Apoptose und deren Veränderung durch T. gondii in PARP-1 überexprimierenden RAW 264.7

In Zellen, di ndelt wurden, führt eine

überexprimierenden RAW 264.7 Zellen e zuvor mit einem Apoptose-Stimulus beha

Infektion mit T. gondii zu einer deutlichen Inhibierung der Apoptose sowie zu einer Abnahme des PARP-1-Proteinlevels (GOEBEL et al., 2001). Welchen Einfluss veränderte PARP-1-Level auf den Apoptose-inhibierenden Effekt von T. gondii hat, sollte mit PARP-1 überexprimierenden RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen ermittelt werden. Dazu wurde zunächst die Caspase 3/7 Aktivität als wichtiges Zeichen von apoptotischen Zellen gemessen. PARP-1 überexprimierende RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen und Wildtypzellen wurden mit Toxoplasma Tachyzoiten für 4, 11 (nicht gezeigt) oder 24 h infiziert oder blieben nicht-infiziert.

Jeweils 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurde Staurosporin, ein Apoptose-Stimulans, zu den Zellen gegeben, oder die Zellen blieben unstimuliert. Danach wurden die Zellen lysiert und im Zellextrakt die Spaltung des Caspase 3/7 spezifischen Substrates DEVD-AMC photometrisch gemessen. In nicht-infizierten Wildtypzellen nahm die Caspase 3/7 Aktivität nach Stimulierung der Apoptose mit Staurosporin sowohl nach 4 h als auch nach 24 h stark zu (Abb. 27).

Abb. 27: Zeitabhängige Inhibierung der Caspase 3/7 Aktivität in PARP-1 überexprimierenden RAW 264.7 Klonen A12, C6 und E6 und Wildtypzellen nach T. gondii-Infektion.

PARP-1 überexprimierende Klone und Wildtypzellen wurden für 4 h oder 24 h mit T. gondii Tachyzoiten im Parasit-Wirt-Verhältnis von 4:1 infiziert oder blieben nicht-infiziert. 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurden die Zellen mit 1 µM des Apoptose-Induktors Staurosporin behandelt oder blieben unstimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und in den Zelllysaten wurde die Caspase 3/7 Aktivität mittels Spaltung von DEVD-AMC photometrisch bei 380/460 nm ermittelt. Die Balken des Graphen repräsentieren die Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken den Standardfehler (±) des Mittelwerts. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen wurden mittels Student´s t-Test ermittelt (* p<0.05, ** p<0.01).

Eine Infektion mit T. gondii für 4 h hatte keinen Einfluss auf die Staurosporin-vermittelte Wirtszellapoptose in Wildtypzellen. Dagegen war die Caspase 3/7-Aktivität 24 h p.i. in infizierten Zellen signifikant niedriger als in nicht-infizierten Kontrollen (p<0.01) (Abb. 27). Interessanterweise war die Caspase 3/7-Aktivität nach Behandlung der PARP-überexprimierenden Klone A12, C6 und E6 mit Staurosporin niedriger als in Wildtypzellen. Nach Infektion der PARP-1-transfizierten Klone mit T.

gondii für 4 h war die Caspase 3/7-Aktivität gegenüber nicht-infizierten Kontrollen wie in Wildtypzellen nicht deutlich verändert.

Abb. 28: Auswirkung der PARP-1 Überexpression auf die Parasit-Wirt Interaktion in apoptotischen Zellen 4 h nach Infektion mit T. gondii.

PARP-1 überexprimierende Klone A12, C6 und E6 und Wildtypzellen wurden für 4 h mit T. gondii Tachyzoiten infiziert oder blieben nicht-infiziert. 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurden die Zellen mit 1 µM Staurosporin behandelt oder blieben unbehandelt. Mittels Höchst-Färbung wurden apoptotische Zellen anhand von kondensiertem Chromatin sichtbar gemacht.

Dagegen führte eine Infektion mit Toxoplasma für 24 h zu signifikant niedrigeren Caspase 3/7-Aktivitäten in PARP-1 überexprimierenden Zellen als in den entsprechenden nicht-infizierten Kontrollen (p<0.05). Diese Ergebnisse sprachen eindeutig dagegen, dass die Inhibierung der Expression von PARP-1 durch T. gondii den anti-apoptotischen Effekt des Parasiten vermittelte. Außerdem schien auch die PARP-1 Überexpression die durch den Parasiten verursachte Inhibierung der Apoptose nicht zu beeinflussen.

Wildtyp

Staurosporin - + + T. gondii - - +

4 h nach Infektion

A12

C6 Klon

E6

24.5 h nach Infektion

Staurosporin - + +

Wildtyp

A12

C6 Klone

E6

T. gondii - - +

Abb. 29: Auswirkung der PARP-1 Überexpression auf die Parasit-Wirt Interaktion in apoptotischen Zellen 24.5 h nach Infektion mit T. gondii.

