Die Suche nach neuen Bindungspartnern für Trs85

Obwohl ursprünglich als GSG1 (generel sporulation gene 1) identifiziert (Kaytor und Livingston, 1995), ist Trs85 eine nicht-essentielle Untereinheit der TRAPP (transport protein particle)-Komplexe. TRAPP I (Bet5, Bet3, Trs20, Trs23, Trs31, Trs33 und Trs85) und TRAPP II (TRAPP I-Komponenten und Trs65, Trs120 sowie Trs130) wurden von M. Sacher und Kollegen isoliert (Sacher et al., 2001).

Für trs85Δ-Zellen konnte gezeigt werden, dass proApe1 über den Cvt-Weg nicht gereift wird und über Autophagie nur mit 50% der Effizienz des Wildtyps (Meiling-Wesse et al., 2005). Somit scheint Trs85 eine spezifische Funktion im Cvt-Weg zu besitzen. Mit welchen zusätzlichen Proteinen Trs85 für diesen Weg

interagiert ist nicht bekannt. Weitere Interaktionspartner für Trs85 sollten in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der TAP-Tag (tandem affinity purification)-Methode identifiziert werden. Der Tag besteht aus der Proteinsequenz für zwei IgG-Bindungsstellen des Protein A und einem Calmodulinbindenden Peptid (CBP), die durch eine Spaltstelle der TEV (Tobacco Etch Virus)-Protease voneinander getrennt sind (Puig et al., 2001). Chromosomal integrierte TAP-Fusionsproteine sind für fast alle Hefeproteine kommerziell erhältlich.

Zur Etablierung der Methode wurde zunächst das Fusionsprotein Bet3-TAP verwendet, da Bet3 bereits erfolgreich in den Studien von Sacher (Sacher et al., 2001) für die Isolation der TRAPP-Komplexe eingesetzt wurde.

Bet3-TAP wurde nach dem in Abschnitt 3.2.3.7 erklärten Verfahren aus Hefezellen isoliert, über zwei Säulen gereinigt und die Proteine durch eine SDS-PAGE separiert. Nach Färbung mit colloidalem Coomassie wurde das Gel für die massenspektroskopische Identifizierung der einzelnen Proteinbanden verwendet. Dazu folgte ein In-Gel-Verdau (IGV) der Proteinbanden mit Trypsin.

Die erhaltenen Peptide wurden durch MALDI-TOF-Analysen identifiziert (siehe 3.2.3.8).

Abbildung 4.16: Coomassie-gefärbtes Gel des TRAPP-Komplexes.

Zellen des Stammes S288C Bet3-TAP wurden bei einer OD600 von 2 geerntet und nach dem TAP-Protokoll (siehe 3.2.3.7) aufgeschlossen, der an Bet3-TAP gebundene Komplex aufgereinigt und in einem 4-15%-SDS-Gel separiert. Die einzelnen Proteinbanden wurden in einem In-Gel-Verdau mit Trypsin in Peptide aufgespalten und diese durch MALDI-TOF Massenspektroskopie analysiert. Die Identifikation der Proteine erfolgte durch BLASTP-Suche mit Hilfe der MASCOT Datenbank (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html).

Um die jeweils gefundenen Peptide bekannten Proteinen zuzuordnen wurde die MASCOT Datenbank (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) genutzt. Abbildung 4.16 zeigt den mit Bet3-TAP isolierten TRAPP-Komplex im Coomassie-gefärbten Gel. In diesem Versuch konnten neun der zehn bekannten Komponenten des TRAPP II-Komplexes identifiziert werden: Trs120, Trs85, Trs65, Trs33, Trs31, Bet3, Trs23, Trs20 und Bet5. Zusätzlich wurden noch Tef1, Rpl4a, Tdh3 und Rps19A/B gefunden. Trs130 konnte in mehreren Versuchen nicht identifiziert werden.

Für die Aufreinigung mit Trs85-TAP wurden die gleichen Bedingungen und wie für Bet3-TAP gewählt. Abbildung 4.17 zeigt die mit Trs85-TAP isolierten Proteine im coomassie-gefärbten Gel. In diesem Versuch konnten Trs31 und Trs20 aus dem TRAPP II-Komplex identifiziert werden. Zusätzlich wurden noch Tef1 und Tdh3 gefunden, die auch im Versuch mit Bet3-TAP isoliert wurden.

1 Trs85 2 Tef1 3 Tdh1 4 Trs31 5 Trs20

Abbildung 4.17: Coomassie-gefärbtes Gel der TAP-Aufreinigung mit Trs85 (1) Zellen des Stammes S288C Trs85-TAP wurden bei einer OD₆₀₀ von 2 geerntet und nach dem TAP-Protokoll aufgeschlossen, der an Trs85-TAP gebundene Komplex aufgereinigt und in einem 4-15%-SDS-Gel separiert. Die einzelnen Proteinbanden wurden in einem In-Gel-Verdau mit Trypsin in Peptide aufgespalten und diese durch MALDI-TOF Massenspektroskopie analysiert. Die Identifikation der Proteine erfolgte durch BLASTP-Suche mit Hilfe der MASCOT Datenbank (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html).

In einem weiteren Versuch mit Trs85-TAP (Abbildung 4.18) wurden weitere Proteine als vermutliche Interaktionspatner von Trs85 gefunden. Aus dem TRAPP-Komplex wurde Trs33, aber nicht Trs31 und Trs20 wie im vorherigen Versuch identifiziert (Abbildung 4.17). Tdh3 und Tef1 wurden erneut gefunden sowie Sse1, Ssa1/2 nebst Ssb1/2, Pdc1, Tdh2, Fin1, Rps5, Rps7 und Rpl26b.

