Histologische Beurteilung der H.-E.-gefärbten Schnittpräparate180

Bei der Entwicklung des histopathologischen Beurteilungssystems wurden die Empfehlungen von EATON (1999) berücksichtigt und nach dem erneuerten Sydney System für Gastritisdiagnostik in der Humanmedizin modifiziert (DIXON et al., 1996).

Hierbei steht die Standardisierung der Histologie durch eine einheitlich definierte Terminologie und präzise Beschreibung der Veränderungen im Vordergrund. Dabei empfehlen DIXON et al. (1996) die Benutzung einer visuellen Beurteilungstabelle, durch die eine Gradeinteilung von Entzündung, Aktivität, Anzahl monomorph-nukleärer Zellen, intestinaler Metaplasie und Atrophie vorgenommen werden soll.

EATON (1999) bezieht diese Kriterien ebenfalls in die Beurteilung der Helicobacter-assoziierten Histopathologie bei den verschiedenen Tiermodellen ein. Hier herrschen jedoch zum Teil andere Verhältnisse in der Magenschleimhaut als beim Menschen.

Zum Beispiel kann bei C57BL/6J-Mäusen eine durch neutrophile Granulozyten dominierte, sogenannte „Hintergrundentzündung“ („background inflammation“) unbekannter Ätiologie vorkommen, die bei der Auswertung der Histologie im H.

pylori-Infektionsversuch berücksichtigt werden sollte (EATON, 1999).Ferner treten bei der Maus verschiedene Arten des Gewebeverlusts während einer Gastritis auf (z.B. Ersatz des Drüsengewebes durch Entzündungszellen oder muköse Nebenzellen) (EATON, 1999). Sie werden fälschlicherweise als Atrophie bezeichnet, haben jedoch nichts mit der beim Menschen vorkommenden, H. pylori-assoziierten Atrophie der Magenschleimhaut gemeinsam, die als „Verlust des funktionellen Gewebes mit Ersatz durch Bindegewebe“ definiert wird (DIXON et al., 1996). Sowohl im H. felis- als auch im H. pylori-Mausmodell konnte letztere Art der Atrophie beobachtet werden (SAKAGAMI et al., 1996; LEE et al., 1997).

EATON (1999) schlägt weiter die genaue Beschreibung der Veränderungen durch Angabe von Art und Anzahl der Entzündungszellen (monomorphnukleäre versus polymorphnukleäre Zellen) in einem genau definierten Scoresystem vor. Ferner sollten Angaben über die Verteilung (multifokal oder diffus) und die Lokalisation (Lamina propria oder Tunica submucosa) der Infiltrate gemacht und morphologische

Veränderungen der Magenschleimhaut mit fester Definition wie Atrophie, Hyperplasie und Neoplasie genau beschrieben werden.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Punkte wurde in der vorliegenden Arbeit ein differenziertes Bewertungssystem entwickelt, dass eine möglichst objektive Einteilung des Entzündungscharakters, der Verteilung der Entzündung und des Entzündungsgrades (Anzahl der Entzündungsherde und -zellen) erlaubte (Kapitel 3.2.12.2). Die ausschließliche Berücksichtigung der Anzahl der Entzündungszellen in einem Scoresystem, wie es von JANKE (2000) angewandt wurde, geht auf Kosten einiger wichtiger Parameter, wie z. B. der Anzahl der Entzündungsherde und der Anteil von neutrophilen Granulozyten an den leukozytären Infiltrationen der Magenschleimhaut. Die separate Beurteilung des Aktivitätsgrades der diffusen und fokalen leukozytären Infiltration sowie der Anzahl der Entzündungsherde pro Schleimhautdrüsenregion erwies sich als sinnvoll, da hierbei statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Mausstämmen und Infektionsstatus herausgearbeitet werden konnten.

Die hohe Anzahl der statistischen Vergleiche bei der Auswertung der Einzel-parameter stellte allerdings einen Nachteil dieses Bewertungssystems dar.

Im Unterschied zu JANKE (2000) und LEE et al. (1997) konnte keine Zunahme der leukozytären Infiltrationen der Magenschleimhaut zwischen den Beobachtungsdauern beobachtet werden (Kapitel 4.5.1). In der vorliegenden Unter-suchung wiesen die Hp89-inokulierten Mäuse einen schwach signifikanten Rückgang der Anzahl der diffus verteilten Entzündungszellen in der Kardiadrüsenregion und der Summe der diffus verteilten Entzündungszellen in der Gesamtschleimhaut auf. Bei den HpSS1-inokulierten Mäusen ging die Herdanzahl sowie die Anzahl der daran beteiligten Entzündungszellen in Kardia- und Pylorusdrüsenregion statistisch schwach signifikant zurück. Die Ursachen hierfür sind unklar. Möglicherweise ist dies auf die Abnahme der Besiedlung mit HpSS1 zwischen dem 3. und 6. Infektionsmonat zurückzuführen.

