Grundlagen der verwendeten bildgebenden Verfahren
Physikalische Prinzipien der Lichtmikroskopie
Mithilfe der Lichtmikroskopie ist die Betrachtung von Objekten bzw. Details möglich, für die die Brechkraft des menschlichen Sehapparates nicht ausreicht. Die inverse Hellfeld-Durchlichtmikroskopie, bei der das Objektiv unterhalb des Objekttisches angebracht ist, ist das am meisten verbreitete optische Mikroskopierverfahren in der Zellkultur, da gegenüber der aufrechten Mikroskopie ein deutlich vergrößerter Raum zwischen Objekttisch und Beleuchtungseinheit vorhanden ist, in den sich Zellkulturschalen, Zellkulturflaschen oder Kavitätenplatten einschieben lassen. Das vom Objekt kommende Licht wird in einem solchen Durchlichtmikroskop durch eine Kombination von zwei Linsensystemen, dem Objektiv und dem Okular, optisch abgebildet, wobei durch das Objektiv ein reales Zwischenbild erzeugt wird, das dann durch das Okular wie mit einer Lupe vergrößert wird. Das Produkt aus Objek-tiv- und Okularvergrößerung entspricht der Vergrößerung des Mikroskops. Die übliche Beleuchtungsoptik, mit der eine gleichmäßige, homogene Ausleuchtung des Gesichtsfeldes möglich ist, wurde zuerst von August Köhler beschrieben und besteht aus Lichtquelle, Kollektor, Leuchtfeldblende, Aperturblende und Kondensor (Köhler 1893). Für die optimale Leistungsfähigkeit ist eine korrekte Abstimmung von Blendenabbildung und damit -öffnung und Objektabbildung nötig, ein Verfahren, welches nach seinem Erstbeschreiber auch
„Köhlern“ genannt wird (Köhler 1893).
Physikalische Prinzipien der Rasterelektronenmikroskopie
Zur Erzeugung eines Elektronenstrahles in der Rasterelektronenmikroskopie werden zunächst an der Heizkathode aus mit Bariumoxid beschichtetem Wolfram durch eine Heiz-spannung von einigen Hundert Volt Elektronen herausgelöst, die dann durch eine Beschleu-nigungsspannung von 10 kV beschleunigt, und durch elektronenoptische Linsen auf einen Strahl von 5 bis 50 nm Dicke gebündelt werden. Dieser Elektronenstrahl wird mithilfe eines Kondensators zeilenweise in einem definierten Raster auf die Probe geschossen (Ruska 1933).
Beim Auftreffen auf die Probe erzeugen diese Primärelektronen niedrigenergetische Sekun-därelektronen (SE), wobei Anzahl und Ausfallswinkel dieser SE vom Einfallswinkel und dem Material (in diesem Fall der oben beschriebenen Goldbeschichtung, siehe Punkt 2.3.2) ab-hängen (Ruska 1933, von Borries & Ruska 1935). Sie werden durch eine Saugspannung in
- 131 - Richtung eines Everhardt-Thornley-Detektors beschleunigt und erzeugen dort eine ihrer Menge proportionale Anzahl von elektrischen Impulsen, die dieser registrieren kann und ent-sprechend des örtlichen Rasters ein Bild berechnen kann (Everhardt und Thornley 1960).
Aufgrund ihrer niedrigen Energie von einigen Elektronenvolt stammen sie aus den obersten Nanometern der Oberfläche und bilden somit in sehr hoher Auflösung die Topographie des Objektes ab, wobei dem Detektor zugewandte Flächen heller erscheinen als dem Detektor abgewandte Flächen. Zudem hat diese Funktionsweise eine hervorragende Tiefenschärfe.
Biologische Grundlagen der LIFE/DEAD-Färbung
Das LIFE/DEAD®-Assay (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) wurde gewählt, da sich damit vitale bzw. tote Zellen leicht und schnell anfärben lassen. Dieses Assay besteht aus einem Ethidiumbromid-Homodimer zur Anfärbung der toten Zellen und Calcein-Acetoxy-methylester (Calcein-AM) zur Anfärbung der lebendigen Zellen. Ethidiumbromid (3,8-Di-amino-5-ethyl-6-phenyl-phenantridinium-bromid) wurde ursprünglich von Browning als bakteriozides Antibiotikum gegen Trypanosomen synthetisiert, wozu es noch heute in der Tierzucht eingesetzt wird (Browning 1938). In einer Lösung ist es kaum fluoreszent, weil es seine Konformation frei ändern kann. Da es aber stabil an Nukleinsäuren bindet, kann es zum Nachweis von DNA genutzt werden, wobei bei einer Anregungswellenlänge von 528 nm unter DNA-Bindung eine Emissionswellenlänge von 617 nm, d.h. im roten Spektrum resul-tiert (Waring 1965, Le Pecq und Paoletti 1966). Da diese in vitalen eukaryoten Zellen sowohl durch die Zellmembran als auch die Zellkernmembran geschützt ist, wird sie im LIFE/DEAD®-Assay zum Nachweis von toten Zellen benutzt, bei denen die Zellmembran zerstört oder zumindest permeabel ist.
