Überexpression von GFP-YGR223C führt zur Sekretion von Carboxypeptidase Y (CPY)

Die vakuoläre Hydrolase Carboxypeptidase Y (auch Proteinase C) wird als inaktive Proform synthetisiert, im ER Lumen nach Spaltung seiner N-terminalen Signalsequenz N-glykosiliert und phosphoryliert (Hashimoto et al., 1981; Hasilik und Tanner, 1978). Nach dem Transport zum Golgi-Apparat und der Addition weiterer Oligosaccharide, verlässt die sogenannte p2-CPY-Form das Prevakuoläre Kompartiment (prevacuolar compartment = PVC) und wird durch Bindung an seinen Rezeptor Vps10 mittels eines vakuolären Lokalisierungssignals im N-terminalen Teil des Propeptids zur Vakuole transportiert (Deloche et al., 2001;

Valls et al., 1990). In der Vakuole wird sie dann durch Proteinase A gereift (Sorensen et al., 1994).

Untersuchungen zur möglichen Funktion der drei Homologen Proteine Atg18, Atg21 und Ygr223c in verschiedenen Transportwegen der Zellen wurden durch

Dazu wurden sowohl Einfach-, Doppel- und Dreifach-Deletionen der Gene als auch Überexpressions-Plasmide hergestellt und unter verschiedenen Bedingungen getestet. Es zeigte sich, dass nur die Überexpression von GFP-YGR223C zur Sekretion von CPY führte.

Zur Verifizierung dieser Entdeckung wurden der Wildtypstamm WCG4a mit verschiedenen Überexpressionsplasmiden und vps28∆ mit dem Leervektor pUG36 transformiert. Dadurch wurden folgende Stämme erhalten:

WCG4a mit dem Leervektor (Negativkontrolle), WCG4a mit GFP-Atg18, WCG4a mit GFP-Atg21, WCG4a mit GFP-Ygr223c und vps28∆ mit pUG36 als Positivkontrolle. Vps28 ist eine Komponente des ESCRT-I Komplexes. Die Deletion von VPS28 führt zur Sekretion von CPY (Robinson et al., 1988).

Mit Zellen dieser Stämme wurde ein CPY-Overlay-Assay durchgeführt (siehe 3.2.3.11). Im Immunoblot mit Antikörper gegen CPY ist zu sehen, dass die Positivkontrolle CPY stark sekretiert. WCG4a mit pUG36, GFP-Atg18 und mit GFP-Atg21 zeigen nur ein sehr geringes Signal. WCG4a mit GFP-Ygr223c zeigt eine signifikante, aber im Vergleich zur Positivkontrolle vps28∆ mit pUG36 eine geringere Sekretion von CPY (Abbildung 4.14).

WCG4a GFP-Atg18

WCG4a GFP-Ygr223c WCG4a GFP-Atg21

vps28∆ pUG36 WCG4a pUG36

WCG4a GFP-Atg18

WCG4a GFP-Ygr223c WCG4a GFP-Atg21

vps28∆ pUG36 WCG4a pUG36

Abbildung 4.14: Sekretion von CPY bei Überexpression von GFP-Ygr223c.

Mit Zellen der Stämme WCG4a mit pUG36 (Negativkontrolle), WCG4a mit GFP-Atg18, WCG4a mit GFP-Atg21, WCG4a mit GFP-Ygr223c und vps28∆ mit pUG36 (Positivkontrolle) wurde ein CPY-Overlay-Assay durchgeführt. Im Immunoblot mit Antikörper gegen CPY ist zu sehen, dass die Positivkontrolle CPY stark sekretiert. WCG4a mit pUG36, mit GFP-Atg18 und mit GFP-Atg21 zeigen nur ein sehr geringes Signal. WCG4a mit GFP-Ygr223c zeigt eine signifikante, aber im Vergleich zur Positivkontrolle vps28∆ mit pUG36 eine geringere Sekretion von CPY.

4.5.1 Co-Transformation von WCG4a mit GFP-Ygr223c mit der Genbank AB320

Als nächstes stellte sich die Frage warum CPY sekretiert wird, wenn GFP-YGR223C in der Zelle überexprimiert ist. Dies führte zu der Überlegung, dass Ygr223c möglicherweise mit einem Protein (oder mehreren), welches für den funktionellen sekretorischen Transportweg wichtig ist, interagiert. Die Überexpression von Ygr223c könnte dazu führen, dass eine Komponente des CPY-Transportweges durch Interaktion mit überschüssigem Ygr223c blockiert wird und ihre Funktion nicht mehr ausführen kann und dadurch der sekretorische Weg gestört wird. Würde dieser hypothetische Bindungspartner überexprimiert werden, und dadurch in einer ähnlichen Anzahl an Molekülen vorliegen wie Ygr223c, könnte dies den Defekt aufheben. Diese Überlegung lieferte einen neuen Ansatz zur Identifizierung von potentiellen Interaktionspartnern. Dazu wurde in den Stamm WCG4a mit GFP-Ygr223C zusätzlich die Genbank AB320 (ATCC Nummer 37323) transformiert. Diese Genbank enthält 5-20 kB lange DNA-Fragmente, die in den Überexpressionsvektor YEp13 integriert sind und in etwa 10000 Klonen das ganze Hefe-Genom abdecken (Nasmyth und Reed, 1980b). Die Negativ- und Positivkontrolle WCG4a mit pUG36, respektive vps28∆

mit pUG36, wurden zusätzlich mit dem leeren Vektor pRS315 transformiert, damit beide Stämme die gleichen Selektionsbedingungen hatten wie WCG4a mit GFP-Ygr223c und YEp13.

