Tris-HCl, pH 8 MOPS, pH 7
6.5 Kontinuierliche Synthese von GDP-Fuc
Das diskontinuierliche Verfahren erm¨oglicht es bereits, GDP-Fuc in sehr guten Ausbeuten ausgehend von GDP-Man herzustellen, jedoch erlaubt dieses Verfahren nicht die maximale Ausnutzung der Enzyme. Imbatch-Verfahren zur Gewinnung von GKDM wird das eingesetzte Enzym nur einmalig verwendet1, bei der GFS-Reaktion kann es entsprechend der Anzahl an Zyklen im repetitive batch-Verfahren zwar mehrfach genutzt werden, dennoch ist der Enzym-verbrauch hoch.
Eine kontinuierliche Betriebsweise der GDP-Fuc -Synthese soll in der Lage sein, den Enzym-verbrauch weiter zu senken. F¨ur enzymkatalysierte Reaktionen hat sich in der Vergangenheit der Enzym-Membran-Reaktor (EMR) etabliert. Durch Anwendung dieses Reaktorkonzeptes wird eine Entkopplung der Verweilzeiten von Enzym und Substraten (Produkten) erreicht.
Zentrales Element des EMRs ist eine Ultrafiltrationsmembran, die den Biokatalysator im Reaktor zur¨uckh¨alt, w¨ahrend Substrat- und Produktmolek¨ule das kontinuierlich durchflosse-ne System ungehindert passieren k¨ondurchflosse-nen. Zur Substratf¨orderung wird lediglich eidurchflosse-ne Pumpe ben¨otigt. Ein wichtiger Vorteil des EMRs ist, dass die Reaktionen in homogener, fl¨ussiger Phase durchgef¨uhrt werden k¨onnen. Stofftransport-Limitierungen wie sie etwa bei Reaktoren mit tr¨agerfixierten Enzymen auftauchen, sind damit ausgeschlossen. Weiterhin ist es m¨oglich, l¨osliches Enzym in den Reaktor nachzudosieren. Auf diese Weise kann auch bei begrenzter Enzymstabilit¨at eine konstante Enzymaktivit¨at aufrecht erhalten werden.
P P
4°C
20°C 20°C
4°C
Enzym (GMD)
Enzym (GFS)
EMR 1 EMR 2
UF-Membran UF-Membran
Substrate
Produkte
1 2 3
4 2 3
4
1 Pumpe 3 Druckaufnehmer
2 Blasenfalle 4 Sterilfilter
Abbildung 6.8:Schematischer Aufbau der 2-stufigen R¨uhrkessel (EMR)-Kaskade.
Uber die Blasenfallen kann Enzym nachdosiert werden. Die Blasenfalle hinter dem ersten EMR er-¨ m¨oglicht zudem die Probenahme und Reaktionskontrolle der GMD-Reaktion.
Das Reaktorkonzept der kontinuierlichen, enzymatischen GDP-Fuc-Synthese ist schema-tisch in Abbildung 6.8 dargestellt. Die Trennung der beiden Reaktionen voneinander wird
1auch hier ist nat¨urlich einrepetitive batch-Verfahren m¨oglich.
durch eine 2-stufige R¨uhrkesselkaskade erreicht. Abbildung 6.9 zeigt ein Foto des Reaktors und die entsprechenden Peripherieger¨ate.
Die GMD-Reaktion wird im ersten EMR durchgef¨uhrt, der Auslauf des ersten EMRs ist gleichzeitig die Substratl¨osung f¨ur den zweiten Reaktor; hier findet die GFS-Reaktion statt.
Neben der Trennung der Reaktionen erf¨ullt dieses Reaktorkonzept damit eine weitere Anfor-derung an eine effiziente Synthese: der Cofaktor der GMD-Reaktion kann auch f¨ur die GFS-Reaktion genutzt werden. Dies kann zum einen durch kontinuierliches Zuf¨uhren von NADPH erreicht werden; wird aber der oxidierte Cofaktor NADP zugef¨uhrt, so muss er f¨ur die GFS-Reaktion, d.h. nach der GMD-GFS-Reaktion, zun¨achst reduziert werden (s. unten). Das Reaktor-konzept erlaubt zudem die schnelle Umsetzung des Zwischenproduktes GKDM zu GDP-Fuc, die relativ geringe Stabilit¨at von GKDM stellt damit keine Limitierung mehr dar.
