Histologische, immunhistologische und biochemische Untersuchungen

3.1.6.1. Anatomische Präparation und pathologisch-anatomische Untersuchungen

Die Hündinnen wurden in Allgemeinanästhesie mit zusätzlicher Epiduralanästhesie in der Linea alba laparotomiert. Uterus und Ovarien wurden in situ vorgelagert und fotografiert.

Nach Abbinden erfolgte die Ovariohysterektomie nach BRASS (1999).

Nach der Exenteration der Ovarien wurden diese vermessen, auf makroskopisch erfassbare Strukturen (Corpora lutea) sowie pathologisch-anatomische Veränderungen untersucht, sagit-tal halbiert und fotografiert. Makroskopisch erkennbare Gelbkörper wurden gezählt und beur-teilt. Die Ovarien wurden dann für 24 bis 72 Stunden in 4%iger gepufferter Formalin-Lösung fixiert. Die Zeitspanne zwischen Entnahme und Fixierung der Ovarien betrug zwischen 10 und 15 Minuten. Die Ovarien wurden während dieser Zeit mehrfach mit steriler isotoner Kochsalzlösung befeuchtet. Sämtliche Manipulationen an den Organen wurden unter sterilen Kautelen durchgeführt.

Für weiterführende Untersuchungen im Rahmen anderer Studien wurden 1-2 mm große Pro-ben in Paraform- bzw. Glutaraldehyd oder flüssigen Stickstoff eingebettet.

Von den formalinfixierten Eierstöcken wurden aus allen ovarialen Strukturelementen unter-schiedlicher Lokalisationen Gewebeproben entnommen und histologisch aufgearbeitet.

3.1.6.2. Histologische Präparation

Die formalinfixierten Proben wurden nach Standardverfahren in Paraffin eingebettet. Mit Hil-fe eines Schlittenmikrotoms (Microm HM 360) wurden 5 µm dicke Schnitte angeHil-fertigt, auf mit 0,01% Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (Fa. Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, USA) aufgezogen und mit einer Hämalaun-Eosin-Färbung (H.-E.-Färbung) (ROMEIS 1989, siehe Anhang) angefärbt.

3.1.6.3. Licht- und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen

Die lichtmikroskopische Untersuchung der Präparate wurde mit dem Axioskop 2 (Fa. Zeiss, Oberkochen) unter Verwendung von 10er, 20er und 40er Objektiven durchgeführt. Je Ovar standen zwei H.-E.-gefärbte Objektträger zur Verfügung.

Mittels dieser Untersuchungen wurden die an den Ovarien vorhandenen Funktionskörper be-stimmten Stadien der Reifung und Rückbildung zugeordnet. Zur Quantifizierung aufgefunde-ner Follikelstadien wurden pro Ovar fünf Definitionsfelder ausgezählt. Dabei entsprach ein Gesichtsfeld in der Vergrößerung mit dem 10er-Objektiv einem Definitionsfeld. Die numeri-schen Ergebnisse wurden wie folgt klassifiziert:

< 10 Follikelstadien = wenige 10-15 Follikelstadien = einige

> 15 Follikelstadien = zahlreiche

Die Gelbkörper wurden den von ANDERSEN und SIMPSON (1973) definierten Stadien der frühen bis späten Rückbildung zugeordnet. Abschätzung und Wertung der histologischen Be-funde an den Corpora lutea wurden von zwei unabhängigen Gutachtern bestätigt.

Am Axioskop 2 waren durch Zuschalten einer entsprechenden Lichtquelle fluoreszenzmikro-skopische Untersuchungen möglich. Die mit fluoreszierendem Farbstoff behandelten Ovar-schnitte wurden bei Exzitationswellenlängen zwischen 365 und 546 nm und Emissionswellen-längen zwischen 420 und 590 nm betrachtet. Die Anzahl Fluoreszenz-positiver Zellen wurde geschätzt. Abschätzung und Wertung der fluoreszenzmikroskopischen Befunde an den Corpo-ra lutea wurden von zwei unabhängigen Gutachtern bestätigt.

3.1.6.4. Immunhistologische und biochemische Methoden

Relaxin, 3-β-HSD und Progesteronrezeptoren wurden mittels der Immun-Peroxidase-Methode nachgewiesen. Für den Nachweis apoptotischer und nekrotischer Zellen stand das Annexin-V-Fluos Staining Kit^ (Fa. Boehringer Mannheim, Mannheim), für den Nachweis apoptoti-scher Zellen nach der TUNEL-Methode das In Situ Cell Death Detection Kit^ (Fa. Boehrin-ger Mannheim, Mannheim), zur Verfügung.

