Das Ausgangssignal des Photodetektors (Abschnitt 4.4.1) ist ¨uber die PCH (Abschnitt 4.4.2) mit einer Korrelatorkarte (ALV-5000/E, ALV-Laser Vertriebsgesellschaft, Langen) verbunden. Diese befindet sich im FCS-Analyse-Computer (FCS-PC, Abb. 4.1). Der Karte stehen f¨ur die Berechnung der AKF 288 Kan¨ale mit jeweils 64 Bit Aufl¨osung zur Verf¨ugung.
Sie sind in einem Zeitbereich von 200 ns bis zu einigen Stunden abschnittsweise logarith-misch angeordnet [82]. Jeder Kanal hat eine individuelle
”Sampling-Zeit“Ts. Diese spezielle Anordnung erm¨oglicht – trotz der geringen Kanalanzahl – die Abdeckung eines weiten Verz¨ogerungszeitbereichs, ohne viele Informationen zu verlieren. Die Multiplikation und die Aufsummierung der Daten l¨auft f¨ur viele verschiedene Verz¨ogerungszeiten parallel. Die AKF wird nach dem folgenden Algorithmus berechnet: 1. Z¨ahlen der Photoelektronenpulse innerhalb der Sampling-Zeitintervalle der BreiteTs; 2. Verz¨ogerung der”Samples“ um ein ganzzahliges Vielfachesn der Sample-ZeitTs:τ =n·Ts; 3. Multiplikation der verz¨ogerten mit den unverz¨ogerten Sample-Daten; 4. Aufsummierung aller Produkte (siehe auch [83]).
Gleichzeitig wird die AKF ¨uber ein internes Schema normiert. Wenige Millisekunden nach dem Start der Analyse erscheint auf dem Monitor eine Korrelationsfunktion, deren Verlauf sich durch die st¨andige Datenaufnahme und Mittelwertbildung nach und nach gl¨attet.
Zus¨atzlich zur AKF ist in einem zweiten Fenster die ¨uber kurze Zeitabschnitte gemittelte Photonenz¨ahlrate aufgetragen (in kHz). Der Zeitabschnitt, in dem Photoelektronenpulse f¨ur die Mittelwertbildung gez¨ahlt werden, ist einige Millisekunden lang und h¨angt von der voreingestellten Messzeit ab. Die relativ hohen Photonenz¨ahlraten (>10·103s−1, Abschnitt 5) verhindern jedoch die Auswertung von Einzelphotonenereignissen.
39
Kapitel 5
Passiver Molek¨ ultransport in Neuronen
Ein wesentlicher Teil zellul¨arer Prozesse basiert auf der Diffusion von kleinen Signalmo-lek¨ulen bis hin zu großen MakromoSignalmo-lek¨ulen. Die Diffusion eines Makromolek¨uls innerhalb einer Zelle wird durch eine hohe Konzentration von zellul¨aren Proteinen behindert (typi-scherweise 20-30 vol%). Zellul¨are Proteine kommen in verschiedenster Form und Gr¨oße vor.
Aktinfilamente und Mikrotubuli k¨onnen z.B. L¨angen von einigen Mikrometern erreichen.
Um dynamische zellul¨are Prozesse zu verstehen, ist es erforderlich, das Verst¨andnis der Diffusion von Makromolek¨ulen in den beengten und ¨uberf¨ullten intrazellul¨aren Komparti-menten zu verbessern.
In diesem Teil der Arbeit wird die Dynamik eines mit Farbstoff markierten hydrophi-len 10 kDa Dextrans (TMR-Dextran) innerhalb von Somata und Dendriten kultivierter Neurone untersucht, also eines Molek¨uls von der Gr¨oße eines kleinen Proteins. F¨ur diese Untersuchungen braucht man eine Messmethode, die eine geringe Anzahl von Dextranmo-lek¨ulen innerhalb eines kleinen zytosolischen Kompartimentes detektieren sowie schnelle und langsame Prozesse untersuchen und zwischen aktivem Transport und Diffusion un-terscheiden kann. Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Methode, die diese Anforderungen erf¨ullt [3, 25–27]. Es werden experimentelle LSM-basierte Methoden und FCS-Algorithmen entwickelt, die es erm¨oglichen, hochpr¨azise Messungen von Molek¨ul-dynamiken innerhalb von Dendriten von Neuronen durchzuf¨uhren.
5.1 Intrazellul¨ are FCS
Nach den ersten FCS-Messungen in offenen L¨osungssystemen Anfang der 90er Jahre mit einer FCS-Apparatur mit konfokalem Strahlengang [41–43] hat die FCS schnell an Popu-larit¨at gewonnen. Bald darauf erschienen die ersten Arbeiten ¨uber intrazellul¨are FCS-Anwendungen. Es folgten Untersuchungen der Diffusion [84–88] und des aktiven
Trans-ports [31] von fluoreszierenden Molek¨ulen innerhalb verschiedener Zelltypen, und zwar unter Anwendung von Diffusionsmodellen f¨ur r¨aumlich uneingeschr¨ankte Systeme. Die An-wendung der Standard-FCS-Modelle f¨ur r¨aumlich uneingeschr¨ankte L¨osungssysteme (Ab-schnitt 2.1) ist gerechtfertigt, solange die r¨aumliche Ausdehnung des konfokalen Detekti-onsvolumens gegen¨uber der des Zellkompartimentes klein ist. Im Zuge dieser Arbeit werden FCS-Messungen innerhalb von Dendriten kultivierter Neurone durchgef¨uhrt, deren r¨aumli-che Ausdehnung in der gleir¨aumli-chen Gr¨oßenordnung liegt wie die des Detektionsvolumens. Um die Messdaten richtig interpretieren zu k¨onnen, muss die Plasmamembran als Diffusions-grenze in das Diffusionsmodell einbezogen werden [3].