Die beiden Reaktoren gleichen Volumens (3 mL) bestehen aus Plexiglas. Dadurch sollte einer m¨oglichen Desaktivierung der Biokatalysatoren durch Schwermetall-Verunreinigungen in Edelstahl-Reaktoren vorgebeugt werden. Wie schon imrepetitive batch-Verfahren (s. oben) wurde eine Ultrafiltrationsmembran1 mit einemcut off von 10 kD eingesetzt.
Abbildung 6.9:Foto der 2-stufigen R¨uhrkessel (EMR)-Kaskade.
Aus Gr¨unden der ¨Ubersichtlichkeit sind die Gef¨aße zur Temperierung der Reaktoren nicht dargestellt.
Die Reaktorwahl stellt einen Kompromiß aus den kinetischen Daten der beiden Reaktio-nen (GMD und GFS) dar. Aufgrund der Produktinhibierung der GFS durch GDP-Fuc und NADP ist der Enzym-Membran-Reaktor, der im Prinzip das reaktionstechnische Verhalten eines kontinuierlich betriebenen R¨uhrkessels aufweist, keine optimale L¨osung, da die Reakti-onsgeschwindigkeit im Arbeitspunkt – d.h. unter Auslaufbedingungen des Reaktors – schon
1Diaflo YM 10 der Firma Millipore (Amicon).
verringert ist. Die nur schwache Produktinhibierung der GMD, ebenso wie die Notwendigkeit, den Cofaktor f¨ur diese Reaktion permanent zuliefern zu m¨ussen, rechtfertigt den Einsatz des EMR f¨ur diese Reaktion.
In einem ersten Experiment zur kontinuierlichen Synthese sollte untersucht werden, ob f¨ur eine Kaskade aus zwei Enzym-Membran-Reaktoren entsprechend Abbildung 6.8 ein stabiler Betriebspunkt gefunden werden kann. Der Reaktion wurden kontinuierlich GDP-Man und NADPH zugef¨uhrt. GDP-Man wurde in einer Konzentration von 1 mM, NADPH wurde mit 1,5 mM im ¨Uberschuss eingesetzt. Auf diese Weise sollte sichergestellt werden, dass der redu-zierte Cofaktor f¨ur die GFS-Reaktion, trotz unerw¨unschter NADPH-Oxidation, mindestens in st¨ochiometrischer Menge zur Verf¨ugung stand. Abbildung 6.10 zeigt, dass f¨ur diese Kaskade ein stabiler Betriebspunkt erreicht werden konnte. ¨Uber einen Zeitraum von 20 h betrug der Umsatz f¨ur beide Reaktoren ¨uber 90%, jedoch ist ein schwacher Umsatzr¨uckgang aufgrund der Desaktivierung der Enzyme zu erkennen.
0 5 10 15 20
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Umsatz EMR 1 (GMD) Umsatz EMR 2 (GFS)
GMDundGFSnachdosiert GMD: + 0,45 U/mL GFS: + 0,17 U/mL
GDP-Fuc GKDM
GDP-Man GMD GFS
EMR 1 EMR 2
Zeit [h]
Umsatz[–]
Abbildung 6.10: Umsatz-Zeit-Verlauf der ersten kontinuierlichen Synthese von GDP-Fuc.
Bedingungen: 50 mM MOPS, pH 7, 10 mM MgSO4, 1 mM DTT, T = 20°C,τ= 60 min., V (Reaktor) = je 3 mL. GFS: 0,33 U/mL (Start), einmalig mit 0,17 U/mL nachdosiert; GMD: 0,4 U/mL (Start), einmalig mit 0,45 U/mL nachdosiert.Feed: 1 mM GDP-Man, 1,5 mM NADPH.