Trs85

Abbildung 4.18: Coomassie-gefärbtes Gel der TAP-Aufreinigung mit Trs85 (2).

Zellen des Stammes S288C Trs85-TAP wurden bei einer OD₆₀₀ von 2 geerntet und nach dem TAP-Protokoll aufgeschlossen, der an Trs85-TAP gebundene Komplex aufgereinigt und in einem 4-15%-SDS-Gel separiert. Die einzelnen Proteinbanden wurden in einem In-Gel-Verdau mit Trypsin in Peptide aufgespalten und diese durch MALDI-TOF Massenspektroskopie analysiert. Die Identifikation der Proteine erfolgte durch BLASTP-Suche mit Hilfe der MASCOT Datenbank (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html).

Sse1, Ssa1/2, Ssb1/2 (alle Mitglieder der HSP70 Chaperon Familie), sowie Rps5, Rps7 (beides Proteine der kleinen 40S ribosomalen Untereinheit), Rpl26b (Protein der 60S ribosomalen Untereinheit), sowie Pdc1 (Pyruvat Decarboxylase Isoenzym 1), Fin1 (Spindelpol Filamentprotein), Tdh2 (Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase) und Tef1 (Translations Elongations Faktor EF-1 alpha), sind mit großer Wahrscheinlichkeit unspezifisch aufgereinigte Proteine.

Weitere Proteine der TRAPP-Komplexe oder Proteine die auf eine Funktion beim Cvt-Weg bzw. bei der Autophagie deuten, konnten nicht identifiziert werden.

Für weitere Versuche mit Hilfe des TAP-Tags Interaktionspartner für Trs85 zu identifizieren, wurde auf die Reinigung mit Hilfe des Calmodulin Bindepeptids verzichtet. Dieser Ansatz hat den Nachteil, dass vermehrt Proteine unspezifisch eluiert werden, bietet aber den Vorteil nur kleinere Volumina Zellkultur zu

benötigen und weniger Gesamtprotein durch die zweite Aufreinigung zu verlieren. Zudem lassen sich dadurch in parallelen Ansätzen verschiedene Extrakte auf zusätzliche Proteinbanden bzw. auf Unterschiede im Bandemuster hin vergleichen.

Abweichend von der Vorschrift (siehe 3.2.3.7) wurden 500ml statt 2l Kultur eingesetzt. Die weiteren Bedingungen wurden nicht verändert. Ein Proteinextrakt des Wildtyp-Stammes BY4741 sowie Extrakte von Bet3-TAP und Trs85-TAP wurden über eine SDS-PAGE separiert, mit colloidalem Coomassie gefärbt und die Banden der einzelnen Extrakte verglichen. Wie in Abbildung 4.19A zu sehen, ist nahezu kein Unterschied in den Bandenmustern zu erkennen.

Um zu sehen, ob die Aufreinigung überhaupt zu einer Anreicherung von Bet3-TAP und Trs85-TAP in den Proteinextrakten geführt hat, wurde mit diesem Gel eine Western-Blot-Analyse durchgeführt.

A B

Trs85-TAP

Bet3-TAP

Abbildung 4.19: Coomassie-gefärbtes Gel der TAP-Aufreinigung mit BY4741 (wt), Bet3-Tap und Trs85-TAP ohne 2. Aufreinigungschritt

A: Zellen der Stämme BY4741, S288C Bet3-TAP und S288C Trs85-TAP wurden bei einer OD₆₀₀ von 2 geerntet und nach dem TAP-Protokoll aufgeschlossen, die Proteinextrakte über die erste Säule aufgereinigt und in einem 10%-SDS-Gel separiert und mit colloidalem Coomassie gefärbt. B: Mit dem Gel aus A wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Der Immunoblot mit Antikörtper gegen den TAP-Tag zeigt, dass Bet3-TAP und Trs85-TAP in den jeweiligen Präparaten vorhanden waren.

In dem Immunoblot mit Antikörtper gegen den TAP-Tag ist zu sehen, dass beide Proteine in den Extrakten vorlagen (Abbildung 4.19B). Die Nachweisempfindlichkeit eines Immunoblots ist wesentlicher höher ist als die einer Färbung mit Coomassie. Im Vergleich der Signale von Bet3-TAP zu Trs85-TAP im Immunoblot, liegt Trs85-TAP in weit geringerer Menge im jeweiligen Proteinextrakt vor.

In einem weiteren Versuch ohne zweiten Aufreinigungsschritt wurde erneut ein Proteinextrakt von Trs85-TAP durch eine SDS-PAGE separiert und mit colloidalem Coomassie gefärbt. Die Mehrzahl der Banden des Extrakts von Trs85-TAP wurde massenspektroskopisch identifiziert (Abbildung 4.20). Es konnte in dem Gel weder Trs85-TAP selbst noch ein anderes Protein der TRAPP-Komplexe identifiziert werden.

Abbildung 4.20: Coomassie-gefärbtes Gel der TAP-Aufreinigung mit Trs85 ohne 2. Aufreinigungsschritt

Zellen des Stammes BY4741 Trs85-TAP wurden bei einer OD₆₀₀ von 2 geerntet und nach dem TAP-Protokoll aufgeschlossen, der an Trs85-TAP gebundene Komplex über die erste Säule aufgereinigt und in einem 10%-SDS-Gel separiert. Die einzelnen Proteinbanden wurden in einem In-Gel-Verdau tryptisch in Peptide aufgespalten und diese durch MALDI-TOF Massenspektroskopie analysiert. Die Identifikation der Proteine erfolgte durch BLASTP-Suche mit Hilfe der MASCOT Datenbank (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html).

4.7 Analyse des Wachstums von Autophagie-Mutanten unter