osungen wurde der pH-Wert der jeweiligen Trennpuffer mit 4 N KOH bzw. 2 N HCl auf den vorgegebenen pH-Wert eingestellt.
10.1.2 HPLC-Systeme System 1
Diese Methode der Ionenpaarchromatographie an einerreversed phase-S¨aule zur Analyse der (Zucker)Nucleotide beruht auf der Publikation von Payne et al. aus dem Jahre 1982 [232].
Von der Gruppe Pipersberg ist diese Methode bereits f¨ur das GDP-Fuc System eingesetzt worden [168].
Ger¨at: LC Series 1100
Hersteller: Hewlett-Packard
Detektion: UV, Photo Dioden Array
Wellenl¨ange: 254 nm (Nucleotidzucker der G-Reihe) 262 nm (Interner Standard, Uridin) Referenzwellenl¨ange: 360 nm
Software: HP ChemStation, Version 5
Station¨are Phase: Multospher 100 RP-18; 5µm Partikelgr¨oße Dimension: 250 x 4 mm
(CS-Chromatographie, Langerwehe), Inertsil ODS-2 (Octadecyl)
Dimension: 250 x 4.6 mm (GL Sciences, Tokyo, Japan)
Vors¨aule: Multosper 100 RP-18; 5µm Partikelgr¨oße (CS-Chromatographie, Langerwehe) S¨aulentemperatur: 40°C
Eluent A: 30 mM KPi-Puffer
5 mM Tetrabutylammonium (TBA)-hydrogensulfat
2% Acetonitril pH 6
Eluent B: Acetonitril
5 mM Tetrabutylammonium (TBA)-hydrogensulfat
Gradient: 0 min: 100% A
30 min: 30% B 35 min: 100% A 40 min: 100% A
Fluß: 1 mL/min
Wie bei der CE diente hier Uridin als interner Standard (1 mM). Zur Kalibrierung wurde das Verh¨altnis Analyt/IS gegen die Konzentration des jeweiligen Analyten aufgetragen. Die daraus resultierenden Kalibriergeraden wurden zur Berechnung der Analytkonzentrationen eingesetzt. Das Injektionsvolumen betrug 10-20 µL.
S¨amtliche Laufmittel wurden vor ihrer Benutzung filtriert (0,22 µm) und entgast. Wurde die HPLC ¨uber l¨angere Zeit nicht genutzt, so war ein Sp¨ulen der S¨aule mit 70% Acetonitril in Wasser notwendig, um mikrobiellen Bewuchs zu vermeiden.
System 2
Eine pr¨aparative HPLC wurde f¨ur Aufreinigungsversuche von GDP-Fuc im semi-pr¨aparativen Maßstab eingesetzt. Das Trennprinzip und die Methode ist mit jener der analytischen HPLC (System 1) identisch.
Ger¨at: 125solvent module
Hersteller: Beckman Coulter, M¨unchen
Detektion: 2-Kanal UV-Meter
Wellenl¨ange: 254 nm
Software: BeckmanGold
Station¨are Phase: Multospher 100 RP-18; 5µm Partikelgr¨oße Dimension: 250 x 20 mm
(CS-Chromatographie, Langerwehe), S¨aulentemperatur: 40°C
Eluent A: 30 mM KPi-Puffer
5 mM Tetrabutylammonium (TBA)-hydrogensulfat 2% Acetonitril
pH 6
Eluent B: Acetonitril
5 mM Tetrabutylammonium (TBA)-hydrogensulfat
Gradient: 0 min: 100% A
40 min: 40% B 45 min: 100% A 50 min: 100% A
Probenaufgabe: manuelles Ventil (Rheodyne, Cotati, USA) Hamilton-Spritze
Fraktionssammler: Frac 100 (Pharmacia, Freiburg)
Fluß: 5 mL/min
Abbildung 10.2 zeigt exemplarisch ein Chromatogramm einer semi-pr¨aparativen Auftren-nung von GDP-Fuc, NADP und NADPH. Die GDP-Fuc haltigen Fraktionen wurden vereinigt und anschließend lyophilisiert.
0 10 20 30 40 50
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Zeit [min]
Absorption(250nm)[AU] EluentB[%]
GDP-Fuc
NADP
NADPH
Abbildung 10.2: Beispielchromatogramm der pr¨aparativen HPLC zur GDP-Fuc-Aufreini-gung.
System 3
Diese HPLC-Methode wurde zur Analyse von Oligosacchariden w¨ahrend des Japanaufent-haltes bei Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. eingesetzt. Die Methode ist auch Grundlage des Fucosyltransferase-Assays im Hinblick auf die Produktbildung (fucosylierte Oligosaccharide).
