Ein intravenöser Verweilkatheter (Vasofix® Braunüle®, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) wurde am Tag des jeweiligen Experiments entweder in die V. cephalica antebrachii oder die V. saphena lateralis gelegt. Die Narkoseeinleitung erfolgt in einer Narkoseeinleitungsbox, in welche 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer
19
Flussrate von 5 L/min bis zum Verlust des Aufrichtungsreflexes geleitet wurden.
Anschließend wurde die Katze aus der Box genommen und die Einleitung per Gesichtsmaske fortgesetzt. Nach Erreichen einer ausreichenden Anästhesietiefe wurde ein endotrachealer Tubus gelegt (ID 3,5 bis 4,5 je nach Tiergröße). Die Katzen wurden in rechtslaterale Körperlage verbracht und mit dem Atemkreis des Anästhesiegerätes (Dräger Trajan 808, Drägerwerk AG & Co. KGaA, Deutschland) verbunden. Die jeweilige Dauertropfinfusion (Perfusor® fm, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) wurde gestartet, und die Isofluranmenge so gewählt, dass der endexspiratorische Wert knapp über dem erwarteten 1,0 MAC der jeweiligen Gruppe lag. Es schloss sich eine initiale Equilibrationsphase von 60 Minuten an, innerhalb derer auch die weitere Instrumentierung erfolgte. Isofluran und CO2 wurden über Infrarotspektroskopie mit einem Multiparameter-Anästhesiemonitor (Datex Ohmeda Compact Monitor, GE Healthcare, USA) gemessen. Der Monitor wurde jeweils am Tag des Experiments vor Beginn des Versuchs mit einem Referenzgas (5.00 % CO2, 33.0 % N2O, 2 % Desfluran und N2 als Balancegas; QUICK CALTM Calibration gas, GE Healthcare, USA) kalibriert. SpO2 wurde ebenfalls vom selben Monitor via Pulsoximetrie gemessen. Die Atmung wurde durch mechanische Beatmung (Alphavent, Drägerwerk AG & Co. KGaA, Deutschland) konstant gehalten und eine Eukapnie, d.h. ein end-exspiratorischer CO2 von 35-45 mmHg, wurde aufrecht erhalten. Die Körpertemperatur wurde ständig über eine Ösophagussonde gemessen, und die Körpertemperatur durch Warmluftzufuhr (Bair Hugger®, Carbamed, Schweiz) und Schutzdecken im physiologischen Bereich gehalten. Der Blutdruck wurde nicht-invasiv über die Doppler-Technik gemessen. Hierbei wurde der Schallsensor kraniomedial am Metatarsus (A. metatarsalis) oder ventral am Schwanz (A. coccygea) angebracht, jeweils distal der Manometer-Manschette.
Der Narcotrend®-Monitor (Narcotrend®-Compact version 5.0, MT MonitorTechnik GmbH & Co. KG, Deutschland) wurde über drei EEG-Elektroden mit der Katze verbunden: jeweils eine Elektrode links und rechts lateral in der Temporalregion, auf mittlerer Höhe einer imaginären Linie zwischen dem lateralen Kanthus und dem Ohrgrund, sowie eine Referenzelektrode am Übergang vom Nasenrücken zur Stirn
Material und Methode
20
(TÜNSMEYER u. KRAMER 2008). Die Impedanz wurde automatisch vom Narcotrend® Monitor überprüft – bei Werten über 6 kΩ wurde die Nadelposition entsprechend angepasst.
[Abbildung 1: subkutane Narcotrend®-EEG-Elektroden am Kopf einer Katze]
Die EKG-Messungen wurden mit einem Televet 100 System (Televet® 100, Rösch &
Associates Information Engineering GmbH, Deutschland) durchgeführt. Über vier oberflächliche Elektroden wurde der Transmitter mit der Katze verbunden, die Elektroden wurden hierbei palmar bzw. plantar an den Pfoten angebracht, oder
21
ersatzweise, bei zu niedriger Signalintensität, beidseits lateral an der Brust (zwei links, zwei rechts). Der Transmitter sendete das EKG-Signal dann per Bluetooth-Technik in Echtzeit an einen Personalcomputer, über welchen per aufgespielter Software (Televet® 100 version 4.2.0, Rösch & Associates Information Engineering GmbH, Deutschland) die Messungen kontinuierlich aufgezeichnet wurden zur späteren Offline-Analyse.
Die standardisierte Schmerzstimulation wurde über einen Square Pulse Stimulator (Grass S48 Square Pulse Stimulator, Astro-Med, USA) erreicht (Einstellungen: 50V, 50Hz and 10ms). Hierfür wurden zwei Stimulationselektroden (Disposable EasyGrip Monopolar Needle Electrode 50 mm x 26 ga, Viasys Healthcare, USA) subkutan median auf Höhe des mittleren Drittels der rechten Ulna platziert, mit einem Abstand von 4-5 cm zueinander.
[Abbildung 2: Vorderpfoten mit fixierten Stimulationselektroden (blau), EKG-Elektroden (gelb und rot) und Dauertropfinfusion]
Material und Methode
22
Nach jedem Experiment wurde die Anästhesie beendet und alle Elektroden und Katheter entfernt. Es wurde eine einmalige Dosis von 0,1mg/kg Meloxicam subkutan verabreicht, um einer möglichen Entzündungs- und/oder Schmerzreaktion in der stimulierten Region vorzubeugen.
3.5 MAC
Jeweils nach Abschluss der 60-minütigen initialen Instrumentierungs- und Equilibrationsphase wurde zunächst die individuelle MAC-Bestimmung durchgeführt.
