Nach der Identifizierung von CD8β als Homodimer auf humanen B-Lymphozyten ohne Assoziation zur α-Kette bleibt zu klären, welche Funktion das vorher nicht beschriebene CD8ββ-Oberflächenantigen ausübt.
Im Falle von CD8 generell wurde von Blue et al. (37) beschrieben, dass CD8 direkten Einfluss auf die Regulation der T-Zell-Aktivierung hätte, dies wäre im wesentlichen auch für B-Zellen denkbar. Bleibt allerdings zu klären, wie diese Regulation aussehen sollte.
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Kerry et al. (38) zeigten in ihrer Studie, dass die Aktivierung über CD8 im Falle von CD8+Gedächtnis-T-Zellen zu intrazellulären Ca++-Mobilisierung und Zell-Proliferation führte. In unserer Studie konnten diese Einflüsse des CD8 nicht auf das β-Homodimer auf B-Lymphozyten übertragen werden, da nach Aktivierung über den CD8ββ-Korezeptor kein Anstieg des intrazellulären Calciums ausgelöst wurde.
Ein möglicher Grund dafür, warum die zuvor nach CD8-Aktivierung bereits beschriebene Ca++-Mobilisierung oder Zell-Proliferation nicht gezeigt werden konnte, stellt eventuell die fehlende p56lck-Bindung dar. Wie von Potthast et al. (33) beschrieben, wird intrazellular die p56lck von der cytoplasmatischen α-Domäne gebunden, im Gegensatz dazu vermag dies die cytoplasmatische Domäne des β-Polypeptids nicht.
In gleicher Weise fiel die Untersuchung des Effekts von CD8ββ auf die Zell-Proliferation negativ aus. In diesem Fall wurden nicht nur die genannten EBV-transformierten CD8ββ-exprimierenden B-Zellen sondern auch PBL allgemein über CD8β stimuliert, was aber in beiden Populationen nicht zu einer verstärkt erhöhten oder verminderten Zell-Zahl führte.
Möglicherweise verstärkt und bindet CD8β auf B-Zellen den BCR in ähnlicher Weise wie auf T-Zellen den TCR. Beide Rezeptoren beinhalten strukturelle Gemeinsamkeiten. Der BCR besteht entsprechend einem Immunglobulin aus zwei Schwer- und zwei Leichtketten, die durch Disulfid-Brücken verbunden sind. Der TCR wird nach demselben Mechanismus gebildet, er ähnelt einem membrangebundenen Immunglobulin-Fab-Fragment. Interessant ist hinzukommend, dass TCR aber auch BCR mit sogenannten „rafts“ assoziiert sind. Diese
„rafts“ sind membrangebundene Mikrodomänen, die viele Sphingolipide und Cholesterol enthalten und nebenbei vermehrt kurze gesättigte Fettsäuren. Arcaro et al. (39) beschrieben in ihrer Studie, dass neben dem TCR auch CD8 in jenen „rafts“ lokalisiert war und dort zwei verschiedene Funktionen ausübte. Zum einen sollte das Ende der CD8β-Kette dafür sorgen, dass CD8 mit p56lck assoziierte, zum anderen sollte es die Assoziation von CD8 und
TCR/CD3 vermitteln. Im Gegensatz zu Potthast et al. (33) konnte hier eine Bedeutung von CD8β in Bezug auf p56lck beobachtet werden. Weiter wurde gezeigt, dass CD8 die raft-Assoziation von TCR/CD3 deutlich verstärkte und dieser raft-assoziierte TCR die Avidität gegenüber MHC Klasse I merklich steigerte. Cherukuri et al. (40) beschrieben diese „rafts“
auch im Falle von B-Lymphozyten. Mielenz et al. (41) zeigten, dass auch der BCR mit jenen membrangebundenen „rafts“ assoziiert war und dass diese als Plattform für eine
Signaltransduktion über den BCR fungierten. Mit diesem Wissen erscheint es gut vorstellbar, dass CD8β auch auf B-Zellen die Bindung zwischen BCR und Antigen auf MHC Klasse II in
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diesen speziellen Lokalisation verstärkt und die Avidität der funktionellen Bindung potenziert.
