Immunfluoreszenzmikroskopie

Die Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie sowie der Immunfluoreszenz sind im Anhang beschrieben.

Allgemeine Behandlung für die Immunfluoreszenz

Für sämtliche Arbeitsschritte wurden die Spinnenseide-Webrahmen und die Deckgläschen mit den Kontrollen aus den 6-Kavitätenplatten entnommen und in eine mit feuchten Papiertüchern ausgekleidete Kammer überbracht. Dabei wurden alle Proben jeweils auf einen Streifen Parafilm M® (Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland) gelegt, um die jeweiligen Lösungen nicht unkontrolliert zu verdünnen. Von jeder Lösung wurden jeweils 250 µl auf jede Probe pipettiert. Nach entsprechender Inkubationszeit wurden die Zellen durch Cross-linking intrazellulärer Proteine mit 4% (vol/vol) Paraformaldehyd (pH 7,4;

Sigma-Aldrich) in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Dann wurde die Zellmembran für 4 Minuten mit 0,1 % (vol/vol) Triton X-100 (Polyethylenglycol-[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl]-ether) (Sigma-Aldrich) in PBS, einem Detergens und Surfactant, permeabilisiert und anschließend unspezifische intrazelluläre Bindungsstellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 % FKS in PBS blockiert (Helenius und Simons 1975). Die primären Antikörper wurden jeweils in 1% (vol/vol) FKS in PBS entweder für 60 Minuten bei 37°C/100% Wasserdampfsättigung/5% CO₂ oder über Nacht im Kühlschrank bei 4°C aufgebracht. Nach dieser Inkubation wurden die Proben viermal für 5 Minuten in frischem PBS gewaschen, um letzte Reste der Antikörper zu entfernen.

- 41 - Im Falle des Adhäsionsassays wurde ein als Konjugat an Phalloidin gekoppeltes Fluorochrom verwendet, so dass hier der Arbeitsschritt für den primären Antikörper entfiel und direkt die Arbeitsschritte für den sekundären Antikörper durchgeführt werden konnten (Tab. 4).

Um die Belichtungszeit für die fluoreszierenden sekundären Antikörper so kurz wie möglich zu halten, wurden die Antikörper und die Waschschritte in einer Dunkelkammer durchgeführt. Nach Auftragen der sekundären Antikörper in 1 % (vol/vol) FKS in PBS und Inkubation analog dem primären Antikörper, i.e. entweder für 60 Minuten bei 37°C/100%

Wasserdampfsättigung/5% CO₂ oder über Nacht im Kühlschrank bei 4°C, wurden die Proben auch nach den sekundären Antikörpern viermal für 5 Minuten mit PBS gewaschen.

Anschließend wurden die Proben entweder mit VECTASHIELD® Mounting Medium without DAPI oder VECTASHIELD® Mounting Medium with DAPI eingebettet (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA), das auf Glycerol-gepuffertem p-Paraphenylenediamin beruht, das ein durch das „Quenching“-Phänomen (Fluoreszenzauslöschung) verursachtes Ausbleichen der Fluorochrome besser als die meisten vergleichbaren Einbettmedien verhindert (Longin et al. 1993). 4,6-di-amidino-2-phenyl-indol (DAPI) ist ein Farbstoff, der sich an Adenin-Thymin-reichen Regionen in der jeweils kleinen Furche der DNA-Helix anreichert und daher die Zellkerne anfärbt. Die Anregungswellenlänge von DAPI beträgt 358 nm, die Emissionswellenlänge 461 nm (Tab. 4).

Die Spinnenseide-Webrahmen wurden dabei in toto auf die Objektträger gelegt, wo sie durch die Adhäsionskräfte des Mounting-Mediums auch bei der inversen Mikroskopie an Ort und Stelle gehalten wurden.