Im gesamten Ansatz wuchsen 20721 Kolonien verteilt auf 60 Platten. Von diesen Platten wurden Replika angefertigt. Anschließend wurde mit einem Zahnstocher an fünf verschiedenen Punkten eine geringe Menge Zellmaterial des Stammes WCG4a mit pUG36 und pRS315 (Negativkontrolle) und an einem Punkt Material des Stammes vps28∆ mit pUG36 und pRS315 (Positivkontrolle) auf jede Platte aufgebracht. Im Immunoblot mit Antikörper gegen CPY ist zu sehen, dass der Referenzstamm und die meisten Kolonien CPY sekretieren.

In Abbildung 4.15 ist exemplarisch eine Originalplatte des Screens vor dem Replika-plattieren mit dem korrespondierenden Immunoblot gezeigt. Pfeile markieren die Kolonien, die wenig bzw. keine CPY-Sekretion aufzeigen. Die Referenzpunkte sind mit einem Kreis markiert.

Von Kolonien die keine CPY-Sekretion gezeigt haben, wurde ein Teil der Zellmasse auf eine Selektionsplatte im Patch ausgestrichen. Zusätzlich wurden die Stämme WCG4a mit pUG36 und pRS315 (Negativkontrolle) und vps28∆ mit pUG36 und pRS315 (Positivkontrolle) ausgestrichen. Im Immunoblot mit Antikörper gegen CPY wurde dann überprüft, welche der Stämme weiterhin CPY sekretieren, diese Stämme wurden erneut ausgestrichen. In zwei weiteren unabhängigen Versuchen wurde im Immunoblot mit Antikörper gegen CPY die fehlende CPY-Sekretion überprüft (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 4.15: Sekretion von CPY bei Überexpression von GFP-YGR223C.

In den Stamm ygr223c∆ mit GFP-Ygr223c wurde zusätzlich die Genbank AB320 transformiert. Im gesamten Ansatz wuchsen 20721 Kolonien verteilt auf 60 Platten. Nach der Replika-Plattierung wurde mit einem Zahnstocher an fünf verschiedenen Punkten Zellmaterial des Stammes WCG4a mit pUG36 und pRS315 (Negativkontrolle) und an einem Punkt Material des Stammes vps28∆ mit pUG36 und pRS315 (Positivkontrolle) auf jede Platte gegeben, eine Nitrocellulose-Membran auf die Zellen gelegt und die Platte bei 30°C für 2-3 Tage inkubiert. Exemplarisch dargestellt ist eine Originalplatte (rechts) des Screens vor dem Replika-plattieren mit dem korrespondierenden Immunoblot (links). Pfeile markieren die Kolonien die geringe bzw. keine CPY-Sekretion aufzeigen.

Die Referenzpunkte sind mit einem Kreis markiert.

Von den Stämmen die weiterhin keine CPY sekretierten wurde Plasmid-DNA durch Plasmid Rescue (siehe 3.2.2.2.1) aus den Hefezellen extrahiert und in E. coli transformiert. Nach der erneuten Extraktion der Plasmid-DNA aus E. coli wurden die Plasmide durch Sequenzanalyse näher bestimmt. Dafür wurden die erhaltenen Sequenzen durch BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Analyse

in der SGD Datenbank Genomabschnitten zugeordnet (http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/blast-sgd.pl). Das Ergebnis dieser Analysen ist in Tabelle 4.6 zusammengefasst.

Tabelle 4.6: Im Screen gefundene potentielle Interaktionspartner von GFP-Ygr223c.

Klon ORF Chromosom Sequenz- Funktion

bereich (Bp)

1 SRB8 III 258334-258862 RNA Polymerase II Mediator 2 SRB8 III 258482-258863 RNA Polymerase II Mediator 3 CDC45 XII 344798-345279 DNA-Replikation Initiationsfaktor

4 GCD2 VII 645082-645517

Translations-Initiationsfaktor eIF2B

5 AIM21 IX 362143-362512 unbekannt

6 OTU2 VIII 78316-78917 unbekannt

Insgesamt wurden in dem Screen fünf unterschiedliche potentielle Interaktionspartner für GFP-Ygr223c gefunden. SRB8 codiert für eine Untereinheit des RNA Polymerase II Mediator Komplex. Cdc45 ist ein DNA-Replikation Initiationsfaktor, Gcd2 ist dagegen die Delta-Untereinheit des Translations-Initiationsfaktor eIF2B. Aim21 und Otu2 sind Proteine mit unbekannter Funktion.