Der Umsatz wurde durch Messung der Proben im Auslauf, d.h. nach dem zweiten EMR der Kaskade, bestimmt. Die Versuche wurden bei hohen Enzymkonzentrationen durchgef¨uhrt (siehe Legende der Abbildung 6.10). Dementsprechend ist der produktmengenspezifische En-zymverbrauch hoch. F¨ur die GFS-Reaktion betr¨agt er 9,7 U/gGDP-Fuc, f¨ur die GMD-Re-aktion wurde er zu 41,6 U/gGDP-Fuc bestimmt. Auch die Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) ist mit 11,4 g/(L·d) f¨ur die einzelnen Reaktionen noch steigerungsf¨ahig.1F¨ur die Gesamtreaktion GDP-Man −→ GDP-Fuc betr¨agt die RZA aufgrund der doppelten Verweilzeit 5,7 g/(L·d).
1Es wurde mit einer Produktkonzentration von 0,75 mM gerechnet.
Abbildung 6.11 zeigt den Verlauf der Konzentrationen der gekoppelten EMR-L¨aufe. Die gemessenen Konzentrationen im Auslauf der Kaskade, d.h. Probenahme nach EMR 2, sind plausibel.
0 5 10 15 20
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
NADP (Auslauf nachEMR 1) NADP (Auslauf nachEMR 2)
0 5 10 15 20
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
* GDP-Fuc + GDP-X (siehe Text) Auslauf nachEMR 1 Auslauf nachEMR 2
GDP-Man GDP-Man
GKDM GKDM
GDP-X GDP-Fuc*
Zeit [h]
Zeit [h]
Konzentration[mM]Konzentration[mM]
Abbildung 6.11: Verlauf der Konzentrationen der ersten kontinuierlichen Synthese von GDP-Fuc. oben: Nucleotidzucker; unten: NADP.
Bedingungen entsprechend Abbildung 6.10.
Im Zeitraum zwischen 15 und 22 h wurden auch drei Proben aus dem Auslauf desersten EMRs der Kaskade (nach der GMD-Reaktion) vermessen (graue, durch Linien verbundene Symbole). Es ¨uberraschte, dass neben GDP-Man und GKDM eine weitere Substanz – hier alsGDP-Xbezeichnet – detektiert werden konnte. Das Verhalten dieser bisher unbekannten Komponente auf der HPLC und CE ließ vermuten, dass es sich ebenfalls um einen
GDP-tragenden Nucleotidzucker handelt.1 GDP-X coeluiert mit GDP-Fuc in der HPLC; in der Abbildung 6.11 sind daher die Konzentrationen von GDP-Fuc und GDP-X zusammengefasst.
Das Auftauchen dieser Verbindung wirft vor allem folgende Fragen auf:
• Aus welcher Substanz wird GDP-X gebildet?
• Handelt es sich um eine chemische oder enzymatische Nebenreaktion?
Zur Beantwortung dieser Fragen soll zun¨achst wieder Abbildung 6.11 herangezogen werden.
Offensichtlich wird GDP-X w¨ahrend der GMD-Reaktion gebildet, da die Substanz im Auslauf des ersten EMRs gemessen wird. GDP-X wird im zweiten EMR (GFS-Reaktion) nicht weiter umgesetzt. Die Summe aus GKDM und GDP-X des ersten EMRs ergibt die gemessene Kon-zentration von GDP-X und GDP-Fuc nach dem zweiten EMR. Es stellt sich nun die Frage, ob GDP-X in einer Folgereaktion aus GKDM gebildet wird oder aber in einer Parallelreaktion direkt aus GDP-Man. Einen Hinweis zur Beantwortung dieser Frage kann der untere Graph der Abbildung 6.11 geben. Dort ist die NADP-Konzentration im Auslauf des zweiten EMRs wiedergegeben (schwarze Rauten) sowie die NADP-Konzentration der drei Proben aus dem ersten EMR (offene Rauten). Im feed sind 1,5 mM NADPH enthalten. Im Auslauf der Kas-kade werden zwischen 15 und 22 h etwa 1 mM NADP gemessen, im Auslauf des ersten EMRs etwa 0,4 mM NADP. Somit werden im zweiten EMR etwa 0,6 mM NADP gebildet und damit 0,6 mM NADPH verbraucht. Diese NADPH-Menge wird zur Reduktion von 0,6 mM GKDM, die nach dem ersten EMR gemessen werden (s. oberer Graph), ben¨otigt. Damit werden be-reits 0,4 mM NADP im ersten EMR gebildet, bzw. 0,4 mM NADPH oxidiert. Die Vermutung liegt daher nahe, dass GDP-X, unter NADPH-Oxidation, aus GKDM in einer Folgereaktion entsteht.
