Herstellung von HuH7-Zellen mit konstitutiver Expression von HBV Core- und P-Proteinen

Nach Generierung der HuH7-Zellen, die konstitutiv das WT-Coreprotein (HuH7-HBVcore^WT) bzw. die Core Mutante I126A (HuH7-HBVcore^I126A) exprimieren, wurden diese Zelllinien zusätzlich stabil mit dem Polymerasegen des HBV transduziert. Auf diese Weise sollte später das nur für die Hüllproteine codierende HBV-Genom (pSVHBV1.5core^-x^-pol^-; 4.2.1) funktionell transkomplementiert werden können.

Aufgrund der Tatsache, dass das WT Coreprotein bzw. die Core-Mutante I126A durch den Selektionsdruck von Zeocin konstitutiv in den HuH7-Zellen exprimiert wurden, musste die stabile Expression eines zweiten, mit dem Retrovirus-System transduzierten Gens unter Selektionsdruck eines anderen AB erfolgen. Daher wurde das zu transduzierende Polymerasegen in den Vektor pczCFG5 IEGN (2.3.2) integriert werden, da dieser eine Selektion über Geneticin erlaubte.

Mit Hilfe der zwei Oligonukleotide #424 und #425 wurde das vollständige P-Gen aus dem das ca. 1,5-fache HBV-Genom tragende Plasmid pRVHBV1.5 (2.5) amplifiziert.

Durch die Oligonukleotide wurde eine Kozak-Sequenz (GCC ACC; Kozak, 1986) vor das Start-Kodon des Gens eingefügt, sowie am 5’ und 3’ Ende des Amplifikats je eine

NruI-Restriktionsschnittstelle. Nach der PCR (3.4.4.5) wurde das 2570 bp große Amplifikat in den Vektor pDrive eingesetzt (3.4.5). Anschließend wurde das HBV Polymerasegen mittels NruI aus pDrive-HBVpol herausgeschnitten, der Vektor pczCFG5 IEGN mit SwaI linearisiert (3.4.4.1) und nach Dephosphorylierung des Vektors (3.4.4.4) die beiden Fragmente ligiert (3.4.4.2). Das resultierende Konstrukt pczCFG5 IEGN-HBVpol wurde anschließend zur Generierung von MuLV-Retroviren eingesetzt.

HEK-293T-Zellen wurden transient mit pczCFG5 IEGN-HBVpol, pczVSV-G wt und pHIT 60 kotransfiziert (3.3.4.3). Für die Positiv-Kontrolle wurde das parentale pczCFG5 IEGN mit pczVSV-G wt und pHIT 60 kotransfiziert, für die Negativ-Kontrolle erfolgte eine Kotransfektion ohne pczCFG5 IEGN. Nach Generierung der rekombinanten Retroviren wurden diese zu den zu transduzierenden HuH7-HBVcore^WT- (ZK 100.1) und HuH7-HBVcore^I126A- (ZK 70.2) -Zellen (4.2.2) gegeben (3.3.8). Zwei Tage nach der Transduktion wurden die jeweiligen ZK passagiert und das Kulturmedium mit je 600 µg/ml Geneticin und Zeocin versetzt. Damit konnten die Zellen selektioniert werden, die sowohl das P-Protein, als auch das WT Coreprotein bzw. die Core-Mutante I126A exprimierten. Da die HuH7-HBVcore^WT- und HuH7-HBVcore^I126A-Zellen bereits eGFP exprimierten, konnte keine direkte optische Auswertung der Transduktionseffizienz erfolgen. Aus diesem Grund wurden in einem Parallelansatz naive HuH7-Zellen ebenfalls mit den P-Proteingen tragenden Retroviren sowie der Positiv- und Negativ-Kontrolle transduziert und visuell mit Hilfe des Fluoreszenz-Mikroskops Axiovert 10 (Carl Zeiss Jena, Jena) ausgewertet (3.3.12).

