3 Material und Methoden
3.2.2 Molekularbiologische Methoden
3.2.2.2 Isolierung von DNA
3.2.2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefezellen - Plasmid Rescue 1,5ml einer Übernacht-Kultur in Selektionsmedium wurden für 1min bei RT und 14000 Upm zentrifugiert, das Zellsediment mit 500µl gewaschen und in 200µl Breaking-Puffer pH 8,0 (100mM NaCl, 10mM Tris/HCl, 1mM EDTA, 1% (w/v) SDS und 2% (v/v) TritonX-100) resuspendiert. Nach Zugabe von 200µl neutralisierten Glasperlen (~0,5mm) und 200µl Phenol/Chloroform-Lösung (50% (v/v) Phenol;
50% (v/v) Chloroform), wurden die Zellen 5min bei 37°C mittels Vortex aufgeschlossen. Danach wurden 200µl ddH2O zugegeben und die Suspension für 5min bei RT und 14000 Upm zentrifugiert. Anschließend wurden aus der obersten Phase 100µl entnommen und in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 280µl Ethanol (-20°C) und 10µl einer 3M Natriumacetat/Essigsäure-Lösung für 20min bei -80°C gefällt.
Nach Zentrifugieren für 10min bei 4°C und 14000 Upm wurde der Überstand entfernt und das DNA-Sediment einmalig mit 250µl eiskaltem 70% Ethanol gewaschen. Der Überstand wurde quantitativ entfernt und die DNA für 5 min bei 37°C getrocknet, in 30µl ddH2O aufgenommen und bei -20°C gelagert.
3.2.2.2.2 Isolierung chromosomaler DNA aus Hefezellen
Zur Isolierung chromosomaler DNA aus Hefezellen wurden 1,5ml einer für 16-18h über Nacht bei 30°C gewachsenen Zellsuspension einer Hefekultur entnommen. Die Probe wurde für 1min bei RT und 13000Upm zentrifugiert und anschließend einmalig mit 500µl ddH2O gewaschen.
Das erhaltene Sediment wurde in 200µl Lysepuffer pH 8,0 (100mM NaCl, 10mM Tris/HCl, 1mM EDTA, 1% (w/v) SDS und 2% (v/v) TritonX-100) resuspendiert.
Nach Zugabe von 200µl neutralisierten Glasperlen (~0,5mm) und 200µl
abwechselnd für 1min mittels eines Vortex gemischt und 1min auf Eis abgekühlt.
Dann wurden 200µl ddH2O dazugegeben und der komplette Ansatz für 10min bei RT und 13000Upm zentrifugiert. Anschließend wurde die wässrige Phase abgenommen und in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde mit 1ml eiskaltem Ethanol (absolut) gemischt, für 10min bei -20°C gefällt und bei 4°C für 10min und 13000Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das DNA-Sediment in 400µl ddH2O und 3µl RNase A (1mg/ml) resuspendiert und für 5min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 1ml eiskaltem Ethanol (absolut) und 10µl einer 5M Ammoniumacetatlösung wurde die DNA erneut für 10min bei -20°C gefällt, 10min bei 4°C und 13000Upm zentrifugiert und einmalig mit eiskaltem 70% Ethanol gewaschen. Im Anschluss wurde der Überstand vollständig entfernt, die DNA bei 37°C getrocknet, in 30µl ddH2O resuspendiert und bei -20°C gelagert.
3.2.2.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Zur Isolierung kleiner Mengen Plasmid-DNA aus Bakterien wurden die Kits
„QIAprep® Spin Miniprep Kit“ der Firma Qiagen und „Wizard® Plus SV Minipreps“
der Firma Promega verwendet. Größere Mengen Plasmid DNA wurden mittels der Kits „HISpeed® Plasmid Midiprep Kit“ und „HISpeed® Plasmid Maxiprep Kit“ der Firma Qiagen isoliert.
Die Isolierung erfolgte jeweils nach Angaben der Hersteller in den bereitgestellten Protokollen. Die erhaltene hochreine Plasmid-DNA wurde für PCR (3.2.2.9), Restriktionsanalysen (3.2.2.7) oder zur Transformation in Hefe (3.2.2.3.1/2) verwendet.