Sämtliche Proben wurden mit einem inversen Epifluoreszenz-Mikroskop und der zuge-hörigen Software AxioVisionH (beide von Carl Zeiss) untersucht. Zudem wurden von sämt-lichen Proben digitale Fotografien angefertigt und mit AxioVisionH, Microsoft Paint (aus der Microsoft Office-Suite 2003; Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) oder GIMP analysiert. Mit der Software AxioVisionH konnten die Helligkeitswerte pro Kanal (d.h. Aufnahme eines Gesichtsfeldes mit einem für den jeweiligen sekundären Antikörper spezifischen Filtersatz) fotografiert werden, um dann mit Falschfarben entsprechend der Wellenlänge im Spektrum des sichtbaren Lichtes nachträglich eingefärbt zu werden.

- 42 - Bezeichnung λ_Anregung λ_Emission Bindungsstelle/Epitop Hersteller Konzentration

Calcein AM 528 nm 617 nm Zytoplasmatisches

Calcium Invitrogen 1:2000

Ethidiumbromid

Homodimer 494 nm 517 nm Nukleinsäuren Invitrogen 1:500 bzw.

1:50.000

Tabelle 4: Auflistung der verwendeten spezifischen Farbstoffe/Antikörper in Immun-fluoreszenzen; Erklärung siehe Text; λ = Wellenlänge)

- 43 - Qualitative Adhäsionsassays

Zur Feststellung der Adhäsion auf Spinnenseidefasern wurden NIH/3T3-Fibroblasten wie oben beschrieben auf den Spinnenseide-Matrizen ausgesät und anschließend für 1, 3 und 5 Tage inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden das Medium abgesaugt und die Proben bzw. die Kontrollen mit PBS gespült, welches anschließend wieder abgesaugt wurde.

Danach wurden sie wie oben beschrieben für die direkte Immunfluoreszenz vorbereitet.

Als Fluorochrom-Konjugat wurden entweder Phalloidin-Alexa488© oder Phalloidin-Ale-xa680© (beide Invitrogen) benutzt, da Phalloidin hochspezifisch an F-Actin bindet und sich mittels der Methode der Fluorochrom-Kopplung in der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen lässt (Barden et al. 1987). Im Falle von Phalloidin-Alexa680© wurde zusätzlich noch Alexa488© eingebracht, um evtl. auftretende unspezifische Bindungen sichtbar zu machen.

Die digitalen Fotografien wurden anschließend auf ihre Anfärbung mit den Fluoreszenz-farbstoffen, die Morphologie der Zellen und die Anordnung der Actin-Filamente analysiert.

Metabolische Aktivität der NIH/3T3-Fibroblasten

Um die metabolische Aktivität der Fibroblasten festzustellen, wurden Immunfluoreszenz-Aufnahmen mit Anfärbung durch einen Antikörper auf typische, von Fibroblasten pro-duzierte, endogene extrazelluläre Matrix (Kollagen I und Fibronektin) durchgeführt. Für diese Untersuchung war es sehr wichtig, die extrazelluläre Matrix mit hoher Trennschärfe von den umgebenen Spinnenseide-Fäden zu differenzieren, daher wurden hier Fluorochrome im infra-roten bzw. ultravioletten Bereich gewählt, da die Autofluoreszenz in diesen Spektren weit weniger ausgeprägt war (siehe Ergebnisse). Um Interferenzen zu vermeiden, wurden für Kollagen I und Fibronektin jeweils einzelne Ansätze verwendet.

Nach dem Aussäen der Zellen wurden die Proben für 5 und 7 Tage inkubiert und dann wie oben beschrieben für die Immunfluoreszenz vorbehandelt. Als primäre Antikörper wurden polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Kollagen I in einer Konzentration von 1:40 (gewonnen aus Kaninchen; Abcam, Cambridge, MA, USA) und Ratten-Antikörper gegen Fibronektin in einer Konzentration von 1:500 (Abcam) verwendet (Tab. 4). Als sekundäre Antikörper wurden Ziegen-Antikörper gegen das Spezies-spezifische Fc-Fragment von Kaninchen, gekoppelt mit dem Fluorochrom Alexa350© (zur Kopplung an Anti-Collagen I;

Abcam) sowie Ziegen-Antikörper gegen das Fc-Fragment von Ratten, gekoppelt mit Ale-xa680® (zur Kopplung an Anti-Fibronectin; Abcam), verwendet.

