Das erste Ziel der Studie ist es gewesen, zu untersuchen, ob CD8β ohne Assoziation zur α-Kette auf humanen Zellen exprimiert wird.
Bei unserem Projekt konnte bei der Untersuchung von PBL bei allen Probanden CD8β-Expression ohne Verbindung zur CD8α-Kette nachgewiesen werden, und zwar als
CD8ββ−Homodimer auf B- Lymphozyten. Bisher konnte der CD8-Korezeptor in vivo nur als CD8αα-Homo- oder CD8αβ-Heterodimer auf T-Lymphozyten nachgewiesen werden, eine Expression hingegen von CD8β in vivo allein ist noch nicht beschrieben worden.
Devine et al. (23) hatten die CD8β-Expression ebenfalls untersucht und konnten zeigen, dass CD8β ohne das α-Polypeptid in vitro auf COS-7-Zellen und murinen Lymphozyten exprimiert wurde. Sie widerlegten vorherige Studien, in denen CD8β nicht allein exprimiert werden konnte. In ihrer Studie wurden humane und murine CD8-Ketten einzeln und in Kombination innerhalb einer Spezies in COS-7-Zellen transfiziert. Im Unterschied zur murinen CD8β-Kette wurde das humane CD8β-Peptid als Homodimer auf der Zelloberfläche exprimiert. Für die präzisere Untersuchung, welche der vier Domänen für diesen Verlust der Expression verantwortlich sein könnte, wurde die murine β-Ig-Domäne gegen die humane β-Ig-Domäne und ungekehrt die humane gegen die murine β-Ig-Domäne ausgetauscht. Das Konstrukt, das die murine β-Ig-Domäne enthielt, konnte nicht von dem gegen die β-Kette gerichteten Antikörper auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Die für humanes CD8β transgene Maus exprimierte auf ihren PBL ein mCD8α/hCD8β-Heterodimer sowie hCD8β ohne mCD8α. Weiterhin konnten unter den PBL dieser Tiere eine geringe Anzahl von mCD4/hCD8β-doppeltpositiver Lymphozyten nachgewiesen werden. Es wurde geschlussfolgert, dass die murine CD8β-Ig-Domäne die Expression von
CD8ββ-82
Homodimeren inhibiert hat, weswegen nur die humane Variante auf besagten COS-7-Zellen als ββ-Homodimer gezeigt werden konnte.
Im Gegensatz dazu entdeckten Wheeler et al. (10) , dass die murine CD8β-Kette auf einer Maus-Hybridoma-Linie exprimiert worden ist, wenn die TM- und die cytoplasmatische Domäne der β-Kette gegen die jeweiligen Domänen der α-Kette getauscht wurden. Sie führten die fehlende CD8ββ-Heterodimer-Expression also nicht auf die murine β-Ig-Domäne zurück. Weiterhin ergab die Untersuchung dieses Konstrukts auf seine Korezeptorfunktion hin, dass dieses Dimer funktionell als Korezeptor des TCRs aktiv war.
Hennecke et al. (24) transfizierten COS-1-Zellen transient mit murinem CD8α, CD8α mit CD8β und CD8β einzeln. Sie konnten keine Oberflächenexpression des murinen CD8β als Monomer oder Dimer nachweisen. Den Einfluss der einzelnen Domänen der beiden CD8-Ketten auf die Expression untersuchten sie durch mehrere Konstrukte, in denen gezielt die CD8α-Ekto-, -Transmembran- oder –cytoplasmatische Domäne gegen Tac (α-Kette des IL-2-Rezeptors) oder CD8β ausgetauscht wurden. Sie kamen zu dem Schluss, dass die funktionelle Bedeutung der β-TM-Domäne wahrscheinlich in der Retention von CD8β-Monomeren
gelegen hat. Ferner zeigten sie, dass die Funktion der α-TM-Domäne in der Dimerisierung der CD8-Monomere gelegen hat und dass die CD8α-Ekto-Domäne für den Transport der Dimere aus dem Endoplasmatischen Retikulum notwendig gewesen ist. Die Dimerisierung des
CD8αβ hat die Retention von β-Monomeren durch die β-TM-Domäne aufgehoben und danach den Transport zum Golgi-Apparat ermöglicht. In unserer Untersuchung, ist allerdings sichtbar geworden, dass auch das CD8β-Oberflächenantigen auf B-Zellen als ββ-Homodimer
exprimiert worden ist. Im Falle der B-Lymphozyten muss deshalb auch ohne die α-TM-Domäne eine Dimerisierung zustande kommen, deren Produkt stabil exprimiert wird.
