Abb. 6.10: LSM-Messung und FP-Analyse eines mit MitoTracker gef¨arbten, station¨aren Ecoli-Bakteriums. (A) Intensit¨atsverteilung und LSM-Bild des Bakteriums (erstes Bild von insgesamt 100 aufgenommenen Bildern; Bildabtastfrequenz: 15.47 Hz). Bildgr¨oße: 98×64 Pixel; Scanzeit pro Pixel: 3.45µs; Pixelgr¨oße: 88 nm. (B) Schnitt entlang der x-Achse (y = 45) durch die in A dargestellte experimentelle (verrauschte Kurve) und angepasste theoretische Intensit¨atsverteilung Iobj(x, y) (6.18 mit 6.9 und 6.10) des approximierten Zigarrenmodells (glatte Kurve). Das LSM-Bild der angepassten Verteilung ist eingef¨ugt.
Ergebnis der FP-Analyse:dx= 2448.9nm,d1 = 495.4nm (d2 =d1, fixiert),dy = 804.5nm, IB = 0.85308, x˜0 = 1.525 Pixel, y˜0 = −62.165 Pixel und ϕ = 2.21297 (χ2 = 13005.649).
Es ergibt sich eine Objektl¨ange von d = 3439.7nm. Das mittlere SNR der Bilder betr¨agt 11.21±0.43.
6.2 Hochaufl¨ osende Lokalisierung von Ecoli-Bakterien in vitro
In diesem Abschnitt soll nun der FP-Algorithmus – als Beispiel f¨ur in vitro Messungen – auf Bildsequenzen von station¨aren Ecoli-Bakterien angewendet werden, und zwar bei verschiedenen SNRs.
Abbildung 6.10 A zeigt das erste aus einer Serie von 100 Bildern eines station¨aren fluo-reszierendenEcoli-Bakteriums. In Teil B der Abbildung ist das Ergebnis der zweidimensio-nalen Anpassung der theoretischen Verteilung Iobj(x, y) des approximierten Zigarrenmo-dells an das LSM-Bild des Bakteriums dargestellt. Ein Schnitt entlang der x-Achse durch die experimentelle und angepasste Verteilung macht deutlich, dass die Verteilungen an den Kanten gut ¨ubereinstimmen. Das mittlere SNR der Bilder liegt bei 11. Die FPA s¨amtlicher Bilder dieser Sequenz liefert als Parameter die an dem in Abbildung 6.11 A eingef¨ugten Objektmodell gekennzeichneten Positionen p0, p1, p2, p3 und p4, d.h. die Positionen des Objektzentrums, des vorderen und hinterenEcoli-Endes sowie der Seitenpunkte des Bakte-riums. Die Fluktuationen der Objektpunkte im Verlauf der Bildserie sind in dieser Darstel-lung kaum zu erkennen (mittlerer Teil der Abbildung: Trajektorien der Objektpunkte p0
Abb. 6.11: Ergebnis der FP-Analyse von 100 nacheinander aufgenommenen LSM-Bildern eines mit MitoTracker gef¨arbten station¨aren Ecoli-Bakteriums (Abbildung 6.10 A zeigt das erste Bild der Bildserie). Die Analyse erfolgt mit der Intensit¨atsverteilungIobj(x, y)des approximierten Zigarrenmodells (Kurvenanpassungsparameter: p, dx, dy, d1 = d2, x˜0, y˜0, IB undϕ). (A) Lokalisierte Positionen der beiden Objektenden (p1 undp2), der linken und rechten Seitenpunkte (p3 und p4) und des Zentrums (p0) des Bakteriums. Das eingezeich-nete Zigarrenmodell im linken Teil des Graphen veranschaulicht die Lage der angegebenen Punkte p0 bisp4. (B) Trajektorien der lokalisierten Punkte in vergr¨oßertem Maßstab. Die Abst¨ande der Punkttrajektorien untereinander stimmen nicht mit den tats¨achlichen, der Skalierung entsprechenden Abst¨anden ¨uberein.