Ger¨at: Dionex 500 System
Hersteller: Dionex
Detektion: Elektrochemische Detektion
PAD (pulsed amperometric detection) ED40 Detektor
Pumpe: Dionex GP40
Software: DionexPeakNet™ Version 5
Station¨are Phase: CarboPac PA10 analytical column Dimension: 250 x 4 mm
(Dionex, Sunnyvale, USA)
Vors¨aule: CarboPac PA10 guard column
Dimension: 50 x 4 mm
(Dionex, Sunnyvale, USA) S¨aulentemperatur: 30°C
Eluent A: Wasser (demineralisiert)
Eluent B: 0,5 M NaOH
Gradient: 0 min: 8% B
20 min: 20% B 28 min: 100% B 35 min: 8% B
Fluß: 0,8 mL/min
Die Laufmittel wurden vor ihrer Benutzung filtriert (0,22 µm) und entgast. Das Injek-tionsvolumen betrug 50 µL. Zur Kalibrierung wurde die Peakfl¨ache der einzelnen Analyte gegen die jeweilige Konzentration aufgetragen. Die resultierenden Kalibriergeraden wurden zur Berechnung der Analytkonzentrationen eingesetzt.
Abbildung 10.3 zeigt ein Beispiel-Chromatogramm zur Quantifizerung von 2’-Fucosyllactose, die, ausgehend von Lactose und GDP-Fuc, durch die Fucosyltransferase-Reaktion gebildet wird.
Abbildung 10.3: HPLC-Chromatogramm zur Quantifizierung fucosylierter Oligosacchaari-de.
10.1.3 Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS) Direktinjektion
Die ESI-MS-Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Arne Buchholz und Herrn Dr. Marco Oldiges am Institut f¨ur Biotechnologie durchgef¨uhrt (Fermentationsgruppe). Die zu analysierenden, w¨assrigen Proben (20% Methanol, v/v) wurden per Direktinjektion der ESI-Quelle zugef¨uhrt. Weitere Analyse-Bedingungen waren:
Ger¨at: Mono-Q™
Hersteller: Thermo Finnigan
Ionenquelle: Elektrospray Ionisierung
Detektion: Ionenfalle
Modus: negativ
cone voltage: 40 V
Fluß der Direktinjektion: 10 µL/min
Software: Chromeleon™Dionex, Version 1.6
Die Technik wurde zu Beginn der Arbeiten mit der GDP-α-d-Mannose-4,6-Dehydratase ein-gesetzt. Ziel war es, die Identit¨at des Produktes der Reaktion (GKDM) eindeutig zu belegen.
Das entsprechende Massenspektrum zeigt die Abbildung 10.4 auf Seite 186.
LC-ESI-MS
Weitere Untersuchungen zur Massenspektrometrie wurden auf einer LC-MS-Anlage des IBT 1 durchgef¨uhrt (Ionenchromatographie-Massenspektrometrie, IC-MS). Es kam eine analytische Anionentauschers¨aule zum Einsatz.
Ger¨at: Dionex System
Hersteller: Dionex
Ionenquelle: TurboIonSource
Detektion: Quadrupol MS
Station¨are Phase: Dionex IonPAC AS II Dimension: 250 x 2 mm (Dionex, Sunnyvale, USA)
Vors¨aule: AG II
S¨aulentemperatur: RT
Gradient: 0 min: 1 mM KOH
3,5-7,5 min: auf 20 mM KOH 7,5-10,5 min: 20 mM KOH 10,5-17,5 min: auf 100 mM KOH 17,5-23,5 min: 100 mM KOH
Fluß: 0,25 mL/min
10.1.4 NMR-Spektroskopie
Die im Rahmen dieser Arbeiten synthetisierten Nucleotidzucker (GKDM und GDP-Fuc) wur-den durch1H- und13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und charakterisiert. Auf die Charak-terisierung von GKDM wurde bereits in Kapitel 5.3.1 eingegangen. Die entsprechenden NMR-Spektren finden sich in Kapitel 10.6.
Die Aufnahmen erfolgten mit einem Bruker AM-300 MHz NMR-Spektrometer des IBT 2 bzw. mit einem Bruker Avance 500 DRX Spektrometer der Universit¨at Hannover. Die che-mischen Verschiebungen der Protonen beziehen sich auf Tetramethylsilan (TMS), die der C-Atome des GKDM auf das C-1’ der Verbindung. Es bedeuten: s Singulett, d Dublett, dd Dublett von Dubletts,t Triplett,q Quartett und mMultiplett. Die Angabe der Kopplungs-konstanten erfolgt in Hz.