Eine weitere zu diskutierende Funktion des CD8β auf B-Zellen wäre die Möglichkeit, lösliches MHC Klasse I zu binden.Carey et al. (42) beschrieben in ihrer Studie, dass CD8-exprimierende T-Zellen in vivo durch lösliche MHC Klasse I/IgG-Komplexe aktiviert wurden. Es wäre also denkbar, dass B-Zellen durch die Expression von CD8 in Form des β-Homodimers mit löslichem MHC Klasse I interagieren könnten und dadurch aktiviert werden würden.
In unterschiedlichen Studien konnte gezeigt werden, dass lösliches MHC Klasse I in Entzündungsreaktionen vermehrt synthetisiert wird. Gombold et al. (43) demonstrierten in einem Mausmodell, dass lösliches MHC Klasse I bei einer Virushepatitis vermehrt gebildet wird. Van Dorp et al. (44) konnten bei einer humanen Zytomegalie-Virus-Infektion einen Anstieg des beschriebenen löslichen Rezeptors nachweisen. Möglicherweise könnte dieses ungebundene MHC Klasse I, welches bei entzündlichen Geschehen vermehrt im Blut
zirkulierte, vom CD8β-Homodimer auf B-Lymphozyten gebunden werden und diese in ihrer Aktivität stimulieren. Somit würde die Immunantwort der B-Zellen bei einer Infektion Regulation durch direkte Antigen-Präsentation sondern auch durch die Stimulation durch erhöhtes MHC Klasse I gesteigert.
Auch nach unseren funktionellen Ansätzen bleibt der exakte Mechanismus, den CD8ββ-exprimierende B-Lymphozyten im menschlichen Organismus bewerkstelligen, bis auf weiteres unklar und wird zur Klärung in Zukunft weitere Studien nötig machen.
Bleibt der funktionelle Aspekt der Expression von CD8β auf B-Lymphozyten Ausgangspunkt für zukünftige wissenschaftliche Fragestellungen, so ist hingegen die Tatsache der Expression an sich durch unsere Studie eindeutig bewiesen. Durch unsere Expressionsdaten müssen zuvor geläufige Einteilungen der Lymphozyten neu überdacht werden. Galt in den letzten Jahren das CD8-Molekül als sicherer Marker, um B-Lymphozyten von T- und NK-Zellen zu differenzieren, so wird diese Erkenntnis durch unsere Studie widerlegt. Vielmehr kann CD8 also als Oberflächenmarker verstanden werden, der auf allen Spezies von Lymphozyten exprimiert wird. Lediglich die Ausprägung von CD8 ist hier von Zelltyp zu Zelltyp
verschieden, da wie beschrieben auf B-Zellen nur das β-Homodimer nachgewiesen werden konnte.
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5 Zusammenfassung
Der CD8-Korezeptor ist ein Oberflächenantigen, das aus zwei durch Disulfid-Brücken verbundenen Polypeptidketten besteht. Jene Peptidketten existieren in zwei Varianten, der α- und β-Form. Bisher wurden humane CD8-Dimere in vivo als Homodimere aus zwei α-Ketten oder Heterodimere aus einer α- und einer β-Kette beschrieben. CD8αα-Rezeptoren werden auf T- und auf NK-Zellen, CD8αβ-Rezeptoren hingegen nur auf T-Lymphozyten exprimiert. Eine alleinige Expression von CD8β ohne Assoziation zum α-Peptid ist bisher auf keiner
Zellpopulation in vivo beschrieben worden.