- 44 - Im Kollagen I-Ansatz wurde VECTASHIELD® Mounting Medium without DAPI verwendet, da die Emissionswellenlänge von DAPI mit der von Alexa350© interferieren würde; zur Anfärbung der Zellkerne wurde hier Ethidium-Bromid Homodimer (Invitrogen) in einer Konzentration von 1:50.000 verwendet, da die Zellmembranen bereits durch die allgemeine Behandlung für Immunfluoreszenzen (siehe oben) perforiert waren, war die Zellkernfärbung hier nicht auf tote Zellen beschränkt.

Für den Fibronektin-Ansatz konnte VECTASHIELD® Mounting Medium with DAPI verwendet werden, da das Fluorochrom des sekundären Antikörpers hier Licht im infraroten Bereich emittierte und es daher nicht zu Interferenzen kam.

Um zu prüfen, ob die starke Fluoreszenz (siehe Ergebnisse) der Spinnenseide durch unspezifische Antikörperbildung oder durch Autofluoreszenz entsteht, und zugleich eine höhere Trennschärfe zwischen Spinnenseide und extrazellulärer Matrix zu erreichen, wurden zusätzliche Ansätze hergestellt, in denen Alexa488© (Invitrogen) hinzugegeben wurde bzw.

ohne Alexa488© Fotografien mit einem 488-nm-Filter angefertigt wurden. Da durch die vorherigen Blockierungsschritte mit 2%igem FKS in PBS unspezifische Bindungsstellen blockiert wurden, färbte Alexa488© diese nicht an.

Quantiative Adhäsions-/Proliferationsassays

Um die Proliferation quantitativ zu bestimmen, wurde ein Proliferationsassay benutzt, bei dem zu verschiedenen Zeitpunkten die Zellkerne der nicht abgespülten und damit adhärenten Zellen ausgezählt wurden. Zusätzlich wurden die bestimmten Werte für native Spinnenseide (Sp) mit denen von mit dem Enzym Trypsin behandelter Spinnenseide (SpTry) verglichen.

Trypsin als Protease spaltet enzymatisch Arginin-Seitenreste in Peptiden.

Entsprechend den Herstellerangaben wurden die Spinnenseide-Matrizen für 4 h bei 37°C/100% Luftfeuchtigkeit/5% CO2 in 1 ml einer Trypsinlösung (aus dem bovinen Pankreas, 12,400 IU/mg; Sigma-Aldrich) in einer Konzentration von 1 mg/ml inkubiert. Anschließend wurden diese Proben sowie native Spinnenseide-Matrizen und Kollagen- und Fibronektin-beschichtete Deckgläschen als Kontrollen wie oben beschrieben mit NIH/3T3-Fibroblasten besiedelt und für 1, 2, 3 und 5 Tage inkubiert.

Für die Auszählung der Zellkerne wurden die Zellen anschließend für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert, die Zellmembranen für 4 Minuten mit 0,1%igen Triton X-100 in PBS/1% FKS perforiert und direkt mit VECTASHIELD®

Mounting Medium with DAPI eingebettet. Anschließend wurden in 640-facher Vergrößerung

- 45 - pro Probe jeweils 5 zentrale und 5 periphere Gesichtsfelder (fields of vision = FOV) zufällig ausgewählt, und jeweils sämtliche angefärbten ovalen Zellkerne ausgezählt. Der Wert an Tag 1 post incubationem wurde dabei als Maß für die initiale Adhäsion gewertet.