3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1. Material und Methoden
3.1.3. Tierhaltung und Tierfütterung
Als Spendertiere für die Entnahme des Panseninhaltes zur Beschickung des Rusitec-Systems dienten zwei ausgewachsene weibliche Schafe mit je einer Pansenfistel. Die Schafe wurden gemeinsam in einem Laufstall auf Stroheinstreu gehalten. Die Tiere wurden drei Wochen vor Versuchsbeginn mit Heu und Kraftfutter gefüttert, Wasser und Salzlecksteine standen ad libitum zur Verfügung. In dieser Adaptations-Phase wurde das gleiche Heu und Kraftfutter, wie in den In-vitro-Versuchen verwendet.
3.1.4. Entnahme des Panseninhalts
Zu Beginn eines jeden Versuchsdurchgangs wurden jedem Spendertier ca. 3,4 l Pansensaft mit einer großlumigen Kunststoffspritze und ca. 360 g fester Panseninhalt, der beim Filtrieren als Rückstand gewonnen wurde, über die Fistel entnommen. Der Pansensaft wurde durch zwei Lagen sterile Gaze filtriert. Der so entnommene Pansensaft von zwei Schafen wurde durchmischt und bei 39 °C im Wasserbad aufbewahrt.
3.1.5. Vorbereitung der Versuchsfuttermischung
Für die In-vitro-Untersuchungen im Rusitec-System wurde als Versuchsfutter Heu und Kraftfutter für Schafe verwendet (Tab. 11). Es kam Heu aus der Charge zum Einsatz, mit dem auch die Spendertiere gefüttert wurden. Das Heu wurde jeweils vor Versuchsbeginn manuell auf eine Länge von ca. 1 cm geschnitten und bei Raumtemperatur gelagert. 5 g kleingeschnittenes Heu und 4 g Kraftfutter wurden in einen zuvor autoklavierten Nylonbeutel eingewogen. Der Futterbeutel wurde mit einem Kabelbinder verschlossen und bis zum Einsatz in das Rusitec-System in einem Exsikkator gelagert. Die hier verwendeten Nylonbeutel waren 7 x 16 cm groß, das Nylongewebe (LINKER KG, Kassel) hatte eine Porenweite von 150 µm.
Tab. 11: Rohnährstoffgehalt des Heus und des Kraftfutters (%)
TS XP XL XF NfE XA
Heu 93,94 7,27 0,88 27,59 46,01 6,13
Kraftfutter 90,48 15,96 2,32 10,49 43,36 8,83
Die Futteranalyse wurde am Institut für Tierernährung und Ernährungsphysiologie der Georg-August-Universität Göttingen durchgeführt.
3.2. Versuchsdurchführung und Versuchsansätze
3.2.1. Untersuchungen mit Topinamburmehl
Für die Untersuchungen wurde ein kommerzielles Topinamburmehl eingesetzt, das freundlicherweise von der Fa. LAH, Cuxhaven, zur Verfügung gestellt wurde. Die In-vitro-Untersuchungen mit Topinamburmehl im Rusitec-System wurden mit sechs Fermentationssbehältern durchgeführt. Die Versuchsansätze lassen sich in zwei Versuchsreihen gliedern. Jede Versuchsreihe dauerte 19 Tage. Nach einer 8-tägigen Äquilibrierung des Systems, während der in allen Fermentationssbehältern Steady-State-Bedingungen erreicht wurden, folgte eine Kontrollphase, die 5 Tage dauerte. Die letzten 6 Tage stellten die Versuchsphase dar, in der täglich Topinamburmehl appliziert wurde. In der 5-tägigen Kontrollphase und der 6-tägigen Versuchsphase wurden Proben entnommen, um den Einfluss steigender Dosierungen von Topinamburmehl auf den mikrobiellen Stoffwechsel zu bestimmen.
In Versuchsreihe I diente ein Fermenter (A) ohne Topinamburmehl-Zulage als Kontrolle. Den anderen fünf Fermentern (B bis F) wurde Topinamburmehl in der Reihe der Dosierungen 0,2;
0,4; 0,6; 0,8 und 1,0 g/d zugesetzt. Tabelle 8 zeigt die Zusammensetzung der in der Versuchsreihe I verwendeten Pufferlösung.
