Apoptose in infizierten Wirtszellen

Die Apoptose stellt einen wichtigen Mechanismus in mehrzelligen Organismen während Embryogenese bzw. Homeostase dar, um funktionslose oder geschädigte Zellen des Organismus zu entfernen (HUPPERTZ et al., 1999). Dies geschieht in einer strikt regulierten Weise und verhindert entzündungsbedingte Schädigungen von umliegendem Gewebe. Auch bei Infektionen durch Pathogene spielt der programmierte Zelltod für den Wirt eine wichtige Rolle. Vom Immunsystem als infiziert erkannte Zellen können durch Apoptose eliminiert werden bevor sich die Infektion auf andere Zellen ausbreitet. Aus diesem Grund greifen viele intrazelluläre Pathogene in die Apoptoseregulation des Wirtes ein, entweder indem die Apoptose inhibiert oder induziert wird (SCHAUMBURG et al., 2006). Verschiedene Viren wie das Epstein-Barr-Virus (GREGORY et al., 1991), oder der Erreger des afrikanischen Schweinefiebers (REVILLA et al., 1997), Bakterien wie Coxiella burnetti (VOTH et al., 2007), Pseudomonas aeruginosa (ZHANG et al., 2004) oder Wolbachia (PANNEBAKKER

et al., 2007) und protozoische Parasiten wie Leishmania donovani (MOORE und MATLASHEWSKI, 1994), Theileria parva (HEUSSLER et al., 1999) und T. gondii (GOEBEL

et al., 1998; NASH et al., 1998; KELLER et al., 2006) inhibieren die Apoptose in Wirtszellen. Einige virale (TAKIZAWA et al., 1993), bakterielle (ZYCHLINSKY et al., 1992;

CHEN und ZYCHLINSKY, 1994; MULLER et al., 1996; BELYI et al., 2006) und eukaryontische (KHAN et al., 1996; VAN ZANDBERGEN et al., 2007) Pathogene induzieren dagegen die Apoptose in bestimmten Wirtszellen. T. gondii hat sowohl Mechanismen entwickelt, um die Apoptose in Wirtszellen zu inhibieren (GOEBEL et al., 1998; NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 2001; KELLER et al., 2006), als auch in bestimmten Immunzellpopulationen zu induzieren (KHAN et al., 1996; LÜDER und GROSS, 2005; SCHAUMBURG et al., 2006). Dabei bildet sich ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Replikation und Überleben von T. gondii und dem Überleben des Wirtes.

PARP-1 steht im Zusammenhang mit verschiedenen Formen des programmierten Zelltodes wie dem Apoptose-induzierenden Faktor (AIF)-abhängigen Zelltod (YU et al., 2002; YU et al., 2003), einer verstärkten Sensibilität gegenüber Endonukleasen während der frühen Phase der Apoptose (SIMBULAN-ROSENTHAL et al., 1998) und einer Anfälligkeit für verschiedene Apoptose-Induktoren (TANAKA et al., 1995b; PACINI

et al., 1999). Die Spaltung von PARP-1 durch die Caspase 3 stellt einen Regulationsmechanismus im Ablauf der Apoptose dar und wird auch als zentraler

Nachweisparameter für Apoptose verwendet (DURIEZ und SHAH, 1997). Aus diesem Grund wird die Spaltung von PARP-1 durch die Caspase 3 als wichtige Größe für den Nachweis der Inhibierung der Apoptose nach Infektion mit Pathogenen verwendet (GOEBEL et al., 2001; ZHANG et al., 2004; KIM et al., 2007; VOTH et al., 2007). Dabei zeigt sich in mit Coxiella burnetti (VOTH et al., 2007) bzw. T. gondii (GOEBEL et al., 2001; KIM et al., 2007) infizierten Wirtszellen eine reduzierte Spaltung von PARP-1 nach Apoptose-Induktion mit Staurosporin bzw. Actinomycin-D.

Gleichzeitig ist die Actinomycin-induzierte Apoptose in Toxoplasma-infizierten Zellen deutlich gehemmt. Außerdem gibt es Hinweise, dass PARP-1 bei Überaktivierung ein Pro-Apoptose-Signal darstellen könnte. Bei übermäßiger Aktivierung von PARP-1 kann es zu einer kompletten Leerung der NAD⁺ Speicher und damit zu einer starken Abnahme von ATP in der Zelle kommen, dies führt letztendlich zum Zelltod (ZHANG et al., 1994; HA und SNYDER, 1999; PIEPER et al., 1999; BOULU et al., 2001; YING et al., 2005). Obwohl die genauen Zusammenhänge noch nicht geklärt sind, scheinen bei dieser Art von Zelltod der Übergang zur Permeabilität der Mitochondrien (MPA), die Freisetzung von AIF (ALANO et al., 2004; YING et al., 2005) und die Inhibierung der Glycolyse aufgrund der Depletion von ATP (YING et al., 2005) eine Rolle zu spielen.