Beim Vergleich der verschiedenen H. pylori-Isolate hatte HpSS1 nach 3-monatiger Beobachtungsdauer den größten Einfluss auf die histologischen

Entzündungs-parameter (Kapitel 4.6). Die HpSS1-inokulierten Tiere wiesen in den meisten Parametern die höchsten mittleren Werte auf. Durch die Anwendung der relativ strengen Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche in der Post-hoc-Analyse konnten jedoch nur wenige statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Infektionsstatus gesichert werden. Die Unterschiede zwischen den HpSS1-inokulierten Mäusen und den Hp87- bzw. Hp89-HpSS1-inokulierten Mäusen stellten jedoch häufig Trendbefunde dar. Unterschiede zwischen den HpSS1-inokulierten Mäusen und den PBS-Kontrollen konnten bei Einzelparametern signifkant gesichert werden und stellten bei anderen Einzelparametern ebenfalls Trendbefunde dar. Auch in anderen Untersuchungen (LEE et al., 1997; FERRERO et al., 1998; FOX et al., 1999; JANKE, 2000; SUTTON et al, 2000a; CHEN et al., 2001; MÄHLER et al., 2002) reichten die durch HpSS1 induzierten pathohistologischen Veränderungen aus, um signifikante Unterschiede zwischen den HpSS1-inokulierten Mäusen und den Kontrollmäusen darzustellen.

Die in dieser Studie erstmals eingesetzten H. pylori-Isolate Hp87 und Hp89 weisen zwar eine hohe Humanpathogenität auf, konnten jedoch im Mausmodell hinsichtlich der histopathologischen Veränderungen nicht überzeugen.

Von den HpSS1-inokulierten Mäuseinzuchtstämmen wiesen C3H/HeJ und C57BL/6J stärkere leukozytäre Infiltrationen der Magenschleimhaut nach 3-monatiger Be- obachtungsdauer auf als FVB/N (Kapitel 4.8), was mit den Beobachtungen von JANKE (2000) nach 4-monatiger Beobachtungsdauer im Wesentlichen überein- stimmt. In den vorliegenden Untersuchungen ließen sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mausstämmen sichern.

Die Bedeutung der Rolle von Wirtsfaktoren bei der Helicobacter-induzierten Gastritis wurde in anderen Studien unter Einsatz des HpSS1- (LEE et al., 1997; SUTTON et al., 2000a) bzw. des H. felis-Mausmodells (MOHAMMADI et al., 1996; SAKAGAMI et al., 1996; 1997; SUTTON et al., 1999) aufgezeigt. Einige Inzuchtstämme wie C57BL/6, C3H/He und SJL wiesen nach H. felis-Infektion hochgradige leukozytäre Infiltrationen und atrophische Veränderungen der Magenschleimhaut auf, andere Stämme (BALB/c, CBA/Ca und C3H/HeJ) reagierten mit nur milden Veränderungen ohne Atrophie (MOHAMMADI et al., 1996; SAKAGAMI et al., 1996; 1997; SUTTON

et al., 1999). Auch nach HpSS1-Infektion zeigten die Stämme C57BL/6, C3H/He und SJL eine signifikant stärkere Entzündungsreaktion als der Stamm CBA/Ca (SUTTON et al., 2000a).

Im Vergleich zu den Kontrolltieren wiesen die HpSS1-inokulierten Mäuse der eingesetzten Inzuchtstämme zumeist höhere mittlere Werte bei den einzelnen Entzündungsparametern auf (Kapitel 4.10). Für einzelne Parameter waren Unter-schiede zwischen den Infektionsstatus bei den Mausstämmen C3H/HeJ und C57BL/6J nach beiden Beobachtungsdauern statistisch schwach signifikant zu sichern.