In Versuchsreihe II wurden die sechs Fermenter in zwei Gruppen unterteilt. Der ersten Gruppe von drei Fermentern (A, B und C) wurde 1,0 g/d Topinamburmehl zugesetzt, während die zweite Gruppe (D, E und F) eine Zulage von 2,0 g/d Topinamburmehl erhielt. Die Tabelle 9 stellt die Komponenten der in der Versuchsreihe II eingesetzten Pufferlösung dar.
Tab. 12: Ablauf der Versuchsdurchgänge und untersuchte Parameter bei Zugabe von Topinamburmehl
Phase Versuchstag Parameter Zugaben
(SCFA = short chain fatty acids, VQ = Verdaulichkeit der organischen Substanz)
3.2.2. Untersuchungen mit Saccharomyces boulardii
Ziel der Versuche war es, anhand von vier Versuchsreihen den Einfluss lebender und autoklavierter Hefen in verschiedenen Dosierungen auf Stoffwechselparameter des Pansens mit dem System darzustellen. Die In-vitro-Untersuchungen wurden mit dem Rusitec-System mit neun Inkubationsgefäßen durchgeführt. Jede Versuchsreihe dauerte 16 Tage. Die ersten 8 Tage dienten der Äquilibrierung. In dieser Phase erfolgte eine Adaptation der Pansenflora an die Rusitec-Verhältnisse, so dass in allen Fermentern ähnliche Bedingungen herrschten. Die nächsten 8 Tage stellten die eigentliche Versuchsphase dar, in der die Proben entnommen wurden, um die Messgrößen des Pansenstoffwechsels zu bestimmen.
Ziel der Versuchsreihe 1 war es, die Auswirkungen der lebenden Hefe S. b. bei zwei unterschiedlichen Dosierungen auf die Messgrößen des mikrobiellen Pansenstoffwechsels zu bestimmen. In der eigentlichen Versuchsphase wurden die neun identisch aufgebauten Inkubationsgefäße in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe war die Kontrolle, in der zweiten Gruppe erfolgte eine tägliche Zugabe von 500 mg der lebenden Hefe und in der dritten Gruppe wurden täglich 1500 mg der lebenden Hefe zugegeben. Dieser Versuchsansatz wurde in der Versuchsreihe 3 wiederholt. Die Versuchsreihen 2 und 4 fanden unter gleichen Bedingungen wie die Versuchsreihen 1 und 3 statt. Es wurden aber anstelle der lebenden Hefen autoklavierte Hefen zugesetzt.
Tab. 13: Ablauf der Versuchsdurchgänge und untersuchte Parameter beim Hefestamm S. b.
Phase Versuchstag Parameter Zugaben
Äquilibrierungsphase 1 – 8 pH, Redoxpotential ---
Versuchsphase
9
10
11
12
13
14
15
16
pH
Redoxpotential
NH3-N
SCFA
VQ
MPS
Ab Tag 8:
¾ 15N über Pufferlösung in Fermentationsbehälter
(A-I)
¾ 500 mg lebende Hefe / autoklavierte Hefe Fermentationsbehälter
(D-F)
1500 mg lebende Hefe / autoklavierte Hefe Fermentationsbehälter
(G-I)
(SCFA = short chain fatty acids, VQ = Verdaulichkeit der organischen Substanz, MPS = mikrobielle Proteinsynthese)
3.2.3. Inaktivierung der Hefen
Die lebenden Hefen wurden bei 121 °C und 2,1 atm. (≈213 kPa) für 30 Minuten im Autoklaven (Varioklav Dampfsterilisator, Typ 250, H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim) autoklaviert. Danach wurden sie für 1 Stunde bei 50 °C im Trockenschrank getrocknet. Die Überprüfung der Inaktivierung wurde auf folgende Weise durchgeführt:
10 mg der autoklavierten Hefe wurden in ein steriles Röhrchen (Falcon 2059, 14 ml, 17 x 100 mm, Becton Dickinson Labware, New Jersey) eingewogen. Dazu wurden 5 ml YPD-Flüssigmedium (Tab. 14) gegeben. Das Röhrchen wurde für 16 Stunden bei 30 °C und 200 rpm mit Luftzufuhr über den Deckel des Röhrchens auf dem Schüttelinkubator (GFL Shaking Incubator 3031, Burgwedel) bebrütet. Nach der Inkubation wurden zuerst 100 µl der Suspension auf YPD-Agar-Platten (Tab. 15) ausgestrichen und danach wurde die restliche Suspension für 10 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert (GS-15R, BECKMAN-COULTER, München). Das gewonnene Pellet wurde in 100 µl Flüssigmedium resuspendiert und die gesamte Menge ebenfalls auf einer YPD-Platte ausgestrichen. Der zweite Ansatz war somit 50-mal konzentrierter als der erste Ansatz. Beide Platten wurden für 3 Tage bei 30 °C im Brutschrank inkubiert. Auf beiden Platten zeigte sich am Ende der dreitägigen Inkubation kein Wachstum der Hefe.
