Ein weiteres Ziel der Studie ist es gewesen, MHC Klasse I als funktionellen Liganden eines CD8ββ-Homodimers zu identifizieren und die Rolle der drei Aminosäuren Asparagin 28, Arginin 30 und Lysin 56 der CD8β-Kette als Bindungspartner an MHC zu prüfen.
Bisher wurde im Falle des CD8-Korezeptors nur die Funktion und Bindungsaktivität des CD8αα-Homo- und CD8αβ-Heterodimers untersucht, da die fehlende Expression von CD8ββ eine genauere funktionelle Charakterisierung der CD8β-Kette verhinderte.
Gao et al. (8) konnten das humane CD8αα-Homodimer und MHC Klasse I kokristallisieren.
Mit Hilfe einer Röntgenstrukturanalyse analysierten sie die Konformation des Kokristalls und simulierten mit einem Computermodell die Bindung des CD8αβ-Heterodimers an MHC Klasse I, dessen kristalline Darstellung bisher nicht gelungen ist. Wichtig für die nähere Charakterisierung der Bindung von CD8αβ mit MHC Klasse I war, ob das β-Polypeptid des αβ-Heterodimers an die Stelle der CD8α-1- oder der CD8α-2-Untereinheit trat. Schließlich wurde gefolgert, daß die β-Kette an Stelle der CD8α-2-Untereinheit trat. Ferner war es ihnen möglich, Aussagen über funktionell wichtige Bindungsstellen in der β-Kette zu treffen. Zu diesen zählten ihrer Meinung nach die beiden Aminosäuren Asparagin (N) 28 und Arginin (R) 30 in der CDR1-ähnlichen Schleife, die mit Asparagin 223 und 227 in der α3-Domäne des MHC Klasse I interagiert haben, sowie Lysin (K) 56 in der CDR2-ähnlichen Schleife des CD8β-Polypeptids, das mit Glutamat 198 der α3-Domäne des MHC Klasse I interagiert hat.
In unserer Studie sollte demonstriert werden, dass auch im Falle von CD8ββ MHC Klasse I als korrespondierender Ligand fungiert hat.
Gleichzeitig sollte die Bedeutung der drei genannten Aminosäuren Asparagin 28, Arginin 30 und Lysin 56 der β-Kette auf ihre Bedeutung in Bezug auf die Interaktion mit MHC Klasse I in einem Adhäsions-Assay überprüft und mit der Bindungsaktivität von
CD8-wt-Korezeptoren verglichen werden. Die drei genannten Aminosäuren funktionell näher zu betrachten, gestaltete sich jedoch als nicht ohne weiteres möglich, da sie jeweils einzeln als Mutation stabil in Form eines CD8ββ-Homodimers an der Zelloberfläche exprimiert werden mussten, um funktionelle Test zu ermöglichen. Eine Untersuchung der Mutationen in der β-Kette in einem CD8αβ-Heterodimers hätten nicht ausgewertet werden können, da die α-β-Kette des Heterodimers die Bindungsfunktion des Korezeptors maßgeblich beeinflusst hätte.
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Von Potthast et al. (33) wurden drei verschiedene CD8β-Konstrukte zur Verfügung gestellt, in denen jeweils eine der drei AS N28, R30 oder K56 gegen Alanin ausgetauscht worden waren.
Um das Problem einer zu geringen Oberflächen-Expression zu umgehen, wurden besagte Aminosäure-Mutationen in einem stabil exprimierten von Potthast et al. (33) zur Verfügung gestellten CD8βaaa-Konstrukt untersucht.
Die drei zu untersuchenden AS N28, R30 und K56 lagen alle in der Ig-Domäne der β-Kette, die auch durch den CD8β-Antikörper 5F2 erkannt wurde. Die hohe Expression des CD8βααα-Konstrukts als Homodimer ohne Verbindung zur α-wt-Kette erklärte sich dadurch, dass die von Potthast et al. (33) beschriebende inhibierende TM- und cytoplasmatischen Domänen der CD8β-Kette nicht vorhanden waren. Von Devine et al. (23) war beschrieben worden, dass die humane β-Ig-Domäne für die CD8β-Expression von Bedeutung gewesen ist, was mit unseren Untersuchungen konform gegangen ist, da das verwendete CD8βααα-Konstrukt eben diese Domäne beinhaltet hat.
Da eine zusätzliche Expression von CD8α auf den CD8βααα-exprimierenden Transfektanten TA28 (CD8βN28Aααα), TA30 (CD8βR30Aααα) und TA56 (CD8βK56Aααα) in der FACS-Analyse ausgeschlossen wurde, konnten Veränderungen des Bindungsverhaltens durch Mutationen der drei AS N28, R30 und K56 im βααα-Konstrukt auf das CD8ββ-Homodimer übertragen werden.