Follikelähnliche Aggregationen wurden vor allem in der Magenschleimhaut HpSS1-inokulierter C3H/HeJ-Mäuse (15%) und Il10^tm1Cgn-Mäuse (20%) gefunden (Kapitel 4.3.7.3). JANKE (2000) konnte ähnliche Befunde bei den Stämmen C3H/HeJ (25%) und C3H/HeN (38,5%) erheben. Das Vorkommen dieser als MALTom-Vorläufer vermuteten, lymphoiden Strukturen in der Magenschleimhaut konnte sowohl bei experimentell mit Helicobacter infizierten Mäusen (ENNO et al., 1995; FOX u. LEE, 1997; WATANABE et al., 1998; EATON et al., 1999; SUTTON et al., 2000a) als auch bei chronisch H. pylori-infizierten Menschen (DIXON et al., 1995; PARSONNET et al., 1994) beobachtet werden.

Der Vergleich der leukozytären Infiltrationen der Magenschleimhaut zwischen den Defektmutanten und den jeweiligen Wildtypmäusen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede (Kapitel 4.11). Dies könnte an der Bedeutungslosigkeit der jeweiligen Genprodukte im HpSS1-Entzündungsgeschehen oder an einer Kompensierung des Fehlens dieser Genprodukte im HpSS1-Mausmodell liegen.

Im Vergleich zum inokulierten Wildtypstamm B10.BR wiesen die HpSS1-inokulierten B10.BR-Fas^lpr-Defektmutanten eine stärkere leukozytäre Infiltration der Magenschleimhaut auf, jedoch ohne statistische Signifikanz (Kapitel 4.11.1.3). In einer Studie mit HpSS1-inokulierten Fas-Ligand-defizienten Defektmutanten (auf C57BL/6J-Hintergrund) konnten nach 6 und 12 Wochen p. i. ebenfalls keine signifikanten Unterschiede im Entzündungsgrad der Magenschleimhaut im Vergleich zu den Wildtypen beobachtet werden (JONES et al., 2002).

Im Vergleich zu den HpSS1-inokulierten IL-10-Defektmutanten reagierten die HpSS1-inokulierten Wildtypen (C57BL/6J) mit geringeren leukozytären Infiltrationen der Magenschleimhaut. Unterschiede zwischen den Stämmen konnten allerdings nicht signifikant gesichert werden (Kapitel 4.11.3.2). Im Gegensatz zu anderen Untersuchungen (BERG et al., 1998; MÄHLER et al., 2002) konnte bei den Il10^tm1Cgn -Mutanten keine Hyperplasie der Magenschleimhaut festgestellt werden. Mögliche Ursachen für die Unterschiede könnten die Verwendung des H. felis-Mausmodells bei BERG et al. (1998) und ein späterer Untersuchungszeitpunkt (3 Monate versus 4 Monate) bei MÄHLER et al. (2002) sein.

Bei der Überprüfung des Einflusses einer H. pylori-Infektion auf das Entzündungsgeschehen im Dickdarm wiesen interessanterweise die B6.129P2-Il10^tm1Cgn-Kontrollmäuse im Zäkum eine schwach signifikant stärkere Entzündungsreaktion als die HpSS1-inokulierten B6.129P2-Il10^tm1Cgn-Mäuse auf (Kapitel 4.13). Untersuchungen im HLA-B27-transgenen Rattenmodell für CED zeigten, dass Bakterien nicht nur lokal im Gastrointestinaltrakt (GIT) wirken, sondern die Entstehung und Chronifizierung von Entzündungen auch an anderen Stellen des GIT beeinflussen können. So konnte eine Gastritis in HLA-B27 transgenen Ratten geheilt werden, indem die bakterielle Konzentration im Zäkum mittels Ausschluss des Organs vom fäkalen Strom vermindert wurde (RATH et al., 1999). Andersherum könnte auch eine Infektion mit H. pylori im Magen einen fördernden oder hemmenden Effekt auf die Entwicklung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen haben. Weitere Untersuchungen sind vonnöten, um diese Hypothese abzuklären.

Die HpSS1-inokulierten B6.129S7-Rag^tm1Mom-Mäusen wiesen im Vergleich zum HpSS1-inokulierten Hintergrundstamm geringere leukozytäre Infiltrationen der Magenschleimhaut auf. Statistisch signifikante Unterschiede konnten nicht gesichert werden (Kapitel 4.11.5.2). Im Unterschied dazu wiesen dieselben Defektmutanten im H. felis-Modell signifikant geringere leukozytäre Infiltrationen der Magenschleimhaut als die Wildtypmäuse auf (ROTH et al., 1999). Das adaptive Immunsystem spielt wahrscheinlich eine größere Rolle im H. felis- als im HpSS1-assoziierten Entzündungsgeschehen.