Zum Vergleich wurden 10 mg nicht-autoklavierte Hefe in ein steriles Röhrchen eingewogen und mit 5 ml YPD-Flüssigmedium suspendiert. Das Röhrchen wurde ebenfalls 16 Stunden bei 30 °C und 200 rpm auf dem Schüttelinkubator bebrütet. Von der Suspension wurden drei Verdünnungsstufen (1:100; 1:1000; 1:10000) erstellt und von jeder Verdünnungsstufe wurden 100 µl auf YPD-Platten ausgestrichen. Auch diese Platten verblieben für 3 Tage bei 30 °C im Brutschrank. Bei allen Verdünnungsstufen ließ sich ein Wachstum von Hefekolonien nachweisen.
Tab. 14: Zusammensetzung von YPD-Flüssigmedium
Hefeextrakt 2 g
Bactopeptone 4 g
Dextrose (Glukose) 4 g
Aqua dest. 200 ml
Das Flüssigmedium wurde bei 121 °C für 20 min. autoklaviert und danach bei Raumtemperatur gelagert.
Tab. 15: Zusammensetzung von YPD-Agar
Hefeextrakt 4 g
Bactopeptone 8 g
Dextrose (Glukose) 8 g
Bactoagar 8 g
Aqua dest. 400 ml
Der Ansatz wurde bei 121 °C für 20 min. autoklaviert und der Agar als Platte bei + 4 °C gelagert.
3.3. Analytik
Jeder Versuchsdurchgang dauerte 16 Tage bei der Hefe bzw. 19 Tage bei dem Präbiotikum.
Zu Anfang stand bei allen Ansätzen eine 8-tägige Äquilibrierungsphase, in der täglich der pH-Wert und das Redoxpotential in der flüssigen Phase der Fermentationsbehälter gemessen wurden.
Bei dem Präbiotikum folgte auf die 8-tägige Äquilibrierungsphase eine 5-tägige Kontrollphase und eine 6-tägige Versuchsphase, in denen täglich der pH-Wert, das Redoxpotential, die SCFA-Produktion und die molaren Anteile der einzelnen Fettsäuren, die
NH3-N- Konzentration und die Verdaulichkeit der organischen Substanz bestimmt wurden (Tab. 12).
Zusätzlich zu diesen Parametern wurde in den Versuchen mit Hefen die mikrobielle Proteinsynthese gemessen. Dazu wurde ab dem 8. Versuchstag mit der Pufferlösung das stabile Isotop 15N in Form von 15NH4Cl kontinuierlich infundiert. Der Ablauf eines Durchgangs wird exemplarisch in der Tabelle 13 dargestellt.
3.3.1. pH-Wert
Der pH-Wert wurde täglich vor dem Wechsel des Futterbeutels über 30 Sekunden in der flüssigen Phase der Fermentationsbehälter bestimmt. Als Meßgerät diente ein pH-Meter (Digital-pH-Meter 646, Knick, Berlin) mit einer pH-Einstabmeßkette (Typ 408, METTLER TOLEDO, Steinbach). Das pH-Meter wurde täglich vor den Messungen mit Eichlösung pH 4,00 und pH 7,00 (pH-Pufferlösung, METTLER TOLEDO, Steinbach) geeicht.
3.3.2. Redoxpotential
Zur Prüfung der anaeroben Verhältnisse in den Fermentationsbehältern wurden täglich die Redoxpotentiale in mV gemessen. Das Redoxpotential wurde mit einer Einstabmeßkette Typ Pt 4805-S7/120 (METTLER TOLEDO, Steinbach) und einem pH-Meter (Digital-pH-Meter, Typ 643, Knick, Berlin) über 60 Sekunden ermittelt.