Inbatch-Versuchen konnte diese These gest¨utzt werden: wurde eine 1 mM GKDM-L¨osung in Gegenwart von NADPH und GMD inkubiert, so bildete sich, in einer langsamen Reaktion, GDP-X unter gleichzeitiger Bildung von NADP. Diese Reaktion blieb aus, wenn das Enzym vorher desaktiviert wurde. Daraus konnte gefolgert werden, dass:
• GDP-X aus GKDM unter Bildung von NADP entsteht, und
• die Reaktion enzymatisch katalysiert wird.
Abbildung 6.12 auf der n¨achsten Seite zeigt das aus diesen ¨Uberlegungen resultierende Re-aktionsschema zur Bildung von GDP-X aus GKDM. Danach kann GKDM sowohl zu GDP-Fuc umgesetzt werden (GFS-Reaktion) als auch, eventuell katalysiert durch die GMD, zu der un-bekannten Verbindung GDP-X. In jedem Fall wird zur Bildung von GDP-X NADPH ben¨otigt.
Mit einem zweiten Lauf der EMR-Kaskade sollte die These der vermuteten Nebenreaktion im ersten EMR ¨uberpr¨uft und die Frage beantwortet werden, ob es gelingt, die Bildung von GDP-X durch Wahl des Cofaktors zu unterdr¨ucken. Da GDP-X vermutlich aus GKDM unter NADPH-Oxidation gebildet wird, sollte diese Nebenreaktion ausbleiben, wenn anstelle von NADPH der oxidierte Cofaktor NADP eingesetzt wird. Die Generierung von NADPH, welches f¨ur die GFS-Reaktion notwendig ist, erfolgt im zweiten EMR durch die Formiatdehydrogenase-Reaktion (integrierte Cofaktorregenerierung).
1neben der Retentionszeit weist die Substanz vor allem das charakteristische UV-Spektrum Guanosin-haltiger Verbindungen auf. Quantifizierung basiert auf der HPLC-Kalibrierung mit GDP-Man.
GDP-Man GKDM GDP-Fuc NADPH NADP
GDP-X
NADPH
NADP GMD
GMD (?)
GFS
Abbildung 6.12: Reaktionsschema zur Erkl¨arung der Bildung von GDP-X in einer GMD-katalysierten(?) Nebenreaktion.
Der Reaktorlauf wurde mit drei unterschiedlichen Substratl¨osungen durchgef¨uhrt (feed 1-3).
Der Verlauf des Umsatzes f¨ur beide Reaktoren sowie die entsprechenden Konzentrationen von GDP-Man, GKDM und GDP-Fuc sind in Abbildung 6.13 auf der n¨achsten Seite dargestellt.
Die Daten wurden nur aus Proben des Auslaufes am Ende der Kaskade gewonnen.
feed 1 (0 - 28 h): 1 mM GDP-Man 1,5 mM NADPH
feed 2 (28 - 52 h): 1 mM GDP-Man 1,5 mM NADP, 50 mM Formiat feed 3 (52 - 68 h): 1 mM GDP-Man 0,5 mM NADP, 50 mM Formiat
Im ersten Abschnitt des kontinuierliches Laufes (feed 1) werden f¨ur beide EMRs Ums¨atze uber 90% erreicht. Im zweiten Abschnitt (feed 2) ist der Umsatz im ersten EMR zun¨achst¨ noch hoch, jedoch f¨allt der Umsatz schneller ab. Dies k¨onnte an einer st¨arkeren Desaktivie-rung der GMD durch Formiat liegen. Drastisch ist jedoch der Abfall des Umsatzes im zweiten EMR (GFS-Reaktion) nach etwa 35 h. Die GFS setzt GKDM nicht mehr um (unterer Graph).