Expressionsdaten von Potthast et al. (33) (Daten unveröffentlicht) zeigten, dass die TM- und die cytoplasmatische Domänen der CD8β-Kette einen additiv inhibierenden Effekt auf die Expression der CD8β-Kette gehabt haben. Potthast et al. (33) (Daten unveröffentlicht) zeigten in einer Studie über die Interaktion des humanen CD8 mit MHC Klasse I und CD3/TCR, dass die fehlende Expression eines CD8ββ-Homodimers auf T-Lymphozyten auf die inhibitierende Wirkung des „connecting peptide“, der TM- und der cytoplasmatischen Domäne der CD8β-Kette zurückzuführen sein sollte, die einen additiven Effekt aufwiesen. Darüberhinaus sollte die Anwesenheit der CD8α-Kette für die Dimerisierung von CD8β-Monomeren notwendig sein, wobei an jener Dimerisierung die α-TM- nicht aber die β-TM-Domäne beteiligt zu sein schien. Aufgabe der β-TM-Domäne schien im Gegensatz dazu die Retention von CD8β-Monomeren im ER zu sein.
83
Diese inhibitorischen Mechanismen wurden hier allerdings in der Jurkat-T-Zelllinie untersucht, möglicherweise werden die inhibitorischen Peptid-Domänen in B-Zellen daran gehindert, ihren restriktiven Effekt zu entfalten.
Der Grund dafür, dass die Expression von CD8ββ bisher noch nicht in vivo entdeckt worden ist, mag der verwendete Antikörper sein. Der meist verwendete Antikörper zur Erkennung der CD8β-Expression ist der 2ST8.5H7-Antikörper, der CD8β zwar erkennt, aber nur in
Assoziation mit der α-Kette. Der 5F2-Antikörper, der das β-Polypeptid allein erkennt, wurde erst später generiert und wird nur selten verwendet. Aus diesem Grund ist ersichtlich, warum die CD8β-Expression auf humanen B-Zellen noch nicht beschrieben worden ist, denn
CD20++CD8+B-Zellen lassen sich nicht mit einem Antikörper gegen CD8αβ markieren.
Wie in vorherigen Studien beschrieben, konnte allerdings auch im Rahmen unserer Studie auf humanen T-Zellen keine Expression von CD8β ohne Verbindung zum α-Peptid
nachgewiesen werden.
In einer Immunopräzipitation von CD8β auf EBV-transformierten B-Zellen, in der die Frage geklärt werden sollte, ob CD8β als Mono- oder Dimer vorlag, zeigten sich in unserer Studie Banden, die das Vorliegen als β-Homodimer sehr wahrscheinlich machen. In diesem Rahmen konnten mit 5F2-Antikörper gegen CD8β Banden von 25 kDa unter reduzierten und von 45 kDa Größe unter nicht-reduzierten Konditionen präzipitiert werden. Unter reduzierenden Versuchsbedingungen werden Disulfidbrücken gespalten, die ein mögliches Dimer verbinden.
Demzufolge ist es anzunehmen, dass die 45 kDa-Bande, deren Ausgangsprodukt auf der Zelloberfläche exprimiert wird, das CD8β-Homodimer darstellt, das durch Reduktion in seine halb so großen Monomere gespalten wird.
Devine et al. (23) führten in ihrer Studie ebenfalls eine Immunpräzipitation von CD8β auf COS-7-Zellen mit Anti-CD8β-Antikörper durch und waren auf vergleichbare Resultate gestoßen. Sie präzipitierten Banden von 25 und 30 sowie von 50 und 60 kDa Größe, dabei gingen sie davon aus, dass es sich bei den kleineren Banden unter reduzierten Bedingungen jeweils um die Monomer-Form des Ausgangs-Antigens handelte, dass folglich in Gestalt eines Dimers vermutet wurde. Die unterschiedlichen zwei großen und zwei kleinen Banden erklärten sie dadurch, dass die 25 und 50 kDa-Banden die jeweils nicht-glycosylierte Form der 30 und 60 kDa-Banden darstellten.