5.1.1 FCS-Modell f¨ ur r¨ aumlich begrenzte Diffusion
Bei FCS-Messungen innerhalb eines Dendriten, dessen Breite und H¨ohe in der gleichen Gr¨oßenordnung sind wie die 1/e2-Radien rxy und rz des Detektionsvolumens VD (oder kleiner), muss die r¨aumlich begrenzte Diffusion der Molek¨ule ber¨ucksichtigt werden. Ist die H¨ohe dz des Diffusionsraumes ausreichend klein, d.h. dz/rz ≤ 0.83 [3], kann die Diffusion in z-Richtung, d.h. entlang der optischen Achse, vernachl¨assigt werden. Die Durchmesser der untersuchten Dendriten liegen im Bereich von 1µm und darunter. Der 1/e2-Radius des Detektionsvolumens in axialer Richtung betr¨agt rz = 1.7µm (Abschnitt 3.5). Damit gilt f¨ur die Messungen Z = dz/rz < 0.59. Unter diesen Bedingungen kann die AKF f¨ur Brownsche Diffusion in Dendriten durch folgenden Ausdruck beschrieben werden [3]:
G(τ) = 1 Hierbei erfolgt die Summation ¨uber mStandard-AKF-Terme f¨ur die Diffusion entlang des Dendriten, d.h. der x-Achse,
gjx(τ) =¡
1 +τ /τdiffj
¢−1/2
(5.2) undm Termegjy∗(τ) f¨ur r¨aumlich begrenzte Diffusion orthogonal zur Achse des Dendriten, d.h. der y-Achse, Der Parameter Y entspricht dem Verh¨altnis der Breitedy des Dendriten zum 1/e2-Radius rxy des
”offenen“ Detektionsvolumens VD, d.h. Y =dy/rxy.
Damit die Molek¨ulkonzentrationhCiaus der mittleren detektierten Teilchenzahl hNgesi bestimmt werden kann, muss das tats¨achliche, durch die Grenzen der Plasmamembran
5.1. Intrazellul¨are FCS 41 gegebene VolumenVD∗ bekannt sein. Im Fall der r¨aumlichen Einschr¨ankung entlang der y-und z-Achse ist das tats¨achliche Volumen VD∗ gegeben durch [3]
VD∗ =π3/2r2xyrz· [erf¡
5.1.2 FCS-Modelle f¨ ur anisotrope Diffusion
L¨asst sich die Diffusion entlang und orthogonal zur Achse des Dendriten durch verschiedene Diffusionskonstanten charakterisieren, d.h. Dx = Dk und Dy = Dz = D⊥, dann folgt f¨ur die AKF einer molekularen Spezies
G(τ) = 1 vernachl¨assigbar (Y ≤0.83 undZ ≤0.83), reduziert sich die AKF auf den Ausdruck
G(τ) = 1
Die AKF (5.1) f¨ur r¨aumlich begrenzte Diffusion einer Spezies l¨asst sich dann f¨ur den Fall der anisotropen Diffusion wie folgt schreiben:
G(τ) = 1
5.1.3 Ber¨ ucksichtigung autofluoreszierender Molek¨ ule
Autofluoreszierende Biomolek¨ule k¨onnen einen großen Einfluss auf intrazellul¨are FCS-Messungen haben [86,89]. Bewegt sich ein autofluoreszierendes Molek¨ul durch das konfokale Detektionsvolumen, kann dies zu einem detektierbaren Intensit¨atsspike f¨uhren und einen
”transienten“AKF-Beitrag hervorrufen. Die lineare Translation eines autofluoreszierenden Molek¨uls durch das Detektionsvolumen ist ein deterministischer Prozess. Die der Transla-tion folgende Intensit¨ats¨anderungδI(t) ist durch das Faltungsprodukt zwischen der detek-tierbaren Emissionsintensit¨atsverteilungIE(~r) (2.11) und der Objekt-Funktion des fluores-zierenden Molek¨uls gegeben. Die Objektfunktion eines kleinen Molek¨uls (d ¿ rxy) kann durch eine Dirac δ-Funktion angen¨ahert werden. Bewegt sich das Molek¨ul entlang der x-Achse, folgt f¨ur die Intensit¨atsver¨anderung
δI(t)∼exp
wobei das Molek¨ul das Zentrum des Detektionsvolumens zum Zeitpunkt t = 0 mit der Geschwindigkeit v durchquert. Dieser Intensit¨atsspike f¨uhrt w¨ahrend einer FCS-Messung zu einer transienten AKF-Komponente, proportional zu1
gSTE(τ) =e−
”charakteristische“ Translationszeit. Aufgrund der zeit-lichen AKF-Mittelung (Abschnitt 4.9) verschwindet dieser zus¨atzliche Anteil allm¨ahlich.
Denselben Ausdruck (5.12) berechneten Magdeet al.[33] f¨ur den station¨aren stochastischen Prozess der gleichf¨ormigen linearen Bewegung von fluoreszierenden Partikeln.