DNA-Nachweismethoden

3.4.6.1 Southern-Blot (SOUTHERN, 1975)

Mit Hilfe des Southern-Blots wurde virale DNA aus Nukleokapsiden auf eine Nylonmembran übertragen, dort fixiert und nachgewiesen.

3.4.6.1.1 DNA-Isolierung und Gelelektrophorese

HBV-Nukleokapside aus Zelllysaten (3.3.6) wurden zunächst immunpräzipitiert (3.4.8.1) und anschließend die verpackten viralen Nukleinsäuren isoliert (3.4.6.3). Die erhaltenen getrockneten DNA-Pellets wurden in 13 µl 1 x Probenauftragspuffer I (2.12) resuspendiert und über ein TAE-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (3.4.2.6). Als Größen- und Positivkontrolle wurden 50 - 100 pg eines 3,2 kb großen, mit EcoRV geschnittenen HBV-Fragments in einer parallelen Spur aufgetragen. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel zweimal für 15 min. in Denaturierungs-Puffer (2.12) geschwenkt, um für die spätere Hybridisierung der Sonde die Doppelstränge der DNA voneinander zu trennen.

3.4.6.1.2 DNA-Transfer auf eine Nylonmembran

Der DNA-Transfer aus dem Agarosegel erfolgte mittels Kapillarblot über Nacht auf die positiv geladene Nylonmembran Hybond-N+, die eine Porengröße von 0,45 µm besaß (Amersham Biosciences, Freiburg; 2.15). Dabei wurde durch die Blotting-Vorrichtung ein Flüssigkeitsstrom erzeugt, der die von der Pufferlösung (Denaturierungs-Puffer;

2.12) mitgetragene denaturierte DNA durch das Agarosegel auf die Membran beförderte. Nach dem Blotten wurde die DNA-tragende Nylonmembran zweimal für 15 min. in Neutralisations-Puffer (2.12) geschwenkt. Anschließend wurde die Membran kurz getrocknet und die DNA-Fragmente für eine Minute mit 125 mJ/cm² durch UV-Licht im Hoefer UVC500 UV Crosslinker (Amersham Biosciences, Freiburg) auf die Membran fixiert. Die Membran wurde nun bis zur Hybridisierung trocken und lichtgeschützt gelagert.

3.4.6.1.3 Herstellung der mit alkalischer Phosphatase markierten Sonde

Zum Nachweis der HBV-DNA wurde als Sonde das vollständige HBV Genom aus dem Plasmid pRVHBV1.5 (2.5) mit Hilfe von EcoRV ausgeschnitten (3.4.4.1) und aufgereinigt (3.4.2.4). Die Herstellung von etwa 100 ng Sonde erfolgte nach der Vorgabe des Herstellers mit dem ‚AlkPhos Direct Labelling Reagents’ Kit (Amersham

Biosciences, Freiburg). Dabei wurde eine thermostabile alkalische Phosphatase (AP) an die HBV-DNA-Sonde gekoppelt, die nach der Hybridisierung an die Proben-DNA (3.4.6.1.4) mit Hilfe des ‚CDP-Star Detection Reagents’ (Amersham Biosciences, Freiburg; 2.15) über Chemiluminiszenz nachgewiesen werden konnte.

3.4.6.1.4 Hybridisierung

Für die Hybridisierung der Proben-DNA mit der AP-markierten HBV-Sonde wurde zunächst der im ‚AlkPhos Direct’-Kit vorhandene Hybridisierungspuffer mit NaCl und Blocking Reagenz bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M bzw. 4 % (w/v) supplimiert und bei 65°C unter Rühren suspensiert. Die Membran wurde mit der DNA-fixierten Seite nach innen in eine Hybridisierungsröhre überführt und mit 0,125 ml/cm² Membranfläche supplimierten Hybridisierungspuffer mindestens 30 min. bei 65°C unter Rotieren im Hybridisierungsofen (Hybaid, Heidelberg) präinkubiert. Anschließend wurde die AP-markierte HBV-Genom-Sonde zu der Prähybridisierungslösung gegeben und üN zur Hybridisierung bei 65°C drehend inkubiert. Während dieser Zeit sollte genügend Sondenmaterial an die auf der Membran fixierte, zur Sonde komplementären Proben-DNA hybridisiert haben, um ein nachweisbares Signal zu generieren.