Ziel dieser Studie ist es gewesen, zu klären, ob CD8β auch ohne die α-Kette in vivo exprimiert wird, und danach den Liganden des Moleküls zu identifizieren. Insbesondere haben die drei Aminosäuren Asparagin (N) 28, Arginin (R) 30 und Lysin (K) 56 der CD8β-Kette im Zentrum des Interesses gestanden, die als mögliche „residues“ für die Bindung an MHC Klasse I vorausgesagt worden sind.
PBL von gesunden Probanden wurden mit einem Antikörper gegen CD8αβ (2ST8.5H7) und einem gegen CD8β allein (5F2) durchflußzytometrisch charakterisiert. Es konnten
Lymphozyten identifiziert werden, die nur CD8β exprimierten. Diese wurden dann genauer als CD20+-B-Zellen eingeordnet. Bei allen untersuchten Probanden fanden sich solche CD8β+ CD20+-B-Zellen, wobei der relative Anteil an PBL stark variierte. Mittels einer
Immunpräzipitation des CD8β auf einer EBV-transformierten B-Zell-Linie konnte gezeigt werden, daß B-Zellen CD8β als CD8 ββ -Homodimer exprimiert haben.
Nach dem Nachweis des CD8ββ-Homodimers auf humanen B-Zellen in vivo blieb zu klären, ob für diesen neuen Oberflächenrezeptor wie für CD8αα und CD8αβ MHC Klasse I als zugehöriger Ligand fungierte. Aus einem Computermodell der Interaktion von CD8αβ mit MHC Klasse I war geschlossen worden, dass die beiden Aminosäuren Asparagin (N) 28 und Arginin (R) 30 in der CDR1-ähnlichen Schleife des CD8 β mit Asparagin 223 und 227 in der α3-Domäne des MHC Klasse I interagierten, und dass Lysin (K) 56 in der CDR2-ähnlichen Schleife des CD8β-Polypeptids mit Glutamat 198 der α3-Domäne des MHC Klasse I interagierte. Die genannten Aminosäuren des CD8β wurden jeweils durch PCR in Alanin mutiert. Da das CD8ββ-Homodimer selbst nach Transfektion nur schlecht exprimiert worden ist, wurden die Mutanten durch Restriktionsverdaus in ein CD8βααα-Konstrukt transformiert.
Dieses Konstrukt trug nur die Ig-Domäne der CD8β-Kette mit den Mutationen, aber die transmembranöse und zytoplasmatische Domäne des CD8α. Die Konstrukte konnten nach Transfektion stabil auf Jurkat-T-Zellen exprimiert werden. In einem funktionellen
Adhäsions-93
Assay wurden die drei mutierten Transfektanten TA 28 (CD8βN28Aααα), TA 30
(CD8βR30Aααα) und TA 56 (CD8βK56Aααα) mit einer CD8-negativen Jurkat-Linie, einer CD8α-exprimierenden sowie einer Linie, die das nicht mutierten Ausgangs-Konstrukt CD8βααα exprimierte, auf ihre Bindungsaktivität gegenüber MHC Klasse I-exprimierenden Fibroblasten verglichen. Die Bindungsaktivität der untersuchten Transfektanten lag in allen drei Fällen signifikant unter der von CD8α- oder CD8βααα-exprimierenden Linien.
Spekulativ bleibt allerdings die Funktion des CD8ββ-Homodimers auf B-Lymphozyten. Ein Einfluß auf den Calciumflux bzw. die Proliferation von B-Zellen wurde nicht nachgewiesen.
Überraschend bleibt dennoch die Tatsache, dass das CD8ββ-Homodimer ausgerechnet auf B-Lymphozyten nachgewiesen werden konnte, obwohl B-Zellen bisher als CD8- galten. CD8 kann folglich nicht länger als charakteristisches Oberflächenantigen angesehen werden, das B-Lymphozyten von T- und NK-Zellen unterscheidet.