Außerdem gibt es Vermutungen, dass diese Ereignisse in Zusammenhang mit der PARP Überaktivierung und NAD⁺ Depletion auf mindestens zwei Wegen zum Zelltod führen (YING, 2008). Daher wird aufgrund des parasiten-induzierten PARP-1-Abbaus und der Inhibierung der Apoptose durch T. gondii auf einen möglicherweise anti-apoptotischen Mechanismus geschlossen (GOEBEL et al., 2001). Ob die Inhibierung der Apoptose durch eine Infektion mit T. gondii dabei auf die Inhibierung der Expression von PARP-1 zurück zu führen ist, und ob eine Überexpression von PARP-1 diesen Effekt aufheben kann, sollte daher mit Hilfe der PARP-1 überexprimierenden RAW 264.7 Monocyten/Makrophagen geklärt werden. Die Daten der hier vorliegenden Arbeit zeigten jedoch deutlich, dass die Inhibierung der Expression von PARP-1 in infizierten Wirtszellen nicht den anti-apoptotischen Effekt durch T. gondii erklären konnte. Außerdem verhinderte eine Überexpression von PARP-1 in den Mutanten nicht die T. gondii-induzierte Inhibierung der Apoptose.

Dass die Inhibierung der Expression von PARP-1 nicht primär mit apoptotischen Abläufen in Verbindung stehen dürfte, deuteten schon frühere Untersuchungen an, in denen gezeigt wurde, dass die PARP-1-Proteinlevel durch eine Infektion mit T. gondii sowohl in apoptotischen, als auch in nicht-apoptotischen Zellen stark reduziert sind

(GOEBEL et al., 2001). Die hier dargestellten eigenen Ergebnisse bestätigten diesen Sachverhalt deutlich, da 4 h p.i. die PARP-1-Proteinlevel in Wildtypzellen stark erniedrigt waren (Abb. 3B), wohingegen T. gondii die Caspase 3/7 Aktivität zu diesem Zeitpunkt nicht beeinflusste (Abb. 27). Umgekehrt ließ die transiente Inhibierung der Expression von PARP-1 24 h p.i. stark nach, während die Caspase 3/7 Aktivität zu diesem Zeitpunkt eine starke Inhibierung durch T. gondii erfuhr.

Untermauert werden diese Daten von der Tatsache, dass T. gondii die Apoptose in mit Actinomycin-D behandelten Wirtszellen durch die Inaktivierung der Caspase 3 und die Aktivierung von NF-κB inhibiert. Dabei wird auch die Inaktivierung von PARP-1 gezeigt (KIM et al., 2006). Außerdem inhibiert T. gondii die Caspase 3 in einem zellfreien in vitro System (KELLER et al., 2006).

Auch die Voraussetzungen seitens des Parasiten zeigten, dass die PARP-1-Inhibierung nicht für die Blockade der Apoptose durch T. gondii verantwortlich war.

So konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch tote Parasiten PARP-1 inhibierten, was gegen einen aktiven Prozess sprach. Für die Inhibierung der Apoptose ist aber ein lebender Parasit unerlässlich (NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 1999).

Allerdings bestand die Möglichkeit, dass die Inhibierung der Expression von PARP-1 durch T. gondii mit einem Caspase-unabhängigen Pfad des programmierten Zelltodes in Zusammenhang stand. Es ist bekannt, dass PARP-1 die Freisetzung des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) aus den Mitochondrien auslöst und so die Apoptose induziert (YU et al., 2003; HONG et al., 2004; VAN WIJK und HAGEMAN, 2005;

AGUILAR-QUESADA et al., 2007). Allerdings konnte bisher kein Anhaltspunkt gefunden werden, dass T. gondii in die Caspase-unabhängige Apoptose eingreift. Es werden ausschließlich Interaktionen von T. gondii mit dem Caspase-abhängigen extrinsischen (VUTOVA et al., 2007; HIPPE et al., 2008) und dem intrinsischen Signalweg der Wirtszellen (GOEBEL et al., 1998; GOEBEL et al., 2001; LÜDER und GROSS, 2005; KELLER et al., 2006; SCHAUMBURG et al., 2006) nachgewiesen. Daher wäre eine Inhibierung der Expression von PARP-1 durch T. gondii in Verbindung mit der Blockierung eines Caspase-unabhängigen Pfades des programmierten Zelltodes, z.B. über einen AIF-vermittelten Weg, sehr unwahrscheinlich, muss aber in weiteren Versuchen abgeklärt werden.

Die PARP-1-Inhibierung durch T. gondii in infizierten Wirtszellen als anti-apoptotischer Mechanismus (GOEBEL et al., 2001) konnte somit von uns widerlegt

werden. Zusammenfassend kann damit festgehalten werden, dass ein Zusammenhang zwischen dem Caspase-vermittelten Weg der Apoptose und der PARP-1-Inhibierung durch T. gondii ausgeschlossen wurde. Die Möglichkeit einer Interaktion zwischen dem AIF-vermittelten Zelltod und der PARP-1-Inhibierung nach Infektion mit T. gondii konnte nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber unwahrscheinlich.