3.3.3. Bestimmung der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA)
Für die Bestimmung der Konzentrationen der kurzkettigen Fettsäuren wurden täglich ca. 5 ml Aliquots vom Überlauf in Glasfläschchen gefüllt. Die Fläschchen wurden mit Schraubdeckeln verschlossen und bis zur Analyse bei –20 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der kurzkettigen Fettsäuren wurden die Proben im Kühlschrank aufgetaut. 1 ml der bei 4 °C mit 40000 g zentrifugierten Probe wurde mit 0,1 ml 98 % Ameisensäure durchgemischt und anschließend bei 4000 g 10 min zentrifugiert (Sorvall RC-5C, Du Pont Instruments, Bad Homburg). Das Dekantat wurde zur gaschromatographischen Messung verwendet (HP, Gaschromatograph
5890 II, Böblingen). Die Analysen erfolgten auf einer selbstgepackten Glassäule (Länge 1,8 m, Innendurchmesser 2 mm). Als Füllmaterial wurde Chromosorb WAW 80/100 mesh mit 20
% Neopentyl-Glycol-Succinat (NPGS) und 2 % ortho-Phosphorsäure (Analyt, Müllheim) verwendet. Zur Detektion der SCFA wurde ein FID eingesetzt. Die Flussraten der Brenngase Wasserstoff und synthetische Luft (Reinheit 5,0) betrugen 30 bzw. 420 ml/min. Als Trägergas wurde Stickstoff mit einem Gesamtfluss von etwa 25 ml/min verwendet. Die Trennung erfolgte isotherm bei einer Ofentemperatur von 130 °C, einer Injektortemperatur von 220 °C und einer Detektortemperatur von 250 °C, um eine schnelle Verdampfung der Probe zu erzielen.
Aus der Summe der Gesamt-SCFA-Konzentrationen wurden jeweils die molaren Anteile an Acetat, Propionat, Butyrat, Iso-Valerat und Valerat ermittelt. Aus dem Produkt der Konzentration (mmol/l) der jeweiligen Fettsäure und dem täglichen Überlauf (ml/d) wurde die tägliche Produktionsrate der einzelnen SCFA berechnet.
3.3.4. Bestimmung der NH3-N-Konzentration
Die Bestimmung des Ammoniak-Gehaltes in den Überläufen und in der Pufferlösung bei den Versuchen mit Topinamburmehl erfolgte photometrisch mit der Harnstoff-Test-Combination (Roche Diagnostics, Mannheim) ohne vorherige enzymatische Harnstoffspaltung mit Urease.
Die Ammoniumionen reagieren mit Phenol und Hypochlorit unter Bildung eines Farbstoffkomplexes, dessen Absorption bei einer Wellenlänge von 546 nm bestimmt wurde.
3.3.5. Bestimmung der mikrobiellen Proteinsynthese
Die mikrobielle Proteinsynthese wurde in den Versuchsreihen 1 bis 4 zur Untersuchung der Hefe S. b. quantifiziert. Die Menge des von den Pansenmikroben synthetisierten Proteins wurde unter Verwendung des stabilen Isotops 15N in Form von 15NH4Cl emissionsspektrometrisch (NOI-7, Fischer Analysen Instrumente, Leipzig) bestimmt. Ab dem 8. Versuchstag wurde täglich mit der Pufferlösung 2,81 mg 15NH4Cl (98 % 15N-Anreicherung, Promochem, Wesel) in jeden Inkubationsbehälter infundiert und anschließend die mikrobielle Proteinsynthese nach NOLAN und LENG (1983) über das Verhältnis der 15N-Anreicherung
in der Pufferlösung, in dem täglichen Abfluss aus den Inkubationsbehältern und in der Referenzmikrobenfraktion errechnet. Die Aufbereitung des Probenmaterials zur 15N-Messung erfolgte nach der von BRANDT (1979) beschriebenen Methode.
3.3.5.1. Bestimmung der Gesamt-Stickstoff-Konzentration in den Überläufen und in der Pufferlösung
Für die Bestimmung der NH3-N-Konzentration bei den Versuchen mit Hefezulage wurden täglich 40 ml Überlauf bzw. Pufferlösung entnommen, bis zur Analyse bei –20° C aufbewahrt und zur Destillation aufgetaut.
Die Bestimmung der NH3-N-Konzentration wurde mit der Kjeldahl-Destillation im Vapodest 3 (Gerhardt, Bonn) unter anschließender Rücktitration durchgeführt. 5 ml einer Probe aus dem Überlaufgefäß bzw. der Pufferlösung wurden in einen Kolben gegeben, mit 5 ml Aqua dest. und 20 ml 32 % Natronlauge versetzt. Der freigesetzte Ammoniak wurde in 4-minütiger Dampfdestillation in einer 20 ml Vorlage von 0,5 % Borsäure aufgefangen. Mit 0,01 N Schwefelsäure wurde auf den pH-Wert der Borsäure zurücktitriert (Digital-pH-Meter 646, Knick, Berlin), es entstand Ammoniumsulfat. Das Destillat wurde zur Bestimmung der mikrobiellen Proteinsynthese weiter verwendet.