Die Nachdosierung von FDH bei 48 h f¨uhrt jedoch wieder zu einem sofortigen Anstieg des Umsatzes im zweiten EMR. Offensichtlich steht der GFS nicht gen¨ugend NADPH zur Re-aktion zur Verf¨ugung, die Cofaktorregenerierung scheint nicht ausreichend schnell zu sein.
Auf diesen Punkt wird weiter unten noch genauer eingegangen. Auch im letzten Abschnitt (feed 3) k¨onnen, nach Zugabe von GMD und GFS, zun¨achst hohe Ums¨atze erzielt werden, der Umsatz im zweiten EMR f¨allt aber auch hier stark ab.
0 10 20 30 40 50 60 70 0,0
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Auslauf nachEMR 2 GDP-Man GKDM GDP-Fuc
feed 1 feed 2 feed 3
0 10 20 30 40 50 60 70
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
UmsatzEMR 1(GMD) UmsatzEMR 2(GFS)
feed 3 feed 2
feed 1
+ GMD
+ GFS + GMD
+ GFS + FDH
+ GMD + FDH
+ GMD + GFS
Zeit [h]
Zeit [h]
Umsatz[–]Konzentration[mM]
Abbildung 6.13: Verlauf der zweiten kontinuierlichen Synthese von GDP-Fuc in der 2-stufigen EMR-Kaskade.
Bedingungen: 50 mM MOPS, pH 7, 10 mM MgSO4, 1 mM DTT, T = 20°C, τ = 60 min., V (Reak-tor) = je 3 mL. GMD: 75 mU/mL (Start), + 50 mU/mL (nach 28 h, 48 h und 52 h); GFS: 67 mU/mL (Start), + 17 mU/mL (28 h), + 33 mU/mL (52 h), FDH: 833 mU/mL (28 h), + 4,2 U/mL (48 h) feed 1: 1 mM GDP-Man, 1,5 mM NADPH;feed 2: 1 mM GDP-Man, 1,5 mM NADP, 50 mM Na-Formiat;feed 3: 1 mM GDP-Man, 0,5 mM NADP, 50 mM Na-Formiat.
Wie bereits erw¨ahnt, sollte mit diesem EMR-Lauf auch untersucht werden, ob die beob-achtete Nebenreaktion zur Bildung von GDP-X durch die Wahl des Cofaktors unterdr¨uckt werden kann. Abbildung 6.14 auf der n¨achsten Seite zeigt, dass GDP-X (schwarze Quadrate)
nur im ersten Abschnitt des kontinuierlichen Versuchs gebildet wird, d.h. nur in Gegenwart von NADPH im ersten EMR (feed 1). Wird dagegen NADP als Cofaktor eingesetzt (feed 2 und feed 3), so wird kein GDP-X gebildet.1 Dieses Ergebnis belegt, dass GDP-X in einer enzymatischen Reaktion aus GKDM und NADPH entsteht. In Kapitel 8 soll auf die m¨ogliche Identit¨at von GDP-X eingegangen werden.
0 10 20 30 40 50 60 70
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
* 0 - 28 h: GDP-Fuc + GDP-X Auslauf nachEMR 2 Auslauf nachEMR 1
GKDM GKDM
GDP-Fuc* GDP-X
feed 1 feed 2 feed 3
Zeit [h]
Konzentration[mM]
Abbildung 6.14:Vermeidung der Nebenreaktion in der EMR-Kaskade durch Wahl des Co-faktors.