Ein publiziertes, standardisiertes Protokoll zur supramaximalen Stimulation (VALVERDE et al. 2003) wurde verwendet. Hierbei wurden, bei einer Spannung von 50V und einer Frequenz von 50 Hz, zwei Einzelstimuli à 10 ms und zwei kontinuierliche Stimuli à drei Sekunden, mit je einer Pause von fünf Sekunden, appliziert. Das Stimulationsprotokoll wurde sofort beendet, wenn vor seinem Ablauf bereits eine positive Reaktion ausgelöst wurde. Grobe Bewegungen des Kopfes, der Gliedmaßen (exklusive der stimulierten Gliedmaße) oder des Schwanzes wurden als positive Reaktion definiert, wohingegen Schlucken, Zungenbewegungen, Ohrbewegungen, Augenrollen, Versuche der Spontanatmung oder Kauen als negativ eingestuft wurden. In der Vorbereitungsphase dieser Studie hatte sich herausgestellt, dass einige Katzen zu einer zeitlich leicht verzögerten Reaktion tendieren. Daher wurde ein Zeitabschnitt von einer Minute definiert, innerhalb derer eine positive Reaktion gezeigt werden konnte. Spätere Reaktionen wurden nicht als positiv gewertet.
Nach initialer Equilibrationsphase mit und Einstellung von 1.0 MAC wurde die erste Stimulation durchgeführt. Bei positiver Reaktion wurde der ETISO um 0,2 Vol%
erhöht, bei einer negativen Reaktion um den gleichen Wert erniedrigt („bracketing method“) (SONNER 2002). Jeweils nach Erreichen der neu eingestellten Isoflurankonzentration wurde eine neue Equilibrationsphase von zwanzig Minuten gewährt. Im letzten Schritt wurde die Isoflurankonzentration noch feiner eingegrenzt,
23
indem die Isoflurankonzentration nur noch 0,1 Vol% erhöht bzw. erniedrigt wurde.
Die MAC wurde als das arithmetische Mittel der Werte definiert, welche eine positive Reaktion auf die nozizeptive Stimulation gerade verhinderten bzw. zuließen.
3.6 Elektroenzephalographie
Die EEG-Messung mit dem Narcotrend® Monitor erfolgte bei jedem Experiment ab der Instrumentierungsphase kontinuierlich, mit einer sample rate von 128 sowie einer 12-bit-Auflösung. Die Filtereinstellung lag bei 0,5 bis 45 Hz, kombiniert mit einem 50-Hz-Kerbfilter. Vom gemessenen EEG-Signal wurden automatisch 2-Sekunden-Abschnitte per Fast Fourier Transformation weiterverarbeitet und die durchschnittlichen Werte von 10 folgenden 2-sekündigen Segmenten als 20-Sekunden-Epochen dargestellt. Vier Frequenzbänder wurden definiert: δ = 0,5 bis 3,5 Hz, θ = 3,5 bis 7,5 Hz, α = 7,5 bis 12,5 Hz, und β = > 12,5 Hz. Das ausgegebene EEG-Signal wurde vor der weiterführenden Analyse visuell auf Übertragungslücken und Artefakte überprüft. EMG-Aktivität und burst suppression Phasen wurden vermerkt, führten aber nicht zum Ausschluss der Daten aus der Analyse. Die Daten bzgl. der o.g. Frequenzbänder sowie die Werte von Medianfrequenz, Spektraler Eckfrequenz und des Narcotrend® Index wurden vom Narcotrend® Monitor ausgegeben und nach den Experimenten offline analysiert (NarcoWin version 1.1, MT MonitorTechnik GmbH & Co. KG, Germany). Die jeweiligen Durchschnittswerte von Epochen einer Länge von 1, 2 und 3 Minuten vor und nach Stimulation wurden analysiert.
3.7 Herzfrequenzvariabilität
Die EKG-Aufnahmen wurden sowohl während der Experimente als auch bei der anschließenden Datenaufbereitung visuell auf Artefakte und Arrhythmien überprüft.
Material und Methode
24
Die R-Zacken wurden in der Offline-Analyse automatisch von der Televet® Software erkannt. Bei Nichterkennung oder fehlerhafter Erkennung von R-Zacken erfolgte eine manuelle Korrektur. Die R-R-Intervall-Daten wurden exportiert und mit einem speziellen HRV-Programm (Kubios® RV version 2.0, Biosignal Analysis and Medical Imaging Group, Department of Physics, University of Kuopio, Finland) (TARVAINEN et al. 2008; TARVAINEN et al. 2014). weiterführend analysiert. Hierbei wurden Trendanteile sehr niedriger Frequenzen unter 0.025 Hz (very low frequency, VLF) über den smoothness prior approach entfernt. Die Datensätze mit den RR-Abständen wurden bei 4 Hz interpoliert und das RR-Power-Spektrum über ein Autoregressionsmodell bestimmt (model order: 16). Die HRV-Parameter wurden sodann, unterteilt in Zeit- und Frequenzbereich, berechnet. Im Zeitbereich war dies die mittlere Herzfrequenz (HR) und deren Standardabweichung (STD HR). Im Frequenzbereich wurden die Niedrigfrequenz (LF, 0,025-0,15 Hz) und die Hochfrequenz (HF, 0,15-0,833 Hz) berechnet (ABBOTT 2005; REY et al. 2008), sowohl in absoluten als auch in normalisierten Einheiten. Das LF/HF-Verhältnis wurde ebenfalls berechnet. Analysiert wurden drei Zeitepochen mit einer Länge von 1, 2 und 3 Minuten vor und nach Stimulation, wobei alle Poststimulations-Epochen jeweils direkt nach Stimulationsende begannen.