3.4.6.1.5 Detektion der Sonde

Die Membran in der Hybridisierungsröhre wurde zunächst dreimal für 15 min. mit frisch angesetztem, auf 65°C temperierten Waschpuffer A (2.12) gewaschen (2 - 5 ml/cm²). Anschließend erfolgten zwei weitere Waschschritte für jeweils 10 min.

mit Waschpuffer B (2.12) in einer Plastikschale bei RT auf dem Horizontal-Schüttler (GFL, Burgwedel). Die Detektion der AP-markierten Sonde erfolgte durch Inkubation der noch feuchten Nylonmembran für 2 - 5 min mit 30 - 40 µl/cm² ‚CDP-Star detection reagents’ (2.13). Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit von der Membran durch Abtropfen entfernt, die Membran in einen Hybridisierungsbeutel (Hybridization Bag, GIBCO BRL) eingeschweißt und in einer Gelkassette mit Röntgenfilm (Kodak BioMax

MR Film, MR-1; Sigma, Steinheim) inkubiert. Die Exposition erfolgte über einen Zeitraum von 5 - 60 min., bevor der Röntgenfilm entwickelt wurde (3.4.6.1.6).

3.4.6.1.6 Entwicklung von Röntgenfilmen

Die Entwicklung der Röntgenfilme (Kodak BioMax MR Film, MR-1; Sigma, Steinheim) erfolgte in der Dunkelkammer. Zunächst wurde der Röntgenfilm für 2 min.

in ein ‚Entwickler’-Bad (2.16) getaucht, dem sich eine kurze Inkubation in einem Stoppbad (5%-ige Essigsäure) anschloss. Anschließend wurde der Film für 2 min. in eine Fixierungslösung (2.16) gegeben, bevor er mit H2Obidest gut gewässert wurde.

Letztendlich wurde der Film bei Raumtemperatur getrocknet.

3.4.6.2 Nachweis von HBV-DNA mittels der ‚endogenen Polymerase Reaktion’

Die in viralen Nukleokapsiden und Virus-Partikeln vorhandene endogene virale Polymerase gestattet nach Zugabe von in α-Stellung mit ³²P radioaktiv markierten Nukleotiden einen Nachweis der HBV-DNA. Während der ‚endogenen Polymerase Reaktion’ (EPR) werden diese Nukleotide von der viralen Polymerase zur Verlängerung des inkompletten (+)-Stranges des partiell doppelsträngigen HBV-Genoms benutzt, welches dadurch radioaktiv markiert wird und mit entsprechenden Methoden nachweisbar ist. Gleichzeitig dient dieses Verfahren sowohl als indirekter Nachweis für eine funktionelle Polymerase, als auch für intakte Nukleokapside.

Zunächst wurden Nukleokapside aus Zelllysaten (3.3.6) und Virionen aus Zellkultur-überständen von HBV-transfizierten HuH7-Zellen immunpräzipitiert (3.4.8.1). Nach einem Waschschritt mit PBS und anschließender Zentrifugation wurde das Sepharosepellet mit Hilfe einer dünnen Pasteurpipette restlos von Flüssigkeitsresten befreit.

