Abb. 5.10: AKF einer FCS-Messung in einem mit 10 kDa TMR-Dextran gef¨ullten Den-driten (identisch zu der untersten Kurve in Abb. 5.3). Ergebnis der Kurvenanpassung mit dem AKF-Modell f¨ur anisotrope Diffusion (Gl. 5.8-5.10, gestrichelte Kurve): hNi= 2.074, T = 0.207, τT = 4.23µs, τdiffk = 0.179ms, und τdiff⊥ = 14.62ms (fixierter Parameter:
Y =dy/rxy = 3.79, Ergebnis der Scan-Profil-Analyse des Dendriten, Abb. 5.1 B).
den (Abb. 5.9, gestrichelte Kurve). Die gemessenen Zeitkonstanten liegen im Bereich von 5 bis 1200 ms. Dieser Zeitbereich ist identisch mit dem der Translationszeitkonstanten, der innerhalb von mit TMR-Dextran gef¨ullten Neuronen gemessen wurde. Sie lassen sich zum großen Teil dem aktiven Transport von autofluoreszierenden Mitochondrien [86] zuordnen (Abschnitt 6).
5.6 Anisotrope dendritische Diffusion
Dendriten von Mitralzellen haben ein ausgepr¨agtes Netzwerk von Mikrotubuli (MT). Sie verlaufen parallel zur Fortpflanzungsrichtung der Dendriten (Abb. 5.11). Der Abstand zwi-schen benachbarten Mikrotubuli liegt im Bereich von 10 bis 80 nm, der mittlere Durch-messer eines Mikrotubulus betr¨agt ∼ 20 nm. Der mittlere hydrodynamische Durchmes-ser dh des 10 kDa TMR-Dextrans ergibt sich aus der Stoke-Einstein-Gleichung, d.h.
dh =kT /3πηDaq. Mit der Viskosit¨atη= 10−3Ws·s·m−3, der Dextran-Diffusionskonstante Daq = 8.5·10−7cm2·s−1 f¨ur w¨assrige L¨osung, der Temperatur T = 297.15 K ( ˆ=24◦) und der Boltzmannkonstantek = 1.38·10−23Ws·K ergibt sich ein mittlerer hydrodynamischer Durchmesser vondh= 5.1 nm. Mit diesen Werten erscheint es plausibel, dass das parallele Netzwerk der Mikrotubuli die Diffusion des 10 kDa TMR-Dextran orthogonal zur Dendri-tenachse stark behindert (im Bereich der L¨angenskala des 1/e2-Radius rxy), w¨ahrend die Diffusion entlang der Mikrotubuli kaum eingeschr¨ankt wird. Um diese Idee zu verfolgen,
Abb. 5.11: Aufnahme einer Mitralzelle, hergestellt mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop (Dr. Leonid Nezlin, Abteilung Molekulare Neurophysiologie, Physiologisches Institut, Universit¨at G¨ottingen). (A) Niedrige Aufl¨osung des Somas (un-ten links) und des Dendri(un-ten mit einem Mitochondrium (Pfeil). Der Zellkern (
”nucleus“, nu) f¨ullt den gr¨oßten Teil des Somas aus. Maßbalken: 2 µm. (B) H¨ohere Aufl¨osung der in A gekennzeichneten Region. Maßbalken: 100 nm. Oben links ist eine Vergr¨oßerung (mit ver¨andertem Kontrast) der gekennzeichneten Region dargestellt. L bezeichnet den Abstand zwischen zwei benachbarten Mikrotubuli und dMT den Durchmesser eines Mikrotubulus.
5.6. Anisotrope dendritische Diffusion 57
Zytosolisches Soma/Nucleus Dendrit
Kompartiment (Anzahl der Zellen) (Anzahl der Dendriten) [D] = 10−7cm2/s 3.4≤Dcyto ≤7.3 (67) 4.1≤Dcytok ≤7.9 (88)
1.2≤Daq/Dcyto ≤2.6 1.1≤Daq/Dcytok ≤2.1 0.085< Dcyto⊥ <0.89 (73)
9.6< Daq/Dcyto⊥ <100 Tab. 5.1: Mobilit¨aten des 10 kDa TMR-Dextrans innerhalb von kultivierten Neuronen des Bulbus olfactorius. Die Ergebnisse der FCS-Messungen innerhalb von Dendriten stammen von sehr d¨unnen (Abschnitt 5.7) und sehr dicken (Abschnitt 5.8) Dendriten sowie von Dendriten mit mittlerem Durchmesser.
wurden die dendritischen FCS-Daten mit einem Diffusions-Modell ausgewertet, das zwi-schen der Diffusion entlang des Dendriten und der Diffusion orthogonal zum Dendriten unterscheiden kann (Gl. 5.8-5.10). Wertet man die AKF-Daten ohne einen STE-Beitrag (z.B. Abb. 5.3, unterste Kurve; siehe auch Abb. 5.6 A, Messungsindex i = 2) mit diesem Modell aus, so ist nur eine fluoreszierende Komponente mit Φ = 1 erforderlich, um ein gutes Kurvenanpassungsergebnis zu erhalten (Abb. 5.10). Die Analyse der in Abbildung 5.10 gezeigten AKF ergibt die charakteristischen Zeitkonstantenτdiffk undτdiff⊥ f¨ur die Dif-fusion parallel und orthogonal zur Achse des Dendriten, τdiffk = (0.179±0.011) ms und τdiff⊥ = (14.62±2.75) ms. In diesem Beispiel ist die Mobilit¨at des 10 kDa TMR-Dextrans im Vergleich zu der Diffusion in w¨assriger L¨osung (τdiff = 0.16 ms) um den Faktor 1.1 enlang des Dendriten und um den Faktor 91 orthogonal zur Achse des Dendriten vermin-dert. Die Diffusion orthogonal zu den MT ist somit stark eingeschr¨ankt. ¨Ahnliche Ergeb-nisse ergeben die FCS-Messungen in 66 Dendriten. Tabelle 5.1 fasst die ErgebErgeb-nisse der FCS-Messungen innerhalb von Somata und Dendriten zusammen. Die Diffusionskonstan-te Daq des 10 kDa TMR-Dextrans (100 nM), in einem Tropfen Wasser gemessen, betr¨agt Daq = (8.5±0.3)×10−7cm2s−1.
