Generierung der Coreprotein-Mutanten

An den zehn ausgewählten Positionen wurden insgesamt 56 AS-Substitutionen vorgenommen, wobei die Auswahl der Substituenten für jede Position unterschiedlich war. Generell wurde darauf geachtet, dass die eingesetzten AS-Reste ein möglichst breites Spektrum an Eigenschaften wie Ladung, Struktur oder Polarität abdeckten. Mit Hilfe dieser Mutanten sollten die benötigten Eigenschaften der mutierten AS-Positionen hinsichtlich der Umhüllungskompetenz sowie der Kapsidassemblierung ermittelt werden können.

Die Expression der Coreproteine erfolgte mit Hilfe des Vektors pSVcore (2.5), der nach Transfektion von HuH7-Zellen unter Kontrolle des SV40-early-Promoters große Mengen Coreprotein exprimiert. Mit der Expression von Coreproteinen alleine wäre nur getestet worden, inwieweit die Mutanten zur Bildung von Kapsiden fähig sind, nicht aber die Funktionalität in Hinblick auf die vollständige virale Morphogenese. Um dies

mit den verschiedenen Core-Mutanten in vitro testen zu können, mussten alle weiteren benötigten HBV-Proteine und Nukleinsäuren in der Zellkultur gleichzeitig in trans produziert werden. Dies erfolgte mit Hilfe des Plasmids pSVHBV1.5core^- (2.5), welches die ca. 1,5-fache Kopie des viralen Genoms trägt und bis auf das Coreprotein alle viralen Proteine und Nukleinsäuren zur Verfügung stellt. Die Kotransfektion mit dem Coreprotein-Expressionsvektor war nötig, da die Sequenz des Coregens im Genom funktionell doppelt belegt ist (Polyadenylierungssignal, DR1 und N-terminaler Bereich der Polymerase) und deshalb in pSVHBV1.5 (2.5) selbst keine Mutationen in das Gen eingeführt werden konnten.

Die Substitutionen der AS wurden in vitro mittels PCR-Mutagenese durchgeführt. Dazu war es nötig, ein bis drei Basen des Coregens auszutauschen, um das gewünschte, für die neue AS kodierende Basentriplett zu generieren. Die Mutagenese bestand aus drei PCR-Schritten (3.4.4.5), der Ligation des PCR-Fragments über BamHI und BspEI in den Expressionsvektor (3.4.4.2) und der anschließenden Sequenzierung des Coregens (3.4.3).

Die erste PCR wurde mit dem flankierenden Oligonukleotid #177, welches 5’ vor dem Coregen hybridisiert, und dem entsprechenden Mutagenese-Oligonukleotid durchgeführt, wenn die zu mutierende Position im N-terminalen Bereich des Coregens lag. Befand sich die Mutationsstelle C-terminal, wurde das Oligonukleotid #178, welches 3’ vom Coregen bindet, zusammen mit dem jeweiligen Mutagenese-Primer zur Amplifikation verwendet. Wenn sich die zu mutierende AS-Position im distalen 3’-Bereich des Coregens und dadurch hinter der BspEI-Schnittstelle befand, wurde das Oligonukleotid #244 anstelle von #178 verwendet. Dieses hybridisierte ca. 500 bp stromabwärts des Coregens und bot so die Möglichkeit, die Schnittstelle der REN BstEII für die anschließende Klonierung zu verwenden.

Abb. 16: Schematische Darstellung der Herstellung der Core-Mutanten mit den Oligonukleotiden #177 und #178.

Die Matrize der ersten PCR war der Expressionsvektor pSVcore. Zusammen mit einem flankierenden Oligonukleotid (#177 oder #178 / #244) und dem jeweils benötigten Mutagenese-Primer wurde ein Fragment hergestellt, das nach Auftrennung über ein Agarosegel (3.4.2.6) und anschließender Aufreinigung aus dem Gel (3.4.2.4) als mutationstragender Megaprimer in die zweite PCR eingesetzt werden konnte. Auch in der zweiten PCR diente pSVcore wieder als Matrize. Während dieser Amplifikation wurde, je nachdem welcher flankierende Primer in der ersten PCR eingesetzt wurde, der 5’- oder 3’-fehlende Teil des Coregens mit Hilfe des zweiten flankierenden Oligonukleotids an den Megaprimer angehängt. Das entstandene Fragment wurde

wiederum über ein Agarosegel aufgereinigt und einer dritten PCR mit den Oligonukleotiden #177 und #178 (oder #244) unterzogen.

