Isoenzymanalysen an Nachkommenschaften

Zur Analyse des Gentransfers zwischen Teilpopulationen von P. spinosa wurden Nachkommenschaften aus beiden Untersuchungsgebieten isoenzymatisch untersucht. Im Hellental wurden aus fünf Talabschnitten (Tab. 4.33) jeweils 60 Nachkommen beprobt. Die Auswertung der Ergebnisse soll Aufschluss über die Distanz der Ausbreitung insbesondere seltener Allele erbringen.

Aus dem Untersuchungsgebiet Vahle wurde unter anderem die Nachkommenschaft (80 Sämlinge) eines isolierten P. spinosa-Vorkommens aus dem mittleren Tal (ML-Genotyp 7, Abb. 4.3) isoenzymatisch untersucht. Lassen sich hier neue Allele nachweisen, dann zeigen diese Ergebnisse, dass trotz großer Distanz zum nächstgelegenen Vorkommen eine Einbringung von fremden Pollen stattgefunden hat. Des Weiteren wurde die Nachkommenschaft der Teilpopulation aus dem westlichen Tal (ML-Genotypen 1-6, Abb.

4.3) analysiert. Hier hatten die isoenzymatischen Untersuchungen der Muttersträucher eine verhältnismäßig niedrige allelische Vielfalt aufgedeckt. Insgesamt konnten hier 167 Nachkommen analysiert werden, davon je 40 von den Genotypen 4, 5 und 6, 32 von ML-Genotyp 1 und 15 von ML-ML-Genotyp 3 (von ML-ML-Genotyp 2 standen keine Nachkommen zur Verfügung).

3.7.3 Vererbungsanalysen

Die Kenntnis über die genetische Kontrolle der Enzymsysteme und der beobachteten Elektromorphe sowie deren Vererbungsmodus ist eine unausweichliche Bedingung für ihre Verwendung als Genmarker. Unter einem Genmarker versteht man im Allgemeinen ein variierendes Merkmal, dessen eindeutige Beziehung zu seinen kodierenden Genen nachgewiesen ist. Weiterführende Interpretationen wie beispielsweise die Ermittlung von Heterozygotiegraden oder genetischen Abständen von Populationen sind unter der Annahme eines falschen Vererbungsmodus wertlos.

Für eine Vererbungsanalyse werden idealer Weise die Nachkommenschaften kontrollierter Kreuzungen sowie Gewebe vom gleichen Typ und ontogenetischen Stadium der Eltern und Nachkommen verwendet. Kontrollierte Kreuzungen sind jedoch bei Bäumen oft mit einem hohen technischen Aufwand verbunden und erbringen häufig nicht eine ausreichende Anzahl von Nachkommen für statistische Tests. Außerdem ist wegen der langen Generationszeit der

Bäume eine Beprobung von ontogenetisch gleichem Material von Eltern und Nachkommen selten durchführbar. Da sich jedoch zahlreiche Enzyme als ontogenetisch stabil und in ihrer Ausprägung von der Umwelt unabhängig gezeigt haben, ist der Vergleich von verschiedenen ontogenetischen Stadien möglich. Die Analyse der Nachkommen zu einem frühen Zeitpunkt hat den Vorteil, dass verschiedene Selektionsprozesse ausgeschlossen werden. In der Regel werden die Nachkommenschaften von frei abgeblühten Müttern mit bestimmten Enzym-Phänotypen untersucht.

Die beschriebene Methode nach GILLET & HATTEMER (1989) dient der Überprüfung der Hyphothese einer kodominanten Einzel-Locus Vererbung, die es ermöglicht, jedem Isoenzym-Phänotyp einen bestimmten Genotyp zuzuordnen. Hierfür sind drei Annahmen vorauszusetzen:

1. regelmäßige meiotische Segregation während der Produktion der Eizellen 2. zufällige Befruchtung der Eizellen von jedem Pollen(Haplo-)typ

3. Abwesenheit von Viabilitätsselektionen

Unter diesen Annahmen werden in der Nachkommenschaft eines frei abgeblühten Samen-Elters mit dem putativ heterozygoten Genotyp AiAj auf der Basis der Mendelschen Gesetze folgende qualitative und quantitative Verhältnisse erwartet (LEINEMANN & BENDIXEN, 1999):

a) jeder Nachkomme besitzt mindestens ein Allel A_i oder A_j

b) Die Anzahl der heterozygoten Nachkommen mit dem Phänotyp A_iA_j (N_ij) ist gleich der Anzahl der homozygoten Nachkommen A_iA_i (N_ii) und A_jA_j (N_jj).