Um weitere Anhaltspunkte zu finden, die die Interpretation der anisotropen Diffusion in Dendriten unterst¨utzen, wurden FCS-Messungen innerhalb von Dendriten durchgef¨uhrt, deren MT vorab zerst¨ort worden sind. Hierzu wurden die Zellkulturen mit Nocodazol bzw.
Colchizin (jeweils 10µg/ml, Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen) inkubiert. Beide Gifte verhindern die Polymerisierung von Tubulin [90, 91]. Durch den fortw¨ahrenden Auf- und Abbau von Mikrotubuli wird ihr Netzwerk mit der Zeit
”zerst¨ort“. Um den Zustand der Mikrotubuli in Abh¨angigkeit der Inkubationszeit kontrollieren zu k¨onnen, wurden an Zell-kulturen mit unterschiedlichen Inkubationsdauern Antik¨orper-F¨arbungen von α-Tubulin durchgef¨uhrt (Abschnitt 3.4, Abb. 5.12). Nach zwei Tagen Inkubationsdauer ist das Netz-werk der Mikrotubuli vollst¨andig abgebaut (Abb. 5.12 B). Die Scan-Profile der behan-delten Dendriten zeigen, dass sich durch die Zerst¨orung des Mikrotubuli-Netzwerks auch die Querschnittsprofile der Dendriten ¨andern. In den meisten F¨allen l¨asst sich das Scan-Profil nicht mehr durch ein Kreis- oder Rechteckprofil beschreiben (Abb. 5.13 A). Die
A
B
Abb. 5.12:Kultivierte Mitralzellen aus dem Bulbus olfactorius mit Antik¨orperf¨arbung von α-Tubulin. (A) Natives Neuron mit Mikrotubuli (MTs). (B) Neuron ohne MTs nach 48 Stunden Colchizin-Inkubation.
FCS-Messungen in diesen Dendriten f¨uhrten nicht zu konsistenten Ergebnissen. In wenigen F¨allen konnte allerdings ein Rechteckprofil den Querschnitt beschreiben (Abb. 5.13B). Die FCS-Messungen innerhalb dieser Dendriten ergaben nur eine fluoreszierende Spezies. Der Wert der Diffusionszeitkonstante liegt im Bereich der dominierenden kleinen Zeitkonstan-te, die in den Somata gemessen wurde. Abbildung 5.14 zeigt das Ergebnis einer Messung in einem mit Colchizin behandelten Neuron. Die Kurvenanpassung mit dem AKF-Modell f¨ur r¨aumlich eingeschr¨ankte Diffusion (Gl. 5.1) f¨uhrt in diesem Beispiel zu einer charak-teristischen Diffusionszeit von τdiff = 0.222 ms (Φ = 1). Die Diffusion des 10 kDa TMR-Dextrans innerhalb dieses Dendriten ohne MT scheint somit ann¨ahernd isotrop zu sein.
Die Kurvenanpassung liefert einen Einschr¨ankungsparameter vonY =dy/rxy = 2.944. Mit rxy = 0.236µm folgt f¨ur den Dendritendurchmesserdy = 0.695µm (Abb. 5.14). Dieser Wert stimmt mit dem Ergebnis der Auswertung des zugeh¨origen Scan-Profils (dy = 0.705µm, Abb. 5.13B) gut ¨uberein.
5.6. Anisotrope dendritische Diffusion 59
Abb. 5.13: Scan-Profile von mit 10 kDa TMR-Dextran gef¨ullten Dendriten kultivierter Mitralzellen ohne MTs nach zwei Tagen Colchizin-Behandlung (10µg/ml). (A) Linien-Scan durch einen dicken Dendriten. (B) Scan-Profil eines Dendriten mittleren Durchmessers.
Ergebnis der Kurvenanpassung des Scan-Profils s0rect(y) (Gl. 5.24) (gestrichelte Kurve):
β = 74.87·103s−1,dy = 0.71µm,y0 = 0.628µm undIB = 2.875·103s−1 (fixierte Parameter:
rxy = 0.236µm undS = 7).
Abb. 5.14: AKF einer FCS-Messung innerhalb eines Dendriten mit 10 kDa TMR-Dextran ohne MTs (das zugeh¨orige Scan-Profil ist in Abb. 5.13Bzu sehen). Ergebnis der Kurvenan-passung mit einem 1-Komponenten-Modell f¨ur r¨aumlich eingeschr¨ankte Diffusion (Gl. 5.1, m = 1) (gestrichelte Kurve): hNi = 78.82, T = 0.144, Y =dy/rxy = 2.944, τdiff = 0.222ms (fixierter Parameter: τT= 4µs).