3.3.5.2.Probenaufbereitung zur Messung der 15N-Anreicherung in den Überläufen und in der Pufferlösung
Zur Messung des nicht von den Mikroben assimilierten 15N in den täglichen Überläufen und in der Pufferlösung wurde das bei der Ammoniakbestimmung erhaltene Destillat mit 1 N HCl stark angesäuert (pH < 2) und durch Erhitzen im Trockenschrank (70°C) eingedampft. Um eine Endkonzentration von 400 µg Stickstoff/ml Probe zu erreichen, wurde die Probe in einer definierten Menge Aqua dest. aufgenommen, bis zur Messung in Glasgefäßen mit Schraubdeckel aufbewahrt und in den Exsikkator gestellt.
3.3.5.3. Isolierung der Referenzmikroben
Während der 8 tägigen Versuchsphase der Versuchsreihe mit S. b. wurden täglich Proben zur Isolierung der Referenzmikroben entnommen. Die Gewinnung der Referenzmikrobenfraktion wurde nach BRANDT und ROHR (1981) durchgeführt. Für diesen Zweck wurde täglich aus jeder Überlaufflasche 600 ml Inhalt entnommen und die Referenzmikroben per Differentialzentrifugation isoliert. Bei der Differentialzentrifugation wurden die Proben zunächst bei 4 °C und 600 g für 5 min vorzentrifugiert (Sorvall RC-5C, Du Pont Instruments, Bad Homburg), um gröbere Bestandteile zu entfernen. Der Überstand der vorzentrifugierten Proben wurde anschließend bei + 4 °C und 27000 g 20 min lang zentrifugiert. Mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe wurde der Überstand abgesaugt und das entstandene Mikrobenpellet in 20 ml 0,9 % iger NaCl-Lösung (W/V) resuspendiert. Die letztgenannten Arbeitsschritte, Zentrifugation und Waschen, wurden dreimal wiederholt. Dadurch wurden die Referenzmikroben mit hohem Reinheitsgrad gewonnen und das gewonnene Pellet bis zur Analyse bei -20°C aufbewahrt.
Zur Darstellung der Reinheit der Referenzmikroben wurde mit einem Spatel Probe genommen und auf einen Objektträger ausgestrichen, nach Gram gefärbt und lichtmikroskopisch untersucht. Es ließen sich in diesen Fraktionen Pansenbakterien, aber keine Protozoen und nur sehr wenige Futterpartikel nachweisen.
3.3.5.4.Aufbereitung der Referenzbakterien zur Bestimmung der 15N-Anreicherung in der Referenzmikrobenfraktion
Die isolierten Bakterienfraktionen wurden gefriergetrocknet (Alpha 2-4, Christ, Osterode/Harz). Ca. 30 mg der gefriergetrockneten Bakterienfraktion wurden mit 4-5 Glassiedeperlen, 4 ml Säuremischung (100 ml 98 %ige H2SO4, 5 ml 85 %ige H3PO4), 3 ml 30 %igen H2O2 und einer Spatelspitze Selenreaktionsgemisch (Merck, Darmstadt) in einen Kjeldahlkolben gegeben und geschwenkt. Nachdem die Kjeldahlkolben abgekühlt waren, wurden die vorbehandelten Bakterienfraktionen nach Kjeldahl (KT 40, Gerhardt, Bonn) über 1 Stunde bei 420 °C verascht. Anschließend wurden die Proben in 1 ml Aqua dest.
aufgenommen und wie im Abschnitt 3.3.5.1. und 3.3.5.2. destilliert und zur Bestimmung der
15N-Anreicherung aufbereitet.
3.3.5.5.Bestimmung der 15N-Anreicherung
Der natürlich vorkommende Stickstoff besteht zu 99,6337 % aus dem Isotop 14N und zu 0,3663 % aus dem Isotop 15N. Beide Isotope sind stabil. Eine Anreicherung bedeutet eine Erhöhung des 15N-Anteils im N2-Molekül.