Sowohl die HuH7-Zellen der Positiv-Kontrolle, als auch die HuH7-Zellen, die mit den Polymerasegen-tragenden Retroviren transduziert worden waren, zeigten deutliche Signale von exprimiertem eGFP. Die Zellen der Negativ-Kontrolle ließen hingegen keine vergleichbaren Signale erkennen (Daten nicht gezeigt). Ausgehend von dem Parallelansatz konnte angenommen werden, dass auch die Transduktion der beiden Zellklone HuH7-HBVcore^WT und HuH7-HBVcore^I126A erfolgreich war.

Zwei Wochen nach der initialen Zugabe des Geneticin-Zeocin-Gemisches wurden jeweils 40 Einzelzellklone steril in 96-Well-Platten überführt (3.3.9). Wöchentlich wurde das Medium gewechselt, wobei stets der Selektionsdruck durch die beiden AB (je 600 µg/ml) erhalten blieb. Nach 28 Tagen Inkubation wurden jeweils 20 Klone in

24-Well-Platten überführt. Die sechs am schnellsten gewachsenen und damit vitalsten Zellklone (ZK) wurden nach weiterer 14-tägiger Inkubation in 6-Well-Näpfe überführt und bis zum vollständigen Bewuchs des Napfbodens weiterkultiviert.

Der beste Nachweis für die Expression von funktionellen P-Proteinen und die Kontrolle für weiterhin bestehende Expression der beiden Coreproteine (WT und I126A) war die

‚endogene Polymerase Reaktion’ (3.4.6.2). Dazu wurden jeweils drei der sechs ZK in je zwei 6-Well-Näpfe überführt. Dies waren die ZK 4, 5 und 6 von den Zellen, die das WT Coreprotein und die Polymerase exprimierten und die ZK 1, 2 und 3 der Zellen, die zusätzlich zur Polymerase die Core-Mutante I126A produzierten. Während jeweils ein Napf untransfiziert blieb, wurde der zweite Napf eines jeden ZK mit pczCFG5 IEGZ-SVHBV1.5core^-x^-pol^- mit Hilfe von FuGENE (Roche Diagnostics, Mannheim) transfiziert (3.3.4.2). Als Positiv-Kontrollen wurden zum einen eine dreifach Transfektion von HuH7-Zellen mit pczCFG5 IEGZ-SVHBV1.5core^-x^-pol^-, pczCFG5 IEGZ-HBVcore^WT oder pczCFG5 IEGZ-HBVcore^I126A und pczCFG5 IEGN-HBVpol durchgeführt, zum anderen eine Transfektion des von den endogenen Promotoren regulierten HBV-Genoms (pRVHBV1.5; 2.5). Für die Negativ-Kontrollen wurde das Plasmid pczCFG5 IEGZ-SVHBV1.5core^-x^-pol^- alleine oder zusammen mit pczCFG5 IEGZ-HBVcore^WT, pczCFG5 IEGZ-HBVcore^I126A oder pczCFG5 IEGN-HBVpol in HuH7-Zellen transfiziert. Fünf Tage später wurden die Zellen lysiert (3.3.6) und die geklärten Lysate, sowie die Kulturüberstände mit anti-HBc bzw. anti-HBs immunpräzipitiert (3.4.8.1). Die Präzipitate wurden in die EPR eingesetzt (3.4.6.2).

Nach Isolierung der viralen DNA und Separation der Proben im TAE-Agarosegel wurden die radiaktiven Signale gesammelt und mit Hilfe des Phosphoimagers

‚Molecular Imager FX’ (Biorad, München) ausgewertet.

Abbildung 28: Ergebnisse der EPR-Auswertung der Coreprotein- und Polymerase- exprimierenden HuH7-Zellklone (a) 4, 5 und 6 (WT) sowie (b) 1, 2 und 3 (I126A) nach Transfektion mit dem Hüllprotein-exprimierenden HBV Genom.