Als primäre Antikörper wurden für Relaxin polyklonale rabbit-anti-porcine-Antikörper (Be-zugsquelle O.D. Sherwood, Illinois, USA) in der Verdünnung 1:5000, für 3-β-HSD Kanin-chen-IgG-Antikörper (Fa. Pineda, Berlin) in der Verdünnung 1:1000 und für den Progesteron-rezeptor monoklonale Antikörper der Maus: mouse-IgG2a-Antikörper Klon 10A9 (Fa. Coul-ter-Immunotech, Hamburg) in der Verdünnung 1: 50 bzw. 1:10 verwendet.

Die jeweilige Konzentration wurde in Vorversuchen (Relaxin: 1:100, 1: 300, 1:500; 1:1000, 1:5000, 1:7000, 1:10 000; 3-β-HSD 1:1000; PR 1:10, 1:50, 1:100) getestet.

Die Nachweise wurden nach folgendem Methodenprotokoll durchgeführt:

Relaxin und 3-β-HSD

Zur Vorbereitung wurden die Objektträger am Abend vorher über Nacht in den Wärme-schrank gestellt.

Zum Nachweis von Relaxin und 3-β-HSD wurden die Paraffinschnitte zunächst mit Xylol und danach in einer absteigenden Alkoholreihe (100, 90, 80, 70 und 50%iges Ethanol) entparaffi-niert (siehe Anhang). Anschließend wurden die Schnitte einer 20minütigen Behandlung mit 3%igem H2O2 (Fa. Roth, Karlsruhe) und einer 45minütigen Inkubation mit humanem Nor-malserum (1:100) unterworfen. Dann wurden sie mit den in PBS verdünnten jeweiligen Pri-mär-Antikörpern beschichtet und über Nacht bei 4° C in einer feuchten Kammer inkubiert.

Als Kontrolle wurden statt des primären Antikörpers IgG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnungsstufe eingesetzt.

Am nächsten Tag wurden die Schnitte in PBS-Pufferlösung gespült und anschließend 45 Mi-nuten mit einem anti-mouse-anti-rabbit Sekundärantikörper (DAKO A, Fa. DAKO Cytomati-on, Glostrup, Dänemark) bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach ei-ner weiteren Spülung mit PBS-Puffer wurden die Schnitte mit chromogenem Substrat (AEC-DAKO, Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA) behandelt. Die Reaktion wurde nach acht Minuten durch Stoppen in Leitungswasser beendet, die Schnitte nochmals mit Aqua bi-dest. gespült und anschließend mit Immu-Mount^ (Fa. Shandon, Pittsburgh, USA) eingedeckt (EINSPANIER et al. 1997).

Progesteronrezeptor

Nach Entparaffinierung (siehe Anhang) wurden die Schnitte zur Vorbehandlung für zehn Mi-nuten in 10 mM Citratpuffer (pH 6) (Herstellung siehe Anhang) bei 120° C in den Wärme-schrank verbracht. Nach einer Abkühlzeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Schnitte in PBS gespült und anschließend acht Minuten in 0,0125%iger Trypsinlösung bei 37° C inkubiert und danach wiederum in PBS-Pufferlösung gespült. Der weitere Ablauf ent-spricht der Verfahrensweise ohne Vorbehandlung (siehe Relaxin und 3-β-HSD).

Annexin-V-Fluos Staining Kit^®

Im Rahmen apoptotischer Veränderungen kommt es zu einer Freisetzung von Phosphatidylse-rin (PS) aus der Plasmamembran an die Zelloberfläche. Annexin V ist ein Kalzium-abhängiges Protein mit einer hohen Affinität zu PS, färbt aber auch nekrotische Zellen an (VERMES et al. 1995). Die Kombination mit Propidium-Jodid, das mit der DNA nekroti-scher, aber nicht mit der DNA apoptotischer Zellen reagiert, ermöglicht eine Unterscheidung von Apoptose und Nekrose.

Zur Vorbereitung für zehn Assays wurden aus dem Testkit (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Penzberg) 20 µl Annexin-V-Reagenz in 1 ml Inkubations-Puffer gelöst und mit 20 µl Propi-dium-Jodid versetzt. Die Schnitte wurden nach Entparaffinierung fünf Minuten mit PBS-Puffer gewaschen und anschließend für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit je 50 µl der her-gestellten Lösung bedeckt.