PARP-1 überexprimierende Klone A12, C6 und E6 und Wildtypzellen wurden für 24.5 h mit T. gondii Tachyzoiten infiziert oder blieben nicht-infiziert. 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurden die Zellen mit 1 µM Staurosporin behandelt oder blieben unbehandelt. Mittels Höchst-Färbung wurden apoptotische Zellen anhand von kondensiertem Chromatin sichtbar gemacht.

Die Auswirkung der PARP-1 Überexpresssion auf Apoptose und deren Veränderung durch Toxoplasma wurde zusätzlich auf Einzelzellebene mittels Höchst-Färbung untersucht. Dafür wurden PARP-1-überexprimierende Klone und Wildtypzellen mit T.

gondii NTE Tachyzoiten für 4 h (Abb. 28), 11 h (nicht gezeigt) oder 24.5 h (Abb. 29) infiziert oder blieben nicht-infiziert. Jeweils 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurde Apoptose durch 1 µM Staurosporin induziert, oder die Zellen blieben unbehandelt.

Mittels Höchst-Farbstoff 33258 wurde die DNA angefärbt und die Proben anschließend mikroskopisch analysiert. Zur quantitativen Auswertung der Höchstfärbung wurden 500 Zellen gezählt und die Anzahl der apoptotischen Zellen anhand der Kondensation von Chromatin ermittelt (Abb. 30). In Wildtypzellen

kondensierte nach Inkubation der Zellen mit Staurosporin das Chromatin sehr deutlich (Abb. 28). Dabei wiesen 4 h p.i. sowohl infizierte, Staurosporin-behandelte als auch nicht-infizierte, behandelte Kulturen zu etwa 60% Zellen mit stark kondensiertem Chromatin auf (Abb. 30). Staurosporin führte in den PARP-1 überexprimierenden Zellen des Klones A12 zu ähnlichen Mengen von Zellen mit kondensiertem Chromatin wie in Wildtypzellen, und zwar unabhängig von einer Toxoplasma-Infektion (Abb. 28 & 30). Dagegen war in den Zellen der PARP-1 überexprimierenden Klone C6 und E6 nach Infektion mit T. gondii der Prozentsatz von Zellen mit kondensiertem Chromatin um durchschnittlich 17 bzw. 8% niedriger als in nicht-infizierten Kontrollen (Abb. 30).

T. gondii - + - + - + - + - + - + - + - + 0

20 40 60 80 100

Anzahl apoptotischer Zellen (%)

4h 24,5h Staurosporin - - + + - - + + - - + + - - + +

Wildtyp A12 Klon C6 Klon E6 Klon

Abb. 30: Auswirkung der PARP-1 Überexpression auf die Parasit-Wirt Interaktion in apoptotischen Zellen.

PARP-1 überexprimierende Klone A12, C6 und E6 und Wildtypzellen wurden für 4 h (graue Balken) und 24.5 h (weiße Balken) mit T. gondii Tachyzoiten infiziert oder blieben nicht-infiziert. 3.5 h vor Ablauf der Infektionszeit wurden die Zellen mit 1 µM Staurosporin behandelt oder blieben unbehandelt. Mittels Höchst-Färbung wurden apoptotische Zellen anhand von kondensiertem Chromatin sichtbar gemacht. Die quantitative Auswertung erfolgte durch das Auszählen von je 500 Zellen und der Bestimmung des Anteils an apoptotischen Zellen. Die Balken repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken stellen den Standardfehler (±) des Mittelwerts dar.

Nach längerer Kulturdauer (24.5 h) waren vor allem die PARP-1 überexprimierenden Zellen deutlich anfälliger gegegenüber einer Behandlung mit Staurosporin, da der Anteil von Zellen mit kondensiertem Chromatin deutlich höher war als nach 4 h Kulturdauer (Abb. 30). Zu diesem Zeitpunkt war der Anteil apoptotischer Zellen in PARP-1 überexprimierenden RAW 264.7 Zellen um etwa 20% höher als bei Wildtypzellen (Abb. 30). Eine Infektion mit T. gondii für 24.5 h führte sowohl bei Wildtypzellen als auch bei den Mutanten zur Hemmung der Staurosporin-induzierten Chromatinkondensation (Abb. 30). Dabei nahm die Anzahl der apoptotischen Zellen durch die Infektion mit T. gondii um etwa 17% - 20% ab (Abb. 29 & 30). Ähnlich führte auch in Wildtypzellen eine Infektion mit T. gondii für 24.5 h zu einer um durchschnittlich 17% verminderten Anzahl von Zellen mit kondensiertem Chromatin (Abb. 29 & 30). Grundsätzlich führte also die Überexpression von PARP-1 zu einer niedrigeren Caspase 3/7 Aktivität bzw. zu einer verminderten Apoptose-Anfälligkeit im Vergleich zu Wildtypzellen. Allerdings inhibierte T. gondii in PARP-1 überexprimierenden Zellen die Apoptose deutlich. Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass die Inhibierung der Expression von PARP-1 in infizierten Wirtszellen nicht den anti-apoptotischen Effekt von T. gondii erklären konnte. Außerdem verhinderte die Überexpression von PARP-1 in den Mutanten nicht die T. gondii-induzierte Inhibierung der Apoptose.