3.2.2.2.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agrarosegelen
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde mit dem
„QIAQuick® Gel Extraction Kit“ nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
3.2.2.3 Transformation
3.2.2.3.1 Transformation von DNA in Hefezellen nach der Lithiumacetat-Methode
Eine 50ml Hauptkultur (YPD-Medium) wurde aus einer logarithmisch gewachsenen Vorkultur (YPD-Medium) 1:10 angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5-0,8 angezogen. Die Zellen wurden für 5min bei RT mit 2000Upm, zweimal mit 50ml sterilem ddH2O gewaschen und einmal mit 2,5ml LiOAc-Sorbitol-Puffer pH 7,5 (100mM Lithiumacetat, 1mM EDTA, 10mM Tris und 1M D-Sorbitol) gewaschen. Die Zellen wurden daraufhin in 100µl LiOAc-Sorbitol-Puffer resuspendiert und für 15min bei 30°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde in zwei 50µl Aliquots aufgeteilt und jeweils mit 300µl PEG-Li-TE-Puffer pH 8,0 (40% (w/v) PEG 3350, 100mM Lithiumacetat, 1mM EDTA, 10mM Tris) gemischt.
Zu dieser Lösung wurden 5µl einzelsträngige Heringsperma-DNA (10mg/ml;
denaturiert durch Inkubation bei 95°C für 5min) und 1-3µl der zu transformierenden DNA gegeben. Nach einer Inkubation für 30min bei 30°C folgte ein Hitzeschock für 15min bei 42°C. Die Zellen wurden für 1min bei 3000Upm und RT zentrifugiert, der Überstand entfernt, die Zellen in 50µl sterilem ddH2O aufgenommen und auf CM-Selektionsplatten ausplattiert.
3.2.2.3.2 Transformation von DNA in Hefezellen „Quick and Dirty“
Mit einem sterilen Zahnstocher wurde das entsprechende Zellmaterial einer Agarplatte entnommen und mit 300µl PEG-Li-TE-Puffer pH 8,0 (40% (w/v) PEG 3350, 100mM Lithiumacetat, 1mM EDTA, 10mM Tris), 5µl einzelsträngiger (denaturiert durch Inkubation bei 95°C für 5min) Heringsperma-DNA (10mg/ml) und 1-3µl der zu transformierenden DNA gemischt. Nachfolgend wurde wie im Kapitel 3.2.2.3.1 verfahren.
3.2.2.3.3 Herstellung kompetenter Escherichia coli DH5α-Zellen
Eine 1l Hauptkultur (LB-Medium) wurde mit einer stationär gewachsenen 10ml Vorkultur (LB-Medium) des E. coli-Stammes DH5α 1:100 angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5-0,7 bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden dann für 10-15min auf Eis abgekühlt und danach bei 4°C für 8min bei 6500Upm zentrifugiert. Nach drei Waschschritten mit sterilem eiskalten ddH2O, zunächst
mit 1l, dann mit 500ml und zuletzt mit 20ml, wurden die Zellen mit 20ml eiskalten, sterilen 10% (v/v) Glycerin gewaschen. Danach wurde der Überstand entfernt und die Zellen in 2ml frischem 10% Glycerin aufgenommen. Die resuspendierten Zellen wurden in 40µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80°C gelagert.
3.2.2.3.4 Kompetenztest von E. coli DH5α-Zellen
Um die Kompetenz der E. coli DH5α-Zellen zu testen, wurde ein Aliquot der Zellen mit 0,1µg des Plasmids pBR322 transformiert (3.2.2.3.5). Die Transformationsrate sollte bei 109Zellen pro µg DNA liegen.
3.2.2.3.5 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli DH5α-Zellen
Für die Transformation mittels Elektroporation wurde ein 40µl Aliquot kompetenter E. coli DH5α-Zellen (3.2.2.3.3) auf Eis aufgetaut und dann mit 1-3µl Plasmid-DNA gemischt. Der Ansatz wurde in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die Küvette wurde mit abgetrockneten Kontakten in den Elektroporator eingesetzt und der Elektroschock bei einer Kapazität von 25µF, einer Spannung von 2500V und einem Widerstand von 200Ω gegeben. Die Entladezeit sollte optimalerweise im Bereich von 5-6ms liegen.
Nach der Zugabe von 950µl SOC-Medium wurde die Suspension in ein frisches steriles Reaktionsgefäß gegeben und für 1h bei 37°C unter Schütteln inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen bei 3000Upm und RT für 1min zentrifugiert, der Überstand verworfen, die Zellen in 50µl sterilem ddH2O resuspendiert, auf einer LB-Selektionsplatte ausplattiert und für 12-16h bei 37°C angezogen.