D IE PARP-1-I NHIBIERUNG NACH T. GONDII -I NFEKTION IST EIN GENERELLES P HÄNOMEN

In früheren Untersuchungen unseres Labors konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit T. gondii in HL-60 bzw. U937 Wirtszellen Auswirkungen auf die Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 hat und dass dieser Effekt nicht nur auf Wirtszellen beschränkt ist, die mit einem Apoptose Stimulans behandelt und durch die Infektion mit T. gondii vor Apoptose geschützt werden (GOEBEL et al., 2001). Zur genaueren Charakterisierung dieses Effektes wurden die Versuche nun darüber hinaus an nicht-apoptotischen Wirtszellen von T. gondii fortgesetzt. Es konnte dabei eine deutliche, wenn auch transiente, Inhibierung des PARP-1-Proteinlevels nach Infektion mit T.

gondii nachgewiesen werden. Da die Inhibierung der Expression von PARP-1 in Monocyten/Makrophagen schon innerhalb von wenigen Minuten nach der Infektion sehr stark ausgeprägt war und erst nach Stunden wieder langsam abnahm, könnte ein Zusammenhang vor allem zwischen dem veränderten PARP-1-Gehalt und der Frühphase der Parasit-Wirt-Interaktion bestehen. T. gondii beeinflusst auch NF-κB in Makrophagen während der frühen Phase der Infektion und verhindert dadurch die Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen (BUTCHER et al., 2001; SHAPIRA et al., 2002).

Daneben konnte gezeigt werden, dass die Stärke der Inhibierung der Expression von PARP-1 in deutlicher Korrelation zur Parasitenmenge, mit der die Wirtszellen infiziert worden waren, stand. Eine Dosisabhängigkeit der Modulation von zellulären Abläufen von der Parasitenmenge wird sowohl bei der Reduzierung der DNA-Fragmentierung durch Toxoplasma (GOEBEL et al., 2001), als auch bei der Inhibierung der CIITA Expression (LANG C et al., 2006) gezeigt. Sie kann dabei auch als Hinweis auf eine direkte Interaktion des Parasiten mit einer Wirtszelle gewertet werden.

Außerdem wurde durch Versuche auf Einzelzellebene deutlich, dass PARP-1 nach der Infektion mit T. gondii nicht aus dem Zellkern in andere Zellkompartimente

transportiert wurde. Dies wurde auch von den Ergebnissen der Western Blot Analysen untermauert. Vielmehr scheint es sich bei der Reduktion von PARP-1 um einen schnellen Abbau des Proteins zu handeln.

T. gondii beeinflusst im Verlauf der Apoptose nicht-infizierte Nachbarzellen von infizierten Wirtszellen (WEI et al., 2002; LÜDER und GROSS, 2005). Bei den hier durchgeführten Experimenten auf Einzelzellebene nahm T. gondii ebenfalls Einfluss auf nicht-infizierte Nachbarzellen von infizierten Zellen in Bezug auf PARP. Hierbei wurde deutlich, dass auch in parasit-negativen Zellen einer infizierten Kultur PARP-1 stark inhibiert war. Allerdings muss erwähnt werden, dass durch die Art der Durchführung der Immunfluoreszenzfärbung nicht ausgeschlossen werden kann, dass Parasiten, die nur an die Wirtszelle adhäriert aber nicht eingedrungen waren, nicht ausreichend fixiert und während der verschiedenen Waschschritte unbeabsichtigt entfernt wurden. Diese Zellen wären jedoch als parasit-negativ ausgewertet worden. Dagegen sprach aber, dass auch extrazelluläre Parasiten in den Proben deutlich zu sehen waren.

Da eine Inhibierung der Expression von PARP-1 auch in verschiedenen humanen und murinen Zelllinien beobachtet werden konnte, scheint es sich um ein generelles Phänomen bei der T. gondii-Infektion von Wirtszellen zu handeln. Allerdings waren die Stärke der Inhibierung und deren Zeitpunkt nach der Infektion abhängig vom Wirtszell-Typ und vom Ursprungsorganismus der Wirtszellen. So zeigte sich eine stärkere Inhibierung der Expression von PARP-1 bei murinen Zellen im Vergleich zu humanen Zellen. Im Vergleich von zwei murinen Zelltypen untereinander belegten die Daten dieser Arbeit, dass in Makrophagen PARP-1 nach Infektion mit T. gondii schneller und stärker inhibiert wurde als in Fibroblasten. Ähnliche Beobachtungen wurden schon früher gemacht. Bei der Infektion von Wirtszellen durch T. gondii scheint die Art der Wirtszelle Auswirkungen auf die Modulation der zellulären Prozesse durch den Parasiten zu haben. So werden deutliche Unterschiede zwischen Zellen des Immunsystems und Nicht-Immunzellen in der Reaktion auf eine T. gondii-Infektion beobachtet (MOLESTINA et al., 2003).