Bedingungen: entsprechend Abbildung 6.13. Die Konzentration von GDP-X wurde n¨aherungsweise auf Basis einer externen Kalibrierung mit GDP-Man berechnet.
Abbildung 6.15 auf der n¨achsten Seite zeigt die Ursache f¨ur den starken Einbruch des Umsatzes im zweiten EMR (GFS-Reaktion), wenn NADP als Cofaktor eingesetzt wird. Die Vermutung, dass die Cofaktorregenerierung mit der FDH unter diesen Bedingungen nicht funktioniert, wird durch den Verlauf der NADP-Konzentration in der EMR-Kaskade best¨a-tigt. Die Umstellung von NADPH auf NADP erfolgte bei 28 h Laufzeit. Zur Generierung von NADPH f¨ur die GFS-Reaktion wurden 833 mU/mL FDH in den zweiten EMR dosiert. Es ist zu erkennen, dass die NADP-Konzentration zun¨achst stark abf¨allt und GDP-Fuc gebildet wird (28 – 32 h). NADPH muss also gebildet worden sein. Dann steigt die NADP-Konzen-tration jedoch wieder an, die KonzenNADP-Konzen-tration an GDP-Fuc sinkt, die GKDM-KonzenNADP-Konzen-tration steigt. Die erneute Nachdosierung von FDH bei 48 h (4,2 U/mL), jedoch nicht von GFS, l¨asst die NADP-Konzentration wieder auf beinahe Null absinken. Auch wird GKDM wieder zu GDP-Fuc umgesetzt. Aus diesem Sachverhalt muss gefolgert werden, dass die FDH unter den Bedingungen des EMR stark desaktiviert und nicht in der Lage ist, den Cofaktor NADPH
1Im unteren Graph der Abbildung 6.13 handelt es sich bei den schwarzen Kreisen im ersten Abschnitt (feed 1) demnach um GDP-FucundGDP-X.
effektiv f¨ur die GFS-Reaktion zur Verf¨ugung zu stellen. Dieses Verhalten der FDH ist spezi-fisch f¨ur den EMR. Wurde das Enzym unter sonst identischen Bedingungen im Satzreaktor inkubiert, so war es ¨uber Tage stabil (nicht dargestellt).
Die Raum-Zeit-Ausbeute liegt f¨ur diese zweite EMR-Kaskade bei 13,7 g/(L·d) f¨ur die ein-zelnen Reaktionen. F¨ur die Gesamtreaktion GDP-Man −→ GDP-Fuc betr¨agt sie, aufgrund der doppelten Verweilzeit, 6,8 g/(L·d). Diese Werte gelten f¨ur die Betriebspunkte mit den h¨ochsten Ums¨atzen.1
Im Gegensatz zum ersten kontinuierlichen Experiment, welches vor allem die M¨oglichkeit zur Realisierung dieses Reaktorkonzeptes belegen sollte, wurden bei dieser zweiten Kaskade ge-ringere Enzymkonzentrationen eingesetzt. Dementsprechend liegt der produktmengenspezifi-sche Enzymverbrauch f¨ur beide Reaktionen sehr viel niedriger. F¨ur die GMD-Reaktion betr¨agt er nur 2,8 U/gGDP-Fuc (0 – 28h), f¨ur die GFS-Reaktion hervorragende 1,6 U/gGDP-Fuc
(0 – 28h).
0 10 20 30 40 50 60 70
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
* 0 - 28 h: GDP-Fuc + GDP-X Auslauf nachEMR 2
GKDM GDP-Fuc* NADP
feed 3
feed 1 feed 2
+ 0,8 U/mL FDH + 4,2 U/mL FDH
Zeit [h]
Konzentration[mM]
Abbildung 6.15: Desaktivierung der FDH im zweiten EMR.
Bedingungen: entsprechend Abbildung 6.13; aufgrund der Instabilit¨at von NADPH in der HPLC kann diese Konzentration nicht angegeben werden.
1Es wurde mit einer Produktkonzentration von 0,9 mM gerechnet, d.h. 90% Umsatz f¨ur beide Reaktionen.