Calcein-AM (N,N'-[[3',6'-bis(acetyloxy)-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-9H]xanthene]
-4',5'-diyl]bis(methylene)]bis[N-[2-[(acetyloxy)methyoxy]-2-oxoethyl]-,bis[(acetyloxy)me-thyl]-ester), ein Fluorescein-Derivat, hingegen durchdringt die Zellmembran von vitalen eukaryoten Zellen leicht und bindet Komplexe mit Calcium (Langendorf 1958). Zudem ist es sehr gering zytotoxisch, daher wird es häufig als Farbstoff für vitale Zellen eingesetzt. Bei einer Anregungswellenlänge von 494 nm emittiert es monochromes Licht einer Wellenlänge von 517 nm, d.h. im grünen Farbspektrum.
- 132 - Aufbau des Epifluoreszenzmikroskops und physikalische Grundlagen
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Form der Auflichtmikroskopie, d.h. der Strahlengang durchläuft nicht das Objekt, sondern das Objektiv. Dies ist möglich, indem das von einer Quecksilberdampflampe erzeugte Licht rechtwinklig zum Strahlengang Objekt-Okular geführt wird und durch spezielle Filter zunächst monochrom gefiltert wird. Im Objektiv wird es dann von einem dichroitischen Spiegel, der eine spezielle Form der Interferenzfilterung darstellt, reflektiert und umgeleitet (d.h. im Mikroskop nach unten auf das Objekt). Hier wird durch das monochrome Licht eine spezielle Form der Lumineszenz erzeugt, also der Emission elektromagnetischer Strahlung durch Anregung der vorherigen Wellenlänge. Diese spezielle Form der Lumineszenz nennt sich Fluoreszenz, da bei diesem Vorgang die Emission nach Beendigung der Anregung ebenfalls endet. Das emittierte Licht hat dabei eine höhere Wellenlänge als das anregende Licht, ein Zusammenhang, der zuerst 1852 von George Stokes beschrieben wurde; die Differenz zwischen der Wellenlänge des anregenden und des emittierten Lichtes wird nach ihm auch „Stokes-Shift“ genannt (Stokes 1852). Das emittierte Licht wird im Gegensatz zum anregenden Licht durch den dichroitischen Spiegel nicht reflektiert, sodass es durch das Objektiv in das Okular einstrahlt und betrachtet oder foto-grafiert werden kann. Ggf. kann es vorher noch einen Sperrfilter durchlaufen, um eine höhere Kontrastierung zu erreichen.
Diese besondere Art der Mikroskopie, die aufgrund der Nutzung der Auflichtmikroskopie auch Epifluoreszenzmikroskopie genannt wird, wurde bereits 1904 von August Köhler in ihren theoretischen Grundlagen beschrieben (Köhler 1904). 1908 wurde das erste Epifluores-zenzmikroskop von August Köhler und Henry Siedentopf bei Carl Zeiss gebaut und in Wien vorgestellt (Masters 2008).
Prinzipien der direkten und indirekten Immunfluoreszenz
Die Immunfluoreszenz nutzt die Prinzipien der hohen Spezifität der Antigen-Antikörper-Bindung durch Koppelung eines Antikörpers mit einem Fluorochrom (Coons 1958). Dabei unterscheidet man eine direkte von einer indirekten Methode: Bei der direkten Methode ist der Antikörper direkt an das Fluorochrom gebunden und wird auf die zu untersuchende Probe gegeben (Coons und Kaplan 1950). Nach einer entsprechenden Inkubationszeit wird nicht gebundener Antikörper abgespült und die Probe anschließend mit einem passenden mono-chromen Licht zur Fluoreszenz angeregt.
- 133 - Bei der indirekten Methode wird zunächst ein primärer Antikörper auf die Probe gegeben, der an das gewünschte Antigen bindet, gefolgt von einem Waschschritt, bei dem ebenfalls nicht gebundener Antikörper abgespült wird. Anschließend wird ein Fluorochrom-gekoppel-ter Antikörper auf die Probe gegeben, der an das speziesspezifische Fc-Fragment des primären Antikörpers bindet. Nach entsprechendem Waschschritt erfolgt auch hier eine An-regung mit Licht der passenden Wellenlänge. Die indirekte Methode zeichnet sich durch eine Verstärkung der Spezifität aus, da hier die hochspezifische Antigen-Antikörper-Bindung selektierend wirkt (Coons 1958). Daher wurde in allen Immunfluoreszenzen bis auf das Adhäsionsassay die indirekte Methode verwendet.
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