Im Anschluss wurden die Objektträger mit Gel Mount^ Eindeckmedium (Fa. Sigma, Stein-heim) eingedeckt und die Präparate innerhalb der folgenden sechs Stunden befundet, um Fehlinterpretationen durch das rasche Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes zu vermeiden.

In Situ Cell Death Detection Kit^® (TUNEL)

Die TUNEL-Methode (terminal deoxy-nucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end-labeling) dient dem Nachweis apoptotischer Zellen. Das Prinzip der Methode basiert auf der Sichtbarmachung spezifischer apoptosebedingter DNA-Fragmente (nicks) mittels einer enzymatischen Reaktion. Die Identifikation der Fragmente erfolgt nach Anfärbung im Fluo-reszenz-Mikroskop (GAVRIELI et al. 1992).

Die Paraffinschnitte wurden für eine Stunde im Wärmeschrank bei 40°C erwärmt und an-schließend entparaffiniert. Nach 30-minütiger Inkubation in Proteinase-K-Lösung (Fa. Sigma, Steinheim) (20 µg/ml in Tris-HCl (Fa. Roth, Karlsruhe)) wurden die Schnitte 3 x 15 Minuten in PBS-Puffer gewaschen und im Anschluss mit je 50 µl der kurzfristig nach Herstelleranga-ben des Kits aus 50 µl Enzymreagenz und 450 µl Lösungsmittel angefertigten TUNEL-Reagenz beschichtet.

Nach einer 60minütigen Inkubation in einer verdunkelten feuchten Kammer bei 37°C wurden die Schnitte mit Gel Mount^ (Fa. Sigma, Steinheim) eingedeckt und unmittelbar danach fluo-reszenzmikroskopisch befundet.

3.1.6.5. Auswertung der immunhistologischen Parameter

Für jeden immunhistologischen Parameter stand ein Objektträger für die mikroskopische Un-tersuchung zur Verfügung.

Als Positivkontrollen wurden Ovarien und Uterusproben von Callithrix jacchus bzw. Plazen-taproben des Hundes mitgeführt. Als Negativkontrollen dienten jeweils parallel, ausschließ-lich mit mouse-anti-rabbit-IgG (Fa. Dianova, Hamburg) inkubierte Schnitte.

Die Expression von Relaxin und 3-β-HSD erscheint im Gelbkörper als eine ausschließlich zytoplasmatische mittlere bis kräftig rote Anfärbung. Als positiv wurden in der Schnittebene liegende rote feingranuläre Reaktionsprodukte gewertet. Progesteronrezeptoren sind aus-schließlich zellkerngebunden. Als positiv wurden in der Schnittebene des Kerns liegende, hell- bis dunkelbraune feingranuläre Reaktionsprodukte gewertet.

Die Anzahl positiv reagierender Zellen sowie deren Färbeintensität wurde subjektiv geschätzt und deskriptiv erfasst. Abschätzung und Wertung der immunhistologischen Befunde an den Corpora lutea wurden von zwei unabhängigen Gutachtern bestätigt.

Das eisenhaltige Pigment Hämosiderin, das infolge von Blutabbau in den Makrophagen und Epithelzellen liegen kann, ist auch in der Negativkontrolle als hellbraunes, granuläres Materi-al nachweisbar und kann somit von einer positiven immunhistologischen Reaktion eindeutig abgegrenzt werden.

Mit Annexin V gefärbte Schnitte wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop begutachtet. Da-bei zeigen apoptotische Zellen eine grüne oder blaue, nekrotische Zellen eine rote

Fluores-zenz. Erythrozyten erscheinen ebenfalls stets in roter FluoresFluores-zenz. Mit der TUNEL-Methode bearbeitete apoptotische Zellen und Erythrozyten fluoreszieren rot.

Zur Veranschaulichung und Lokalisationszuordnung wurde von jeder fotografierten Region ein dreidimensionales Reliefbild angefertigt.

3.1.6.6. Dokumentation

Zur Dokumentation der histologischen und immunhistologischen Untersuchungen stand ein Photomikroskop (Typ Axiocam MRc, Fa. Zeiss, Oberkochen) zur Verfügung. Die Fotos wur-den am PC mit dem Programm AxioVision 4 (Fa. Zeiss) bearbeitet und auf CD-ROM ge-brannt.