Die radioaktive Markierung des HBV-Genoms wurde durch Zugabe von α³²P-dCTP (2.11) erreicht, das zu den anderen Nukleotiden dGTP, dATP und dTTP (2.6) in den Reaktionsansatz zugegeben wurde. Der Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 50 µl setzte sich folgendermaßen zusammen:

2 x inc. Polymerase-Puffer (2.12) 25 µl

1 M MgCl2 1 µl

10 % (v/v) ß-Mercapto-Ethanol 0,5 µl

10 % (v/v) NP40 2,5 µl

30 mM dATP-dGTP-dTTP-Gemisch 2 µl α³²P-dCTP (10 µCi/µl) 1 µl

H₂O_bidest 18 µl

Nach Zugabe des Reaktionsansatzes zu den Sepharosepellets erfolgte eine Inkubation über Nacht bei 37°C, in deren Verlauf die radioaktiv markierten Nukleotide in das virale, partiell doppelsträngige Genom eingebaut wurden. Anschließend wurde die DNA aus den Proben isoliert (3.4.6.3), nach dem Trocknen in 13 µl 1 x Probenauftragspuffer I aufgenommen und auf ein 1 %-iges TAE-Agarosegel (ohne Ethidiumbromid) aufgetragen. Nach erfolgter Auftrennung der DNA wurde das Gel auf Whatman-Papier überführt und im Geltrockner (Biotec Fischer, Reiskirchen) unter Vakuum und Hitze getrocknet. Die radioaktiven Signale der markierten HBV-DNA wurden dann für 10 bis 24 h, zum Teil auch länger, in einer Gelkassette auf einem Kodak-Screen (Biorad, München, 3.1.8) gesammelt. Ausgewertet wurden die Signale mit Hilfe des Phosphoimagers ‚Molecular Imager FX’ und der Software ‚Quantity One 4.3.0 Build 019’ (Biorad, München).

3.4.6.3 DNA-Isolierung aus angereicherten Nukleokapsiden und Virionen

Nukleokapside aus Zelllysaten (3.3.6) und Virionen aus Zellkulturüberständen wurden mittels Immunpräzipitation (3.4.8.1) angereichert, bevor die HBV-DNA isoliert wurde.

Das Ausgangsvolumen betrug 50 µl aus einem EPR-Ansatz (3.4.6.2), oder das Sepharosepellet wurde mit PBS/2x inc. Polymerase-Puffer (1:1) auf 50 µl aufgefüllt.

Zunächst wurde die DNA, die außerhalb der Kapside vorhanden war, enzymatisch mit Hilfe von DNase I entfernt, um unspezifische Signale zu minimieren. Dafür wurde für jede Probe folgender Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 20 µl hergestellt, zu dem 50 µl Ausgangsvolumen hinzupipettiert und für 30 min. bei 37°C inkubiert wurden:

DNase I (10 mg/ml) 0,5 µl 2x inc. Polymerase-Puffer 10 µl

H₂O_bidest 9,5 µl

Um an die Nukleinsäure im Inneren der Kapside zu gelangen, schloss sich eine Proteinase K-Inkubation an, während der die Nukleokapsid-Proteine gespalten und die DNase I inaktiviert wurden. Es wurden hierfür pro Ansatz die folgenden Komponenten vorgemischt und gemeinsam zu den Proben pipettiert:

2x Proteinase K-Puffer 65,1 µl Proteinase K (10 mg/ml) 4,2 µl

t-RNA (10 mg/ml) 0,7 µl

Wieder wurden die Proben für 30 min. bei 37°C inkubiert. Um die DNA aufzureinigen, erfolgte eine Extraktion mit einem Volumen Phenol/Chloroform (3.4.2.1). Die wässrigen Phasen der Proben wurden zweimal mit dem 2,75-fachen Volumen 96 % Ethanol/10 M Ammoniumacetat (10:1) für jeweils 15 min. bei -20°C gefällt (3.4.2.2) und anschließend jeweils für 15 min. bei 14.000 rpm bei RT abzentrifugiert.

Zwischen den Fällungen wurde das DNA-Pellet in 100 µl TE-Puffer resuspendiert.

Nach der abschließenden Zentrifugation wurde das DNA-Pellet bei 37°C im Heizblock getrocknet und in 13 µl 1 x Probenauftragspuffer (2.12) aufgenommen.