DiSanto et al. (32) zeigten in ihrer Immunopräzipitation von CD8β auf murinen Fibroblasten mit 5F2-Antikörper zwei Banden von 24 und 30 kDa Größe, dabei vermuteten sie in der 30 kDa-Bande das fertige monomere Peptid und in der kleineren 24 kDa-Bande ein Vorstufen-Protein.
84
Insgesamt gehen diese beiden Ergebnisse mit unseren Ergebnissen konform, da in der Größe vergleichbare Banden gezeigt werden konnten, wenngleich ohne die von Devine et al. (23) beschriebenen glycosylierten Formen. Möglicherweise entstand auch im Falle von DiSanto et al. (32) die größere Bande von 30 kDa durch eine Glycosylierung, so dass doch die 24 kDa-Bande das monomere fertige β-Polypeptid darstellen könnte.
Möglicherweise finden diese Glycosylierungsprozesse im Rahmen der CD8β-Expression auf B-Zellen nicht statt, so dass nur die nicht-glycosylierte Form präzipitiert werden konnte.
Die bisherigen Studien beziehen sich verständlicherweise nicht auf eine Präzipitation von CD8β auf B-Zellen, da diese vorher nicht beschrieben worden ist. Ausserdem eignen sich zum Beispiel T-Lymphozyten-Linien in viel größerem Maße für Präzipitationen, weil man die das gesuchte Antigen-exprimierenden Zellen erst in ausreichendem Maße kultivieren muss, um erfolgreich präzipitierte Banden deutlich darstellen zu können. Im Gegensatz zu T-Zellen lassen sich B-Zellen unter normalen Bedingungen nicht kultivieren, eine Ausnahme bilden Epstein-Barr-Virus-transformierte B-Zellen, die in unserem Fall für die Immunpräzipitation verwendet wurden.
Bisher bleibt es Spekulation, warum die singuläre Expression von CD8β in Form eines Homodimers auf B-Lymphozyten in vivo möglich ist, diese Expression auf T-Lymphozyten aber durch verschiedene Mechanismen inhibiert zu werden scheint. Sicher ist, dass die auf T-Zellen gezeigte Beeinflussung der CD8β-Expression durch die α-TM- und cytoplasmatische Domäne auf B-Zellen keine Rolle spielt, da wir zeigen konnten, dass CD8α nicht auf ihnen exprimiert wurde. Eine Dimerisierung und stabile Expression auf der Zelloberfläche muss also auch ohne diese α-Domänen möglich sein. Auch die beobachtete Zurückhaltung von CD8β-Dimeren im ER scheint im Falle von B-Lymphozyten nicht stattzufinden oder inhibiert zu werden. Welche Mechanismen die Ausschleusung der β-Homodimere möglich machen, bleibt bis auf weiteres unklar und wäre eine zukünftig zu klärende Fragestellung. Diese könnten zum Beispiel in Form von restriktiven Gen-Regionen oder Zytokinen vorliegen.
Anschließend wäre dann zu untersuchen, ob diese Mechanismen in T-Zellen nicht existent seien oder ob sie wiederum durch andere Einflüsse inhibiert würden. Spekulativ wäre dann auch, ob es vielleicht gelingen würde, diese möglichen inhibierenden Effekte in T-Zellen zu eliminieren und dann folglich auch auf ihnen eine stabile CD8β-Expression, die von der Assoziation zur α-Kette unabhängig wäre, zeigen zu können. Unklar wäre dann, ob dieses nicht länger inhibierte CD8β die Exprimierung der α-Kette beeinflussen würde und welchen Effekt das Tragen von dimerisiertem CD8β auf der Zelloberfläche auf die Zellfunktion haben könnte.
85
4.2 Interaktion von CD8ββ mit MHC Klasse I und deren Beeinflussung durch die