I NHIBIERUNG DER P OLY (ADP-R IBOSYL ) IERUNG DURCH T. GONDII

verminderte PARP-1 Expression auch zu einer reduzierten enzymatischen Aktivität in RAW 264.7 Makrophagen/Monocyten führt. Dies geschah mittels Quantifizierung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch einen Zell-ELISA und durch PARP-1 Aktivitätsnachweis auf Einzelzellebene (BAKONDI et al., 2002). Hierfür wurden RAW 264.7 Zellen mit frisch isolierten T. gondii Tachyzoiten im Parasit-Wirtszell Verhältnis von 4:1 und 8:1 infiziert. PARP-1 wurde mit steigenden Konzentrationen an Wasserstoffperoxid aktiviert und den Zellen gleichzeitig biotinyliertes NAD⁺ zur Verfügung gestellt. Die Bildung von biotinylierten ADP-Ribose Polymeren konnte anschließend mittels Peroxidase-konjugiertem Streptavidin und ortho-Phenylendiamin beim Zell-ELISA photometrisch bzw. mittels Peroxidase-Streptavidin

+ T. gondii

und Nickel-DAB auf Einzelzellebene mikroskopisch nachgewiesen werden. Durch steigende Wasserstoffperoxid-Konzentrationen nahm die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in nicht-infizierten Zellen dosisabhängig zu (Abb. 7B).

Abb. 7: Inhibierung der PARP-1 Aktivität in RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen nach Infektion mit T. gondii.

(A) Für den Nachweis der PARP-1 Aktivität auf Einzelzellebene wurden RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen auf Deckgläschen ausgesät, mit T. gondii Tachyzoiten des Stammes NTE im Parasit-Wirt-Verhältnis 8:1 infiziert oder nicht-infiziert belassen. Die Zellen wurden mit 500 µM H2O2

behandelt. Als Kontrolle wurde die H₂O₂-induzierte Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch Inkubation mit dem PARP-spezifischen Inhibitor PJ34 vermindert. Im Anschluß wurden die Zellen mit biotinyliertem NAD+

inkubiert und biotinylierte (ADP-Ribose) Polymere mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin und Nickel-DAB mikroskopisch nachgewiesen. (B) Für den Nachweis der PARP-1 Aktivität durch Zell-ELISA wurden RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen in 96-Lochplatten ausgesät, mit T. gondii Tachyzoiten des Stammes NTE im Parasit-Wirt-Verhältnis 4:1 (schwarze Dreiecke) oder 8:1 (schwarze Kreise) infiziert oder nicht-infiziert (weiße Vierecke) belassen und PARP-1 durch unterschiedliche Konzentrationen H2O2 aktiviert. Der Nachweis der biotinylierten (ADP-Ribose) Polymere erfolgte durch Meerrettichperoxidase-konjugiertes Streptavidin und ortho-Phenylendiamin und photometrische Messungen bei 490/630 nm. Die Daten entsprechen den Mittelwerten von mindestens 3 unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken stellen den Standardfehler (±) des Mittelwertes dar. Die anschließende Statistik erfolgte mittels Students t-test, (** p < 0,01 und * p <

0,05)

In T. gondii-infizierten Zellen war die H2O2-induzierte Poly(ADP-Ribosyl)ierung im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen signifikant erniedrigt (Abb. 7A und 7B).

Quantitative Analysen mittels Zell-ELISA ergaben, dass die Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach Infektion von RAW 264.7 Zellen im Parasit-Wirtszell Verhältnis von 8:1 stärker gehemmt war als in Zellen, die 4:1 infiziert worden waren (Abb. 7B).

Mit PJ34 inkubierte nicht-infizierte Zellen, die mit H2O2 behandelt worden waren, zeigten eine komplette Inhibierung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung (Abb. 7A und 7B).