Die hier eingesetzten Defektmutantenstämme B6.129-Tnfrsf1a^tm1Mak und B6.129S7-Icam1^tm1Bay wiesen einen geringeren Entzündungsgrad der Magenschleimhaut als ihr Hintergrundstamm C57BL/6J auf, jedoch ohne statistische Signifkanz (Kapitel 4.11.4.2 und 4.11.6.2). In einer anderen Studie mit TNF-R1-defizienten Mäusen auf C57BL/6-Hintergrund wurde ebenfalls die TNF-R1-vermittelte Rolle von TNF-α im H.

pylori-Mausmodell untersucht. Hier konnte auch kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtypen und Defektmutanten im Grad der leukozytären Infiltration festgestellt werden (THALMAIER et al., 2002). Somit kann gefolgert werden, daß diese Mediatoren das Entzündungsgeschehen im HpSS1-Mausmodell nicht maßgeblich beeinflussen. Beim Menschen wurde eine gesteigerte Produktion von TNF-α und ICAM-1 im H. pylori-Infektionsgeschehen gezeigt (TALMADGE et al., 1988; HATZ et al., 1998; ARCHIMANDRITIS et al., 2000; MORI et al., 2000).

5.10.1 Charakter der Entzündung und Grad der Aktivität

H. pylori-assoziierte Gastritiden beim Erwachsenen zeichnen sich durch eine aktive Beteiligung neutrophiler Granulozyten am Entzündungsgeschehen aus (CRABTREE et al., 1994; DIXON, 1995; KELLEHER et al., 1997). Dieses Auftreten konnte auch im H. felis- (LEE et al., 1990; SAKAGAMI et al., 1996) sowie im H. pylori-Mausmodell (LEE et al., 1997; JANKE, 2000) beobachtet werden. Auch die hier eingesetzten H.

pylori-Stämme HpSS1, Hp87 und Hp89 konnten unterschiedlich starke Infiltrationen der Schleimhautdrüsenregionen mit neutrophilen Granulozyten bei den Mausstämmen hervorrufen. Hierbei existierten gleichfalls mausstammesspezifische Unterschiede.

Im zeitlichen Verlauf nahm der Aktivitätsgrad der diffusen und fokalen Entzündung der Magenschleimhaut bei den HpSS1-inokulierten Mäusen des ersten Versuchsblocks ab. Dies konnte im Pylorus (fokale Entzündung) schwach signifikant gesichert werden (Kapitel 4.5.1). In der Studie von LEE et al. (1997) hingegen zeigte sich bei HpSS1-inokulierten C57BL/6-Mäusen nach 3,5 Monaten eine milde chronische Gastritis, die im weiteren Verlauf (bis 8 Monate Beobachtungszeit) an

Schwere und Aktivität zunahm. Beim Menschen hängt die Dauer des „aktiven Stadiums“ der H. pylori-assoziierten Gastritis zum einen von der genetisch bedingten Immunantwort ab. Je nach wirtsspezifischer Immunmodulation wird die folgende chronische Gastritis mehr durch monomorphnukleäre oder polymorphnukleäre Zellinfiltrate bestimmt (DIXON, 1997; ERNST et al., 1997). Zum anderen spielt auch die Virulenz des jeweiligen H. pylori-Stammes eine entscheidende Rolle wie im Tierversuch gezeigt werden konnte (EATON et al., 2001; THALMAIER et al., 2002).

Bei der Untersuchung des Einflusses der H. pylori-Isolate auf die histologischen Entzündungsparameter war der höchste Aktivitätsgrad der fokalen Entzündung nach 3 Monaten in der Kardiadrüsenregion bei den Hp87-inokulierten Mäusen und in der Pylorusdrüsenregion bei den HpSS1-inokulierten Mäusen zu verzeichnen (Kapitel 4.6). Signifikante Unterschiede ließen sich bei der anschließenden Post-hoc-Analyse zwischen den jeweiligen Infektionsstatus nicht sichern. Unterschiede zwischen den HpSS1-inokulierten Mäusen und den Hp87-inokulierten Tieren bzw. den Kontrollmäusen in der Pylorusdrüsenregion stellten jedoch Trendbefunde dar.

