Gewinnung der GDP-β - L -Fucose-Synthetase (GFS)

Die nach dem beschriebenen Aufreinigungsprotokoll erhaltene Proteinpr¨aparation zeigte nur durchexogene Zugabe von NADP zur Reaktionsl¨osung GMD-Aktivit¨at. Das Enzym ver-liert offensichtlich im Laufe der Aufreinigung den Cofaktor und liegt als Apoenzym vor. Ein

¨ahnliches Verhalten wurde bereits f¨ur das Enzym ausKlebsiella pneumoniaebeschrieben [193], jedoch steht der Verlust des Cofaktors im Widerspruch zu den Ergebnissen f¨ur die GMD aus Schwein [136], Mensch [247] undE. coli [195,248]. Dort wird die Bindung des Cofaktors an das Enzym als sehr fest (”tightly bound”) beschrieben. Die Aufreinigung des rekombinanten, na-tiven Enzyms aus E. coli mittels Anionenaustausch-Chromatographie ist bisher jedoch nicht publiziert und der Verbleib des stark negativ geladenen NADP am Anionentauscher erscheint durchaus plausibel. Die Wiedergewinnung der Enzymaktivit¨at durch Zugabe von NADP zur Reaktion veranschaulicht Abbildung 4.4: GDP-Man wird erst nach Zugabe des Cofaktors zum Produkt umgesetzt.

0 10 20 30 40 50 60

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

1,0 + 0.1 mM NADP

Zeit [min.]

Umsatz[%]

Abbildung 4.4:Wiederherstellung der GMD-Aktivit¨at durch exogene NADP-Zugabe.

Bedingungen: 1 mM GDP-Man, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 8, T = 30°C, 1 mg/mL BSA, 0,26 mg/mL Protein (GMD-Pr¨aparation).

zu GDP-Fuc katalysieren, obwohl entsprechende Aktivit¨aten auch in Pflanzen [249] und W¨ ur-mern [250] gefunden und best¨atigt werden konnten. Kurioserweise wurde die humane GFS unter dem Namen ”FX Protein” sogar bereits 1977 bis zur Homogenit¨at aufgereinigt [251,252], die biologische Funktion war aber damals v¨ollig unbekannt.¹

Erst 1988 wurde die GFS erstmalig aus Schilddr¨usengewebe aus Schwein als homogenes Protein aufgereinigt² und die biologische Bedeutung erkannt [137]. Damit wurde auch erst-mals die Bifunktionalit¨at der GFS bewiesen, da das Enzym sowohl die 3,5-Epimerisierung als auch die anschließende 4-Reduktion katalysiert (vgl. Abbildung 1.9 auf Seite 15). Diese Entdeckung war ungew¨ohnlich, da die Aktivit¨aten f¨ur Epimerisierung und Reduktion bei der enzymatischen Synthese anderer Nucleotidzucker auf zwei verschiedenen Proteinen zu finden sind [253], wie etwa im Falle der dTDP-l-Rhamnose [254] oder der CDP-6-Deoxygulose. Mitte der 1990er Jahre wurde dann das ”FX Protein” durch Klonierung der entsprechenden cDNA als GFS erkannt [138].

Seit der erfolgreichen Klonierung und ¨Uberexpression des Gens der GFS ausE. coli K-12 im Jahre 1998 [32], steht das Enzym auch rekombinant zur Verf¨ugung. F¨ur die GFS kodierende Gene wurden in den folgenden Jahren in einer Vielzahl von Organismen gefunden, so z.B. in Pflanzen [255], im Menschen [138, 166] und in verschiedenen Bakterien [33, 139, 256, 257]. Das Enzym ausE. coli konnte zudem bereits mehrfach kristallisiert werden [194, 258–260].

Wie im Falle der GMD, wurde in der vorliegenden Arbeit das Enzym ausE. coli K-12 ein-gesetzt, welches in einem IPTG-induzierbarenE. coli BL21(DE3)-Expressionsstamm homolog uberexprimiert wurde. Im Gegensatz zur GMD besitzt dieses Enzym einen N-terminalen His-¨ tag, der eine Aufreinigung des Enzyms an einer Ni-NTA-Matrix erlaubt (siehe Kapitel 4.2.2).

Die Klonierung des Gens und die Konstruktion des Expressionsvektors³ wurden von Herrn Dr. Stefan Weidner am Institut f¨ur Enzymtechnologie der Universit¨at D¨usseldorf im Rahmen seiner Promotion durchgef¨uhrt. Die Aufreinigung des Enzyms wurde gemeinsam etabliert.