P-Protein und WT Coreprotein (a) oder Core-Mutante I126A (b) exprimierende ZK wurden mit pczCFG5 IEGZ-SVHBV1.5core^-x^-pol^- (CXP^-) transfiziert. Als Kontrolle wurden HuH7-Zellen entweder mit dem Hüllprotein-exprimierenden HBV-Genom (CXP^-) alleine transfiziert oder kotransfiziert mit den Coreprotein (Core WT oder Core I126A)- oder Polymerase (Pol)-exprimierenden Vektoren. Als WT-Kontrolle wurde pRVHBV1.5 transfiziert (WT) und eine Funktionskontrolle der EPR stellten ca. 2 x 10⁶

Genom-äquivalente aus hochtitrigem, humanen Serum dar. Fünf Tage nach Transfektion wurden Nukleokapside aus Zelllysaten und Virionen aus Zellkulturüberständen immunpräzipitiert, in die EPR eingesetzt und autoradiographisch ausgewertet.

Abbildung 28 a) zeigt die EPR-Ergebnisse der Zellklone 4, 5 und 6 (WT), die mit dem Hüllprotein exprimierenden Genom transfiziert worden waren. Sowohl ZK 4 als auch ZK 5 waren in der Lage, zytosolische Nukleokapside zu generieren. Diese besaßen annähernd die gleiche Signalintensität wie die WT-Kontrolle (WT) und die Dreifach-Transfektion (Pol + Core WT + CXP^-). In der Zelllysat-Probe des ZK 6 hingegen zeigte sich, wie auch bei den drei Negativkontrollen, keinerlei Aktivität, was z.B. auf eine defekte Polymerase-Expression zurückzuführen sein könnte. Die linke Seite der Abbildung zeigt die Signale der Zellkulturüberstande. Hier waren bei den ZK 4 und 5 wie auch bei der Dreifach-Transfektion Signale von sezernierten Virionen zu sehen. In der Spur der WT-Kontrolle zeigte sich im Vergleich dazu ein schwächeres Signal.

Nachdem ZK 6 keine zytosolischen Nukleokapside generieren konnte, war dementsprechend auch kein Signal von Virionen zu detektieren. In Abbildung 28 b) sind die EPR-Ergebnisse der Proben der ZK 1 bis 3 (I126A) dargestellt. Alle drei Klone waren mit unterschiedlicher Effizienz in der Lage, Nukleokapside zu assemblieren.

Während ZK 2 und auch ZK 1 annähernd an die Signalintensität der Positiv-Kontrollen heranreichten, produzierte ZK 3 ein deutlich schwächeres Signal. Möglicherweise war bei diesem ZK die Polymerase-Expression beeinträchtigt. Auf der linken Seite der Abbildung zeigten sich bei den ZK der umhüllungsdefizienten Mutante I126A wie erwartet keine Signale von sezernierten Virionen. Nur die WT-Kontrolle besaß die Kompetenz, Nukleokapside zu umhüllen und ins Medium zu sezernieren.

Es zeigte sich, dass es möglich war, zwei (ZK 4 und ZK 5) der drei WT Core- und P-Protein exprimierenden ZK (HuH7-HBVcore^WT-pol) durch Hüllproteine in trans zu komplementieren. Bei den ZK der HuH7-Zelllinien, die die Core-Mutante I126A und die Polymerase exprimierten (HuH7-HBVcore^I126A-pol), konnte gezeigt werden, dass erwartungsgemäß keiner der drei ZK in trans komplementiert wurde, da die Umhüllung mit WT LHBs durch die Core-Mutante blockiert worden war. Es wurden aber funktionelle zytosolische Kapside nachgewiesen, was zeigte, dass das eingebrachte HBV-Genom verpackt werden konnte. Für weitere Versuche wurden ZK 4 (HuH7-HBVcore^WT-pol) und ZK 2 (HuH7-HBVcore^I126A-pol) verwendet.