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6 Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AP alkalische Phosphatase
APC antigenpräsentierende Zelle
Aqua bidest. bidestilliertes, steriles Wasser
AS Aminosäure
BCR B-Zell-Rezeptor
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
CD Cluster of differentiation
COS Affen-Nieren-Fibroblasten-Linie
CP connecting peptide
cDNA copy DNA
cyt cytoplasmatisch
DMSO Dimethylsulfoxid
dNTP Desoxyribonukleosintriphosphat
EDTA Etylendiamintetraacetat
ER endoplasmatisches Retikulum
FACS Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierer
FCS fetales Kälberserum
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FSC vorwärts-Lichtstreuung
h Stunde
HLA humaner Histokompabilitätskomplex
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
kb Kilobase
lck Tyrosinkinase p56lck
mAK monoklonaler Antikörper
MCS multiple Klonierungsstelle
MFI mediane Fluoreszenzintensität
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MHC Haupthistokompabilitätskomplex
NK Natürliche Killerzelle
PE Phycoerythrin
PBL periphere Blutlymphozyten
PBS phosphatgepufferte Salzlösung
rafts hochgeordnete Bereiche der Zellmembran, Palmitin- und Myristinsäure-reich
rpm Rotationen pro Minute
RT Raumtemperatur
R10 RPMI mit Standard-Zusätzen
SSC seitwärts-Lichtstreuung
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TCR T-Zell-Rezeptor
TM Transmembrandomäne
u unit = Einheit
UV ultraviolett
v/v Volumen/Volumen
v/w Volumen/Gewicht
w/w Gewicht/Gewicht
wt Wildtyp
x-Gal 5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid
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8 Lebenslauf
Name: Arne Eichberger
Geburtsdatum; 03.03.1979 Geburtsort: Rendsburg Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch
Schulbildung:
Grundschule Obereider Rendsburg Helene-Lange-Gymnasium Rendsburg Abitur im Juli 1998
Zivildienst:
08/1998-08/1999 Kreiskrankenhaus Rendsburg
Hochschulausbildung:
10/1999 – 05/2006 Studium der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
August/September 2001 Physikum
August 2002 Erster Teil der ärztlichen Prüfung Februar/März 2005 Zweiter Teil der ärztlichen Prüfung 05/2005 - 04/2006 Praktisches Jahr
Mai 2006 Dritter Teil der ärztlichen Prüfung Promotion:
Dezember 2002 bis Anfertigung der Doktorarbeit „Expression und Funktion von Februar 2006 CD8β auf humanen Lymphozyten-Populationen“ in der
Abteilung für Klinische Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Juli 2006 Mündliche Prüfung und Annahme der Promotion
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9 Danksagung
Bedanken möchte ich mich an dieser Stelle bei allen Menschen, die direkt oder indirekt zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein besonderer Dank gilt
Herrn PD Dr. med. Torsten Witte, meinem Doktorvater, der mich immer sehr engagiert mit viel Ruhe, Geduld, gutem Rat und nahezu grenzenlosem Optimismus unterstützt hat;
Herrn Prof. Dr. med. Reinhold E. Schmidt für die Möglichkeit, diese Arbeit in seiner Abteilung durchführen zu dürfen;
den Mitarbeitern der Klinischen Immunologie für die unbezahlbare Hilfe und guten praktischen Ratschläge, aber auch insbesondere für das angenehme Arbeitsklima; vor allem Kerstin, Margot, Roland, Sabine, Tanja, Sonja, Gerrit, Sandra, Yu-han, Baukje, Katy, Esther, Gamze, Janine, Marion, Katja und Stephi;
Herrn Dr. rer. nat. Ludwig Hoy aus der Abteilung Medizinische Biometrie für seine Hilfe bei der statistischen Datenauswertung;
Meinen Eltern Lisa und Helmut Eichberger, meinem Bruder Ingo und meinen Freunden, die mich immer ermuntert, unterstützt und an mich geglaubt haben.
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