Objektpunkt p0 p1 p2 p3 p4
σx˜ (nm) 8.4 21.6 18 8.9 8.1
σy˜ (nm) 4.3 7.3 9.2 6.1 6.2
Tab. 6.1: Standardabweichungen der lokalisierten Punkte p0, p1, p2, p3 und p4 bez¨uglich der x- und˜ y-Achse von˜ O˜ (Daten zum Experiment aus Abbildung 6.11).
bisp4, jeweils links neben dem entsprechenden Parametername eingezeichnet). Abbildung 6.11 B zeigt eine vergr¨oßerte Darstellung der gemessenen Objektpunkte. Die einzelnen Punkttrajektorien sind mit unver¨anderter Orientierung dicht beieinander gezeichnet. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Zentrum p0 des Bakteriums die kleinsten Fluktuatio-nen und die beiden Ecoli-Enden p1 und p2 die gr¨oßten aufweisen. Zudem ist eine starke Anisotropie der Fluktuationen zu erkennen: Die gr¨oßten Fluktuationen treten in Richtung der Symmetrieachse des Bakteriums auf. In Tabelle 6.1 sind die Standardabweichungen σx˜i und σy˜i der gemessenen Positionen pi bez¨uglich der ˜x- und ˜y-Achse des Koordinaten-systems ˜O zusammengefasst. Es zeigt sich, dass das Objektzentrum mit einer Genauigkeit von weniger als 10 nm bestimmt werden kann.
Um die Abh¨angigkeit der Lokalisierungsgenauigkeiten der verschiedenen Objektpunkte
6.2. Hochaufl¨osende Lokalisierung von Ecoli-Bakterien in vitro 93 vom SNR der Bilder im Experiment zu verdeutlichen, ist in Abbildung 6.12 eine Mes-sung mit einem mittleren SNR von ∼ 16 dargestellt (das h¨ohere SNR entsteht durch die l¨angere Inkubation der Bakterien mit der Farbstoffl¨osung). Durch das erh¨ohte Fluores-zenzsignal erfolgt die Detektion im nicht-linearen Bereich der APD. Dadurch kommt es zu einer Abflachung des Intensit¨atsmaximums der gemessenen (Abbildung 6.12 A) und der angepassten Verteilung (Abbildung 6.12 B). Das breitere Intensit¨atsmaximum spiegelt zudem den im Vergleich zum ersten Beispiel gr¨oßeren Durchmesser des Ecoli-Bakteriums wider. Obwohl die APD verst¨arkt im nicht-linearen Bereich betrieben wird, ist der Fehler der dadurch bei der Detektion der relativen Bewegungen der Objektgrenzen entsteht, im Vergleich zu den erreichbaren Lokalisationsgenauigkeiten vernachl¨assigbar. Berechnet man aus der angepassten Intensit¨atsverteilungIobj(x, y) (Abb. 6.12) die totzeitkorrigierte Inten-sit¨atsverteilung I0obj(x, y) (Abschnitt 4.4.1) und unterzieht diese wiederum einer FPA, so zeigt sich, dass sowohl leichte symmetrische als auch unsymmetrische L¨angen¨anderungen des Objektes durch die Analyse beider Verteilungen sehr genau detektiert werden k¨onnen:
Wird z.B. die Intensit¨atsverteilung Iobj(x, y) nach einer symmetrischen L¨angen¨anderung des Objektes von ∆d = ∆dx = 0.1 Pixel neu berechnet, resultiert aus der FPA der zu-geh¨origen totzeitkorrigierten VerteilungenI0obj(x, y) eine detektierte L¨angen¨anderung von
∆d= 0.093 Pixel. Bei einer Pixelgr¨oße von 88 nm ergibt sich daraus eine Abweichung von 0.6 nm. Wird die L¨ange des Objektes durch Erh¨ohung der Ellipsoidkappenl¨anged1 unsym-metrisch ver¨andert, ∆d= ∆d1 = 0.1 Pixel, so ergibt die FPA der korrigierten Verteilungen I0obj(x, y) bei Annahme eines symmetrischen Objektes (d1 =d2) eine L¨angen¨anderung von
∆d= 0.111 Pixel. Mit einer Pixelgr¨oße von 88 nm ergibt sich ein Fehler von 1 nm. Es zeigt sich somit, dass relative Verschiebungen der Objektgrenzen auch im stark nicht-linearen Bereich der totzeitbehafteten APD sehr genau detektiert werden k¨onnen.