Im zweiten Versuchsblock war die Beurteilung des Aktivitätsgrades der leukozytären Infiltrationen vor allem bei den Stämmen B6.129S7-Icam1^tm1Bay, B6.129P2-Il10^tm1Cgn und B6.129-Tnfrsf1a^tm1Mak im Vergleich zu den Wildtypen von Bedeutung. Sie weisen Mutationen in Genen auf, die für Entzündungsmediatoren kodieren und deren Bildung im H. pylori-Infektionsgeschehen beim Menschen gesteigert wird. Sie fördern unter anderem die Emigration neutrophiler Granulozyten in die Magenschleimhaut (TALMADGE et al., 1988; HATZ et al., 1998; ARCHIMANDRITIS et al., 2000; MORI et al., 2000). Dieser Zusammenhang wird durch die vorliegenden Untersuchungen unterstützt. So wiesen die HpSS1-inokulierten B6.129-Tnfrsf1a^tm1Mak-Mäuse geringere Aktivitätsgrade der diffus verteilten Entzündung pro Schleimhautdrüsen-region als die HpSS1-inokulierten Mäuse ihres Hintergrundstammes C57BL/6J auf;

dies konnte für die Kardiadrüsenzone statistisch signifikant gesichert werden (Kapitel 4.11.6.2). THALMAIER et al. (2002) konnten hingegen keine signifikanten Unterschiede im Aktivitätsgrad der Gastritis zwischen H. pylori-inokulierten Defekt-mutanten (TNF-R1-defiziente Mutanten auf C57BL/6-Hintergrund) und Wildtyp-mäusen nach 4-wöchiger Beobachtungszeit feststellen. Die Unterschiede im

Akti-vitätsgrad bei den gleichen Defektmutanten könnten an den unterschiedlichen Beob-achtungszeiten (1 versus 3 Monate) oder an einer unterschiedlichen Virulenz der eingesetzten H. pylori-Isolate (HpSS1 versus nicht näher benannte CagA/VacA-positive und -negative H. pylori-Isolate) liegen.

HpSS1-inokulierte B6.129P2-Il10^tm1Cgn-Mäuse zeigten einen signifikant geringeren Aktivitätsgrad der fokalen Entzündung in der Fundusdrüsenregion als die HpSS1-inokulierten Tiere des Hintergrundstammes C57BL/6J (Kapitel 4.11.3.2). In einer anderen HpSS1-Infektionsstudie (CHEN et al., 2001) wiesen IL-10-defiziente Mäuse nach 6-wöchiger Beobachtungszeit signifikant stärkere, überwiegend monomorph-nukleär dominierte Infiltrationen der Schleimhaut auf. Obwohl bei den Defekt-mutanten im Allgemeinen eine höhere Beteiligung neutrophiler Granulozyten zu beobachten war, konnten keine signifikanten Unterschiede im Aktivitätsgrad zwischen Defektmutanten und Wildtypen festgestellt werden. Der unterschiedliche genetische Hintergrund der IL-10-Defektmutanten bei CHEN et al. (segregierender 129/S6 x C57BL/6J-Hintergrund) und den vorliegenden Untersuchungen (C57BL/6J) sowie die unterschiedlichen Beobachtungszeiten (6 versus 12 Wochen) könnten mögliche Erklärungen für die unterschiedlichen Aktivitätsgrade sein.

Die HpSS1-inokulierten B6.129S7-Rag1^tm1Mom-Mäuse wiesen in der Pylorusdrüsen-region einen schwach signifikant höheren Aktivitätsgrad der fokalen Entzündung als die Wildtypmäuse auf (Kapitel 4.11.5.2). Dies bestätigt die Beobachtungen von BLANCHARD et al. (1995) im H. felis-Modell mit C.B-17-Prkdc^scid-Mäusen. Auch sie wiesen eine gesteigerte Infiltration der Magenschleimhaut mit unspezifischen Immun-zellen im Vergleich zu den Wildtypmäusen auf.

Beim Vergleich der Stämme B10.BR-Fas^lpr und B10.BR wiesen die Defektmutanten einen signifikant höheren Aktivitätsgrad der diffusen Entzündung in der Fundus-drüsenregion als die HpSS1-inokulierten Wildtypen auf (Kapitel 4.11.1.3). Eine Ursache hierfür könnte die chemotaktische Wirkung von Fas-Ligand auf neutrophile Granulozyten sein, dessen Exprimierung auf T-Lymphozyten während einer H. pylori-Infektion gesteigert wird (OTTONELLO et al., 1999). Untersuchungen von HOUGHTON et al. (2000) mit diesen Defektmutanten im H. felis-Modell zeigten insgesamt ein umgekehrtes Bild. Hier wiesen die Wildtypen eine stärkere Infiltration

der Magenschleimhaut mit neutrophilen Granulozyten als die Defektmutanten auf.

Ursachen für diese Unterschiede könnten an der Verwendung unterschiedlicher Tiermodelle (H. pylori versus H. felis) oder am unterschiedlichen genetischen Hintergrund (B10.BR versus C57BL/6) der Defektmutanten liegen.