Ziel der Studie ist es nun gewesen, diese drei Transfektanten in einem Adhäsions-Assay mit MHC Klasse I-tragenden MCF-7-Fibroblasten interagieren zu lassen. Da Gao et al. (8) in ihrer Kristallisationsstudie gezeigt hatten, dass die für die Bindung zwischen CD8β und MHC Klasse I wichtigen Positionen im Falle der CD8β-Kette alle im Bereich der Ig-Domäne lagen, könnte man wiederum die Ergebnisse der CD8βααα-tragenden Zellen auch auf das CD8ββ-Homodimer übertragen.
Devine et al. (23) gelang es trotz hoher CD8ββ-Expression auf COS-7-Zellen nicht, eine Interaktion mit MHC in Abwesenheit der α-Kette nachzuweisen, was unseren Ergebnissen widersprach. Auch Wheeler et al. (34) konnten die Bindung von CD8β in Abwesentheit der α-Kette an MHC Klasse I funktionell zeigen. Sie verwendeten in ihrer Studie Transfektanten, die ein CD8ββαα- Konstrukt exprimierten und verglichen dessen Aktivierung und IL-2-Produktion durch MHC Klasse I-vermittelte Stimulation. Dieses CD8ββαα -Konstrukt beinhaltete die extrazellulären Anteile, d.h. Verbindungsregion und Ig-Domäne, der β-Kette mit der Transmembran- und zytoplasmatischen Domäne der α-Kette. In einem funktionalen Assay konnte auch im Falle der genannten MHC Klasse I-restriktiven
CD8ββαα-T-Zell-87
Transfektanten nach Stimulation mittels MHC Klasse I eine Zunahme der IL-2-Produktion gemessen werden, obwohl die Transfektanten nicht die extrazellulären Domänen des α-Peptids exprimierten. Dieses Ergebnis machte daher die mögliche Interaktion zwischen CD8β und MHC Klasse I deutlich.
In einem Assay konnte auch in unserer Studie klar die Adhäsion von CD8βααα-exprimierenden Jurkat-Zellen an MHC Klasse I-tragende MCF-7-Fibroblasten gezeigt werden. Da das verwendete Konstrukt nur die Ig-Domäne der CD8β-Kette getragen hat, könnte es den Anschein haben, dass deswegen im Gegensatz zu Devine et al. (23) eine Interaktion mit MHC Klasse I gezeigt werden konnte. Dieser Einwand wurde jedoch durch die Studie von Gao et al. (8) wieder entkräftet, in der beschrieben wurde, dass die für die Bindung mit MHC Klasse I wichtigen Positionen der CD8β-Kette bereits alle in der β-Ig-Domäne zu liegen schienen.
Die zu beobachtende Bindung lag im Falle von CD8βααα-wt-tragenden Transfektanten deutlich über einer basalen, niedrigen Bindung von CD8-negativen Zellen. Diese basale Adhäsion lässt vermuten, dass auch unabhängig von CD8 eine niedrige schwache
Bindungsaktivität möglich zu sein scheint. Dies widerspricht jedoch nicht den Errgebnissen unserer Studie, da wie schon beschrieben, der CD8-Korezeptor die Interaktion zwischen TCR und MHC Klasse I verstärkte. Fiel der verstärkende Effekt in Form des CD8 weg, so blieb die schwache Bindung der beiden übrigen Komponenten zurück.
Im Falle der drei Transfektanten TA28 (CD8βN28Aααα), TA30 (CD8βR30Aααα) und TA56 (CD8βK56Aααα) ließ sich jeweils eine Bindungsaktivität beobachten, die in etwa zwischen der von CD8-negativen und CD8α-wt- und CD8βααα-exprimierenden Zellen lag. Die Ergebnisse des Assays haben gezeigt, dass eine Mutation an jeder der drei untersuchten Positionen eine signifikante Reduktion der Bindung des CD8β-Korezeptors zur Folge hat.
Allerdings lag diese verringerte Bindungsaktivität immer noch deutlich über der von CD8-negativen Zellen, was wahrscheinlich macht, das eine einzelne Mutation der funktionell wichtigen Positionen nicht die gesamte Funktionalität des Rezeptors zerstören kann.
Möglicherweise ließe sich die funktionelle Bindung noch stärker vermindern, wenn man nicht nur eine sondern zwei oder alle drei der AS-Positionen N28, R30 und K56 in einem
CD8βααα-Konstrukt gegen Alanin austauschte.
Die MHC Klasse I-Spezifität des durchgeführten Adhäsions-Assays konnte in einem
Kontrollversuch mit Anti-MHC Klasse I-Antikörper bewiesen werden. Nach Inkubation der MHC Klasse I-exprimierenden MCF-7-Zellen mit dem Anti-MHC Klasse I-Antikörper W6/32, konnte die zuvor hohe Bindungsaktivität der CD8α-wt- und
CD8βααα-wt-88
exprimierenden Zelllinien signifikant in Richtung des Niveaus der CD8-negativen Zellen reduziert werden.