Da PJ34 ein für PARP spezifischer Inhibitor ist (SORIANO et al., 2001), kann davon ausgegangen werden, dass die hier gemessene Poly(ADP-Ribosyl)ierung ausschließlich auf die Aktivität von PARP-1 zurückzuführen ist. Die Ergebnisse wurden durch einen PARP-1 Aktivitätsnachweis auf Einzelzellebene bestätigt bzw.

erweitert. In nicht-infizierten Zellen war im Zellkern nach Behandlung mit H2O2

deutlich eine ADP-Ribosylierung nachweisbar (Abb. 7A). Dies deckte sich mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenzfärbung, die PARP-1 vor allem im Zellkern nachwies (Abb. 3C). Nach Infektion mit T. gondii war die H2O2-induzierte Poly(ADP-Ribosyl)ierung in der überwiegenden Mehrzahl der Zellen deutlich vermindert, so dass auch die PARP-1-Aktivität unabhängig von einer Wirtszellinvasion durch den Parasiten inhibiert zu sein schien. Durch Inkubation nicht-infizierter Zellen mit PJ34 konnte die PARP-1 Aktivität in allen Zellen trotz vorheriger Stimulierung mit H2O2

komplett inhibiert werden (Abb. 7A).

T. gondii exprimiert verschiedene Enzyme, unter anderen eine Katalase, die den Parasiten vor dem so genannten „Oxidativen Burst“, einem Abwehrmechanismus der Wirtszelle gegenüber Pathogenen, effektiv schützt. Das T. gondii Enzym Katalase ist dabei in der Lage, von der Wirtszelle abgegebenes H2O2 zu detoxifizieren (MURRAY

et al., 1980). Aus diesem Grund wurde der Zell-ELISA auch mit Katalase-defizienten Parasiten (DING et al., 2004) durchgeführt. Dies diente zur Bestätigung, dass die Abnahme der enzymatischen Aktivität von PARP-1 nach Infektion mit T. gondii nicht durch einen Katalase-vermittelten Abbau des Wasserstoffperoxids durch den Parasiten verursacht wurde. Zunächst wurden Katalase-negative Parasiten des Stammes PRU (PRUcat^-), sowie die Katalase-positiven Parasiten des parentalen Stammes PRUhxgprt^-, auf ihren Katalase-Gehalt mittels SDS-PAGE und Western Blot überprüft. Während der parentale Stamm PRUhxgprt^- Katalase deutlich exprimierte, konnte bei PRUcat^- keine Katalase nachgewiesen werden (Abb. 8B).

Abb. 8: Das T. gondii Enzym Katalase ist nicht für die Inhibierung der enzymatischen Aktivität von PARP-1 verantwortlich

(A) RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen wurden mit dem T. gondii Stamm PRUhxgprt^- (schwarze Rauten) oder PRUcat^- (schwarze umgekehrte Dreiecke) im Parasit-Wirt-Verhältnis von 8:1 infiziert oder blieben nicht infiziert (weiße Rechtecke). Der Nachweis der biotinylierten (ADP-Ribose) Polymere erfolgte durch Meerrettichperoxidase-konjugiertes Streptavidin und ortho-Phenylendiamin photometrisch bei 490/630 nm. Die Daten entsprechen den Mittelwerten von 3 unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken stellen den Standardfehler (±) des Mittelwertes dar. (B) Zum Nachweis der Katalase-Defizienz von PRUcat^- wurde 1 x 10⁸ Tachyzoiten von Mutante und Parentalstamm (PRUhxgprt^-) lysiert, lösliche Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran übertragen. Katalase und SAG1 wurden durch entsprechende Primärantikörper und Meerrettichperoxidase-gekoppelte Sekundärantikörper durch „enhanced chemiluminescence“ sichtbar gemacht. Mr: Molekulargewichtsmarker

Dagegen konnte das Hauptoberflächenprotein von T. gondii, SAG-1, in beiden Parasiten-Stämmen gleichermaßen nachgewiesen werden (Abb. 8B). Im Zell-ELISA war die H2O2-induzierte PARP-1-Aktivität sowohl bei Zellen, die mit den Katalase-negativen PRUcat^- Parasiten infiziert worden waren, als auch bei Zellen, die mit dem parentalen Stamm PRUhxgprt^- infiziert worden waren, ähnlich stark reduziert.

Dagegen führte H2O2 in nicht-infizierten Kontrollen zu einer deutlichen PARP-Aktivität (Abb. 8A). Dies bestätigte, dass die Abnahme der enzymatischen Aktivität von PARP-1 nicht auf eine Katalase-vermittelte Detoxifizierung von H2O2 durch den

Parasiten zurück zu führen war, sondern parallel mit der Reduktion der PARP-1-Proteinlevel einherging.

3.3 T. gondii-Stämme unterschiedlicher Genotypen hemmen