Ein Zusammenhang zwischen der Infektion mit Pathogenen und Auswirkungen auf PARP-1 zeigte sich bisher meist im Hinblick auf die Apoptose. So zeigt sich, dass Infektionen mit verschiedenen Viren, wie z.B. beim humanen Rhinovirus (DESZCZ et al., 2005), beim Pferde-Grippe-Virus (EIV) (LIN et al., 2002) und beim humanen Cytomegalievirus (CMV) (CHIOU et al., 2002), sowie bei Infektionen mit Bakterien, wie

Francisella tulariensis (LAI und SJOSTEDT, 2003) und Pseudomonas aeruginosa (ZHANG et al., 2004), zur Aktivierung der Caspase-Kaskade sowie der PARP-1 Spaltung und somit zur Induktion der Apoptose führen. Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise, dass PARP-1 bei verschiedenen Viren (TANAKA et al., 1995a; HA et al., 2001) und Bakterien (YELAMOS et al., 2004) eine wichtige von Apoptose unabhängige Rolle im Lebenszyklus dieser Pathogene spielt. Diese Daten belegen, dass PARP-1 eine wichtige Rolle auch bei der Entwicklung intrazellulärer Pathogene zukommt.

Neben dem Proteingehalt in der Zelle, der bei PARP-1 bei bis zu 0.5 – 5 x 10⁶ Moleküle / Nukleus liegt (DURIEZ und SHAH, 1997), spielt die enzymatische Aktivität von PARP-1 eine entscheidende Rolle. PARP-1 modifiziert viele Proteine, die wiederum auf diverse zelluläre Prozesse Einfluss haben, post-translational durch Poly(ADP-ribosyl)ierung (AME et al., 2004). Dabei ist die enzymatische Grundaktivität in Zellen sehr niedrig und PARP-1 wird erst durch verschiedene Stimuli, zu denen DNA-Strangbrüche gehören, aktiviert (KIM et al., 2005). In der vorliegenden Studie konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass die Poly(ADP-ribosyl)ierung nach Stimulierung von H2O2 durch Infektion mit T. gondii signifikant reduziert war. PARP-1 ist für etwa 90% der Poly(ADP-ribosyl)ierung in der Zelle verantwortlich (VIRAG, 2005b), so dass die verminderte Poly(ADP-ribosyl)ierung auf die verminderten PARP-1-Proteinlevel nach Toxoplasma-Infektion zurückzuführen sein dürfte. Diese Vermutung wurde zudem von Experimenten mit Katalase-knockout Parasiten gestützt. Dabei zeigten Zellen, die mit den Katalase-negativen PRUcat^- Parasiten infiziert worden waren, im Zell-ELISA eine ähnlich stark reduzierte H2O2-induzierte PARP-1-Aktivität wie Zellen, die mit dem parentalen Stamm PRUhxgprt^- infiziert worden waren. Eine Katalase-vermittelte Detoxifizierung von H2O2 durch T. gondii konnte also ausgeschlossen werden. Nicht nur die Inhibierung der PARP-1-Proteinlevel durch eine Infektion mit T. gondii konnte also in der hier vorliegenden Arbeit bewiesen werden, sondern auch eine starke Abnahme der enzymatischen Aktivität von PARP-1 wurde durch eine Infektion mit T. gondii verursacht. Somit hatte der Parasit nach Infektion neben dem Einfluss auf das Protein PARP-1 auch Einfluss auf die enzymatische Aktivität. Zwar könnten noch andere Mitglieder der PARP Familie theoretisch die Poly(ADP-ribosyl)ierung übernehmen, allerdings sprechen die Daten der hier vorliegenden Arbeit dagegen, da gerade der Nachweis der reduzierten ADP-ribosyltransferase-Aktivität nach Infektion für die wichtige Rolle von PARP-1 bei der ADP-ribosylierung sprach.