N_ij = N_ii + N_jj

c) Bei Nachkommen mit einem nicht mütterlichen Allel A_k ist die Anzahl der Nachkommen mit dem Phänotyp A_iA_k (N_ik) gleich der Anzahl derer mit dem Phänotyp A_jA_k (N_jk).

N_ik = N_jk

Die Abweichungen der beobachteten von den erwarteten Häufigkeiten wurden mit dem χ² -Test überprüft. Da oft nur wenige Nachkommen eines bestimmten Genotyps für eine Analyse zur Verfügung standen, wurden die Häufigkeiten verschiedener Nachkommenschaften summiert und ebenfalls einem statistischen Test unterzogen. Diese Vorgehensweise ist nach strenger Anwendung der Methode von GILLET & HATTEMER (1989) nicht üblich, da sich diese nur auf Einzelnachkommenschaften bezieht.

Nach statistischer Absicherung der Einzel-Ergebnisse gilt der Nachweis, dass die untersuchten Enzym-Phänotypen eindeutig bestimmte Enzym-Genotypen repräsentieren, als

In Ergänzung zu der Arbeit von ROVIRA et al. (1993) wurden bei C. avellana die putativen Genorte ADH-A und SKDH-A einer genetischen Analyse unterzogen. Nach der Methode von GILLET & HATTEMER (1989) wurden die beobachteten Genotyphäufigkeiten mit den erwarteten Häufigkeiten verglichen. Sowohl für C. avellana als auch für P. spinosa wurden die angezogenen Nachkommenschaften der frei abgeblühten In-situ-Sträucher verwendet.

Bei der tetraploiden P. spinosa wurden die Vererbungsanalysen in Anlehnung an eine Arbeit von LEINEMANN (2000) durchgeführt. In dieser Untersuchung wird eine neue Methode der Vererbungsanalyse für tetraploide Arten am Beispiel von P. spinosa an den Enzymgenorten PGI-B, 6-PGDH-A, 6-PGDH-B und IDH-A vorgestellt. Die Methode beschränkt sich auf die Analyse diallelischer, triplex-heterozygoter Samen-Eltern (A_iA_iA_iA_j oder A_jA_jA_jA_i). Dies ist insofern von Vorteil, als dass unter der Annahme von Chromosomen-Segregation die Samen-Eltern in nur zwei Typen von Eizellen (A_iA_i) und (A_iA_j) mit der Häufigkeit P(A♀ _ii) = P(A♀ ij) =1/2 aufspalten. Die Hypothese basiert auf der Annahme von Einzellocus kontrollierten Isoenzym-Phänotypen mit codominanten tetrasom vererbten Allelen und regelmäßiger Mendelscher Segregation der Gameten. Neben der Chromosomen-Segregation gelten die oben beschriebenen Annahmen 1-3.

Im Folgenden sind die erwarteten Genotyp-Häufigkeiten von einer Einzel-Nachkommenschaft einer frei abgeblühten Mutter mit einem triplex-heterozygoten Genotyp dargestellt:

a) Befruchtung der Eizellen mit Pollen, der ausschließlich mütterliche Allele i und j (i≠j) enthält (A_iA_i, A_iA_j, A_jA_j):

N_iiij + N_ijjj = N_iiii + N_iijj

b) Befruchtung der Eizellen mit Pollen, der ein nicht-mütterliches Allel k≠i≠j enthält (A_iA_k, A_jA_k):

N_iijk = N_iiik + N_ijjk

c) Befruchtung der Eizellen mit Pollen, der keines der mütterlichen Allele k≠i≠j enthält (A_kA_k):

N_iikk = N_ijkk

Weil die untersuchten Nachkommenschaften nicht speziell für die Vererbungsanalysen angezogen wurden, war die Anzahl an Nachkommen häufig nicht sehr hoch. Deshalb wurden für jeden Genotyp mehrere Nachkommenschaften von verschiedenen frei abgeblühten Muttersträuchern untersucht.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Vererbungsanalyse für die Genorte MDH-A, MDH-B, PGDH-A, PGDH-B und LAP-A fortgeführt. Bei den bereits untersuchten Genorten 6-PGDH-A und 6-PGDH-B wurden neu entdeckte Isoenzymphänotypen getestet. Für das Enzymsystem IDH standen Daten von den Untersuchungen zum Gentransfer zur Verfügung, weshalb diese mitangeführt werden.