Die Gruppe um Prof. Piepersberg in Wuppertal hatte die Klonierung und Aufreinigung des gleichen Enzyms bereits im Jahre 2000 publiziert [140].

4.2.1 Fermentation von Escherichia coli BL21(DE3) pET16b/wcaG

Den Verlauf der Fermentation im 15 L-Maßstab dokumentiert die Abbildung 4.5 auf der n¨achsten Seite. Die Durchf¨uhrung entspricht der Fermentation zur Gewinnung der GMD.

Die Graphik der Abbildung 4.5 zeigt deutlich den durch das Wachstum der Zellen bedingten sinkenden Sauerstoffpartialdruck. Nach etwa 4 Stunden wurde die Protein-Expression durch Zugabe von 0,4 mM IPTG induziert und die Zellen nach weiteren 4 Stunden (maximale OD) mit einem Zellseparator abgeerntet und zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.

Insgesamt konnten 230 g Zellen (Biofeuchtmasse) gewonnen werden; dies entspricht einer volumenspezifischen Ausbeute von 15,3 g Zellen/L Kulturbr¨uhe. Die Zellen exprimierten eine Gesamtaktivit¨at von etwa 15 000 U.

1Das Protein war lediglich als ein NADP- und NADPH-bindendes Protein bekannt.

2Insgesamt konnten damals, bei einer massenspezifischen Aktivit¨at von 194 mU/mg, nur 22 mU des Enzyms isoliert werden. Dies entsprach einer Ausbeute von nur 3,7%, jedoch einem Aufreinigungsfaktor von etwa 1400.

Zur Gewinnung dieser Enzymmenge mussten 170 g Schilddr¨usengewebe eingesetzt werden.

3Plasmid: pET16b der Firma Novagen: T7-Promotor ist Initiationssignal der Transkription, E. coli BL21(DE3) exprimiert die T7-RNA-Polymerase, die das Signal erkennt. Der N-Terminus des Enzyms tr¨agt 10 Histidin-Reste.

6,90 6,95 7,00 7,05 7,10

0 2 4 6 8

0 2 4 6 8 10

0 20 40 60 80 100 Ernte 0,4 mM IPTG

Zeit [h]

OD600nm[–] pO2[%]

pH-Wert[–]

Abbildung 4.5:Fermentationsverlauf von E. coli BL21(DE3) pET16b/wcaG.

Bedingungen: 15 L LB-Medium, 0,1 g/L Ampicilin, T = 37°C, pH = 7 (KOH), Bel¨uftungsrate = 20 L/min, Drehzahl = 400 rpm.

4.2.2 Partielle Aufreinigung der GFS

Zur Aufreinigung des Enzyms werden die Zellen zun¨achst mit Ultraschall lysiert. Da das rekombinante Enzym einen N-terminalen His₁₀-tag besitzt, kann es mit der Immobilisierten-Metallionen-Affinit¨ats-Chromatographie (IMAC) aufgereinigt werden. Dieses Prinzip der En-zymaufreinigung beruht auf der Komplexierung zweiwertiger, an der Matrix immobilisierter Ni-Ionen durch die Histidin-Reste des rekombinanten Proteins. Nach Auftragen des Rohex-traktes wurde die S¨aule zun¨achst mit Laufpuffer gesp¨ult. Bei niedriger Imidazol-Konzentration (20 mM) wurden anschließend Proteine eluiert, die nicht-spezifisch an den Tr¨ager binden. Dies sind in der Regel nat¨urlich auftretende, stark histidinhaltige Proteine. Anschließend wurde die rekombinante GFS durch hohe Imidazol-Konzentrationen (200 mM) von der S¨aule gesp¨ult.

Wie schon bei der Aufreinigung der GMD bereitete der anschließende Schritt der Ultra-filtration Probleme. Das stark imidazolhaltige Eluat der S¨aule bewirkt offensichtlich eine irreversible Desaktivierung des Enzyms, da mitunter bereits die Fraktionen des chromatogra-phischen Schrittes einen Proteinniederschlag zeigten. Der alternative Einsatz der Gelfiltration zur schnellen Abtrennung des Imidazols ließ erkennen, dass ein sehr schnelles Ausfallen des Proteins zumindest verz¨ogert werden kann. Da das Enzym nach dem Schritt der Gelfiltration in sehr verd¨unntem Zustand vorliegt, musste es auch in diesem Fall ultrafiltriert werden. Die

M 1 2 3 4 kD

250 150 100 75

50

37

25

GFS

Abbildung 4.6: SDS-PAGE-Analyse der rek. His₁₀-tag GFS. ¨Uberproduktion in E. coli BL21(DE3) und Aufreinigung an Ni-NTA-Agarose.