Abbildung 6.12 C und D zeigen das Ergebnis der FPA der gesamten Bildsequenz. Es wird deutlich, dass die Lokalisierungsgenauigkeit zugenommen hat. Tabelle 6.2 fasst die gemessenen Standardabweichungen der Objektpunkte zusammen. Die Messungen zeigen, dass bei entsprechendem SNR Lokalisierungsgenauigkeiten von bis zu ∼ 5 nm und besser erreichbar sind. Diese Werte liegen sogar noch etwas oberhalb der tats¨achlichen Lokali-sierungsgenauigkeiten, denn die Detektion des Intensit¨atssignals mit der totzeitbehafteten APD f¨uhrt zu einer erh¨ohten relativen Standardabweichung des Intensit¨atssignals (Ab-schnitt 4.4.1). Dies f¨uhrt zu einem schlechteren SNR der Bilder und gleichzeitig zu einer schlechteren Lokalisierungsgenauigkeit. Die gemessenen Lokalisierungsgenauigkeiten von
∼ 5 nm und besser, stellen somit eine obere Grenze der Genauigkeit des LSM dar. Diese Daten spiegeln somit die hohe Pr¨azision des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten LSM wider.
Abb. 6.12: LSM-Messung und FP-Analyse eines mit MitoTracker gef¨arbten, station¨aren Ecoli-Bakteriums. (A) Intensit¨atsverteilung und LSM-Bild des Bakteriums (erstes Bild von insgesamt 120 aufgenommenen Bildern; Bildabtastfrequenz: 15.47 Hz). Bildgr¨oße:
100 × 64 Pixel; Scanzeit pro Pixel: 3.4µs; Pixelgr¨oße: 88 nm. (B) Schnitt entlang der y-Achse (x=37) durch die in A dargestellte experimentelle (verrauschte Kurve) und an-gepasste Intensit¨atsverteilung Iobj(x, y) (6.18 mit 6.9 und 6.10) (glatte Kurve). Ergebnis der FPA: dx = 2294.3nm, d1 = 826.7nm (d2 = d1, fixiert), dy = 1363.2nm, IB = 0.7036,
˜
x0 = 49.811 Pixel, y˜0 = 0.1377 Pixel und ϕ= 0.647 (χ2 = 20138.709). Ecoli-Gesamtl¨ange:
d = 3947.8nm. (C) Positionen der Objektenden p1 und p2, der Seitenpunkte p3 und p4
sowie des Zentrums p0 des Bakteriums (Ergebnis der FPA der gesamten Bildsequenz). (D) Trajektorien der lokalisierten Punkte im vergr¨oßerten Maßstab. Die Abst¨ande der Punkt-trajektorien untereinander stimmen nicht mit den tats¨achlichen, der Skalierung entspre-chenden Abst¨anden ¨uberein. Das mittlere SNR der Bilder betr¨agt 16.34±0.37.
Objektpunkt p0 p1 p2 p3 p4
σx˜ (nm) 3.7 8.7 6.7 3.7 4.1
σy˜ (nm) 1.9 4.1 4.5 3.8 4.6
Tab. 6.2: Standardabweichungen der lokalisierten Punkte p0, p1, p2, p3 und p4 bez¨uglich der x- und˜ y-Achse von˜ O˜ (Daten zum Experiment aus Abbildung 6.12).