Nach der Beschreibung von CD8β ohne Assoziation zur α-Kette und der Identifikation von MHC Klasse I als funktionellen Liganden von CD8ββ bleibt es schlussendlich zu klären, warum bisher CD8ββ auf den primär CD8-exprimierenden T-Lymphozyten nicht
nachzuweisen ist oder besser gesagt, warum es auf ihnen nicht exprimiert wird. Da CD8β als Teil des CD8αβ-Heterodimers auf T-Zellen exprimiert wird und somit auch die genetische Vorraussetzung für ein CD8β-Homodimer gegeben wäre und weil CD8β auf B-Zellen als Dimer exprimiert wird, erachten wir es für sehr wahrscheinlich, dass es gute Gründe für diese Nicht-Expression des β-Homodimers auf T-Zellen in vivo zu geben scheint.
Wheeler et al. (10) beschrieben in ihrer Studie über die Interaktion zwischen CD8β und MHC Klasse I, dass der Korezeptor CD8αβ eine viel höhere Avidität, welche die
Gesamtbindungsstärke zwischen Rezeptor und Antigen beschreibt, besaß als der CD8αα-Rezeptor.
Witte et al. (27) zeigten in einer Aktivierungsstudie, dass CD8αβ ein 100fach effizienterer Korezeptor in der Erkennung von niedrigen Peptidkonzentrationen war, als das CD8αα-Homodimer.
Allerdings beschrieben Sun et al. (35) dass CD8αβ keine stärkere Zell-Zell-Adhäsion bewirkte als CD8αα. Auch wir haben in unserer Studie die Bindungsaktivität von CD8α und CD8βααα verglichen und konnten keine gesteigerte Bindung im Falle des
CD8βααα-Konstrukts beobachten.
Renard et al. (36) zeigten in ihrer Untersuchung, dass die β-Kette des CD8αβ-Heterodimers die Avidität zwischen TCR und MHC Klasse I im Gegensatz zum CD8αα um das fünf- bis zwanzigfache erhöhte. Diesen Erkenntnissen nach könnte das reine CD8β als Homodimer diese Bindungsstärke zwischen Rezeptor und Ligand in noch höherem Maße steigern und damit eine immune Überreaktion des auf ein Antigen reagierenden Organismus provozieren.
Möglicherweise hätte dies eine massive Entzündungsreaktion zur Folge, bei der eine physiologische Abwehrreakton in Bezug auf den infizierten Organismus nicht mehr
gewährleistet wäre und bei der es zu einer Selbstschädigung käme. Der Schutz vor einer zu hohen Immunreaktion könnte somit einen denkbaren Grund dafür darstellen, warum die Expression von CD8ββ auf humanen T-Zellen in vivo inhibiert wird. Weiter könnte eine zu hohe Effizienz des CD8ββ-Korezeptors auf schon sehr geringe Peptidmengen eine
Unverhältnismäßigkeit zwischen infizierendem Antigen und korrespondierender
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Immunantwort zur Folge haben, bei der schon geringe Antigen-Mengen eine zu hohe
Immunreaktion nach sich zögen. Eventuell könnte eine übermäßig hohe IL-2-Produktion der Grund dafür sein, warum CD8ββ nicht auf T-Zellen exprimiert wird, da diese unter anderem nach CD8-Aktivierung IL-2 stimulieren.Wheeler et al. (34) konnten zeigen, dass CD8αβ-exprimierende T-Zellen signifikant mehr IL-2 produzierten als solche, die nur das CD8αα-Homodimer exprimierten. Da wie beschrieben CD8αβ ein vielfach effektiverer Rezeptor als CD8αα darstellt, könnte also auch die reaktive IL-2-Sezernierung im Falle des
ββ-Homodimers dementsprechend noch stärker ausfallen. Da IL-2 nicht von B-Lymphozyten produziert wird, wäre dies eine mögliche Erklärung dafür, warum das physiologische Vorkommen von CD8ββ in vivo auf humanen B-Lymphozyten nicht inhibiert wird. Eine zu hohe IL-2-Synthese wäre somit durch den effizienten CD8ββ-Korezeptor nicht zu erwarten.
Möglicherweise ist die hohe Effizienz der Erkennung von niedrigen Peptidkonzentrationen im Falle der B-Lymphozyten ein Vorteil für den Organismus, da schon geringe Peptidmengen zu einer spezifischen Antikörper-Synthese führten, welche das infizierende Protein unschädlich machten und eine starke beanspruchende Immunreaktion des Organismus damit verhinderten.
Bisher bleibt es jedoch spekulativ, welche Folgen eine CD8ββ-Expression auf T-Zellen auf den Organismus hätte und ob sich dieser in negativer oder eventuell doch positiver Weise auf die Immunreaktion auswirkte. Das Vorliegen von CD8β als Homodimer auf B-Lymphozyten könnte deswegen trotzdem einen physiologischen Charakter haben, da sich bekanntermaßen T- und B-Zellen maßgeblich hinsichtlich ihrer Funktion unterscheiden. Wahrscheinlich sorgen bisher unentdeckte Mechanismen dafür, dass CD8β seinen für den Organimus und dessen Immunsystem positiven Effekt auf B-Zellen entfalten kann. Ziel zukünftiger Studien könnte es sein, diese Regulation näher zu betrachten.