Die Einsetzung des aufgereinigten, mutationstragenden Fragments in den Expressionsvektor erfolgte über die REN BamHI und BspEI (oder BstEII), wobei der Vektor vor der Ligation dephosphoryliert wurde (3.4.4.2; 3.4.4.4). Dabei erfolgte letztendlich ein Austausch eines 439 bp (oder 932 bp) großen Teils von pSVcore (Sequenzbereich 1833 bp - 2272 bp [oder 1340 bp - 2272 bp]) mit einem Fragment, das bis auf die Mutation identisch war (bezeichnet als Core^Mut). Nach erfolgter Ligation, Transformation und analytischer DNA-Präparation wurden die Mutanten mit den Oligonukleotiden #150 und #244 sowohl auf die eingeführte Mutation, als auch auf die ordnungsgemäße Gesamtsequenz hin untersucht (3.4.3). Dabei zeigte sich, dass die gewünschten Mutationen in ca. 80 % der generierten Plasmide enthalten waren, während nicht intendierte Mutationen in ca. 30 % vorlagen. Als letzter Schritt erfolgte schließlich die Präparation der DNA im präparativen Maßstab (3.4.1.3 und 3.4.1.4).

Alle erstellten Coremutanten sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tab. 12: Zusammenfassung der hergestellten Coremutanten, sowie deren Eigenschaften und Lage im Coreprotein

Position Phänotyp Ala-Mutante

Lage im Coreprotein

Substituent Eigenschaften des Substituenten

T polar, hydrophil

G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein I unpolar, hydrophob, aliphatisch H basisch, polar, hydrophil, aromatisch

S17 K+/V- Helix α1

D sauer, polar, hydrophil T polar, hydrophil

G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein I unpolar, hydrophob, aliphatisch S21 K+/V+ zwischen

Helix α1 und α2a

H basisch, polar, hydrophil, aromatisch G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein

I unpolar, hydrophob, aliphatisch D22 K+/V+ zwischen

Helix α1 und

α2a H basisch, polar, hydrophil, aromatisch D sauer, polar, hydrophil

G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein I unpolar, hydrophob, aliphatisch N90 K+/V+ zwischen

Helix α4a und α4b

S polar, hydrophil, klein

V unpolar, hydrophob, aliphatisch G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein

I unpolar, hydrophob, aliphatisch

L95 K+/V- Helix α4b

S polar, hydrophil, klein

H basisch, polar, hydrophil, aromatisch R basisch, polar, hydrophil

L unpolar, hydrophob, aliphatisch G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein

S polar, hydrophil, klein

K96 K+/V- Helix α4b

D sauer, polar, hydrophil

H basisch, polar, hydrophil, aromatisch K basisch, polar, hydrophil

D sauer, polar, hydrophil

L unpolar, hydrophob, aliphatisch

R98 K+/V+ Helix α4b

Q polar, hydrophil

G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein V unpolar, hydrophob, aliphatisch W unpolar, hydrophob, aromatisch

S polar, hydrophil, klein K basisch, polar, hydrophil

F122 K+/V- Helix α5

Y polar, hydrophob, aromatisch

V unpolar, hydrophob, aliphatisch L unpolar, hydrophob, aliphatisch M unpolar, hydrophob

G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein F unpolar, hydrophob, aromatisch P unpolar, hydrophob

W unpolar, hydrophob, aromatisch Y polar, hydrophob, aromatisch

S polar, hydrophil, klein T polar, hydrophil C polar, hydrophil Q polar, hydrophil

I126 K+/V- Helix α5

N polar, hydrophil K basisch, polar, hydrophil

H basisch, polar, hydrophil, aromatisch L unpolar, hydrophob, aliphatisch G unpolar, hydrophob, aliphatisch, klein D sauer, polar, hydrophil

R127 K+/V- Helix α5

S polar, hydrophil, klein

4.2.3 Nachweis der Umhüllungskompetenz mittels ‚endogener Polymerase