M: Proteinmarker,Spur 1 und 2: Rohextrakt,Spur 3 und 4: Enzympr¨aparation in 50% Glycerin;

Spur 1 und 3: je 30µg Gesamtprotein; Spur 2 und 4: je 60µg Gesamtprotein.

aufkonzentrierte Enzyml¨osung wurde bis zu ihrer weiteren Verwendung mit 50% Glycerin ver-setzt und bei -20°C gelagert. Unter diesen Bedingungen ist das Enzym ¨uber einen Zeitraum von etwa 4-6 Monaten ohne signifikanten Aktivit¨atsverlust stabil.

Abbildung 4.6 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der partiellen Aufreinigung der GFS. F¨ur die His-tag GFS ergibt sich aufgrund der Analyse ein Molekulargewicht von etwa 36,0 kD; das berechnete Gewicht aus der Aminos¨auresequenz betr¨agt 36,1 kD. Bis auf eine schwache Bande bei etwa 37 kD zeigt das Gel lediglich das rekombinante Protein und belegt damit eindrucksvoll die Leistungsf¨ahigkeit des chromatographischen Aufreinigungsprotokolls.

Die o.g. Schwierigkeiten mit der Aufarbeitung nach der Chromatographie machten eine Bi-lanzierung des Aufreinigungsprozesses sehr schwierig. Zudem war die Messung der Enzymak-tivit¨at zu Beginn der Aufreinigungsversuche nur begrenzt m¨oglich, da das Substrat (GKDM) zum damaligen Zeitpunkt noch nicht in ausreichendem Maße verf¨ugbar war. Die angegebenen Aktivit¨aten wurden mit einer Substratl¨osung bestimmt, die durch eine GMDbatch-Reaktion erhalten wurde.

Die in Tabelle 4.2 auf der n¨achsten Seite dargestellten Zahlen dokumentieren die auftre-tenden Schwierigkeiten aufgrund der gemessenen Proteinkonzentrationen. Es zeigt sich ein starker Verlust an Protein w¨ahrend der Ultrafiltration. Dargestellt sind u.a. die Mengen des am Tr¨ager gebundenen Proteins sowie die Gesamtproteinmenge der gewonnen Enzympr¨apa-rationen (50% Glycerin). Wird von einer quantitativen Elution des Enzyms von der S¨aule ausgegangen, so k¨onnen die Verluste vor allem dem Schritt der Ultrafiltration zugeordnet werden. Dies stimmt mit der beobachteten Ausbildung eines starken Proteinniederschlages w¨ahrend dieses Arbeitsschrittes ¨uberein. Verluste bei der Ultrafiltration (UF) um ca. 80% an Protein wurden beobachtet, die Gelfiltration (GF) zeigt sich mit einem Verlust von immerhin 58% etwas leistungsf¨ahiger. Die SDS-PAGE-Analyse belegt, dass es sich bei dem verlorenen Protein ausschliesslich um die GFS handelt.

Aufreinigung^a Protein Protein Verlust Aktivit¨at_M Aktivit¨at Aktivit¨at

S¨aule Pr¨aparation UF/GF gesamt theoretisch^b

[mg] [mg] [%] [U/mg] [U] [U]

1 135 25 UF: 81 1,64 41 177

2 110 14 UF: 87 1,67 23 147

3 155 34 UF: 78 1,15 39 143

4 136 58 GF: 58 0,75 44 82

Summe: 147 549

a Es wurde eine S¨aule mit 80 mL Gelvolumen eingesetzt.

b Annahme: 80% Ausbeute f¨ur den Schritt der Ultrafiltration

Tabelle 4.2: Partielle Aufreinigung der GFS: Verluste bei der Ultrafiltration/Gelfiltration.

Gel¨ostes Protein zeigt dennoch massenspezifische Aktivit¨aten im Bereich von 0,75 bis 1,67 U/mg; die gemessenen volumenspezifischen Aktivit¨aten der Glycerin-Pr¨aparationen la-gen nur bei 0,1 bis 0,6 U/mL.

Die letzte Spalte der Tabelle 4.2 macht deutlich, dass eine Verminderung des Enzymver-lustes w¨ahrend der Ultrafiltration zu durchaus zufriedenstellenden Enzymaktivit¨aten f¨uhren w¨urde. Wird von einer realistischen Ausbeute von 80% f¨ur den Schritt der Imidazolabtren-nung ausgegangen, so k¨onnten die in insgesamt vier Enzymaufreinigungen gewonnenen 147 U in einer einzigen Aufreinigung erhalten werden.