Die mit 15N markierten Proben wurden im Analysengerät NOI-7 der Fa. Fischer Analysen Instrumente GmbH auf die 15N-Anteile der jeweiligen Stickstoffgehalte untersucht. Das Arbeitsprinzip des NOI-7 besteht darin, dass aus flüssigen Proben, in denen sich Stickstoff in chemisch gebundener Form wie Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat befindet, der molekulare Stickstoff mittels NaOBr-Lösung freigesetzt wird. Der molekulare Stickstoff wird durch folgende Reaktion aus der chemisch gebundenen Form freigesetzt:
Mit Hilfe eines kontinuierlichen Heliumstromes wird der gasförmige Stickstoff in das Grundgerät transportiert. Dort wird der Stickstoff bei vermindertem Druck in einem hochfrequenten elektrischen Feld zur Emission im UV-Bereich angeregt. Das abgestrahlte Licht der drei möglichen Kombinationen der beiden stabilen Stickstoffisotope 14N und 15N im Stickstoffmolekül wird nach seiner spektralen Zerlegung in einem Gitterpolychromator in ein elektrisches Signal umgewandelt und digital verarbeitet.
Molekül: 14N2 14N 15N 15N2
Wellenlänge: 297,68 nm 298,29 nm 298,86 nm
Nach Ausmessen der Peakhöhen wird die 15N-Konzentration entsprechend den nachfolgenden Gleichungen berechnet:
Es bedeuten 14N2, 14N 15N
2NH4+ + 3BrO- + 2OH- Æ N2↑ + 5H2O + 3Br
100 Atom % 15N = ---
14N2
R = ---
14N 15N
und 15N2 jeweils die Höhe des entsprechenden Peaks.
Die Stickstoffmenge (mg/d), die durch Mikroben zur Proteinsynthese verwendet wurde, konnte mit einer modifizierten Gleichung nach NOLAN und LENG (1983) wie folgt berechnet werden:
Der Berechnung des innerhalb von 24 h synthetisierten Mikrobenproteins wurde ein Stickstoffgehalt von 16 % zugrunde gelegt.
3.3.6. Bestimmung der Verdaulichkeit der organischen Substanz
In den vorliegenden Untersuchungen galt es zu bestimmen, in welchem Umfang die in den RUSITEC-Durchgängen verwendeten Futtermischungen von den Mikroorganismen fermentiert wurden. Die eingesetzten Nylonbeutel, die 48 Stunden lang im Fermentationsbehälter inkubiert und mit 2 x 40 ml vorgewärmter Pufferlösung gespült worden waren, wurden zunächst bei 65 °C für 48 Stunden im Trockenschrank (Typ 600, Memmert, Schwabach) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Anschließend wurden die getrockneten Beutel nach Abkühlung auf Raumtemperatur mit Inhalt zurückgewogen. Der Beutelinhalt wurde in einen Tiegel gegeben und bei 600 °C über 24 Stunden im Muffelofen (Typ M110 Heraeus, Hanau) verascht. Der Tiegel wurde im Exsikkator abgekühlt und das Gewicht der Rohasche bestimmt. Die Menge der organischen Substanz des Beutelinhaltes wurde aus der Differenz der Trockenmasse und des Rohaschegehaltes berechnet.
Die gleiche Analysenprozedur wurde auch für die Versuchsfuttermischung, die aus 5 g Heu und 4 g Kraftfutter bestand, durchgeführt. Dadurch wurde die Menge der organischen Substanz in der Versuchsfuttermischung bestimmt. Diese Menge diente als Standard. Die Verdaulichkeit der organischen Substanz wurde nach der von KELLNER et al. (1984) beschriebenen Methode berechnet. Aus der Differenz der Menge der organischen Substanz im
Infusionsrate 15N (µg/d) – Abfluß 15N (µg/d)
Mikroben-N (mg/d) = --- Maximale Anreicherung in den Referenzmikroben (µg 15N/mg N)
Standard und der Menge der nach 48 Stunden im Beutel verbliebenen organischen Substanz konnte die Berechnung der Verdaulichkeit mit nachstehender Gleichung erfolgen:
Verdaulichkeit (%) = I
) F I ( −
×100
I: Eingewogene organische Substanz im Standard (g) F: Rückgewogene organische Substanz im Beutel (g)
3.4. Statistische Auswertung
In den Ergebnissen, die aus den In-vitro-Untersuchungen mit Topinamburmehl gewonnen wurden, zeigten sich keine Effekte der verschiedenen Dosierungen auf die gemessenen Parameter des Pansenstoffwechsels. Deshalb wurde keine statistische Auswertung durchgeführt. Es wurden lediglich die Mittelwerte und Standardabweichungen der erhobenen Daten berechnet und dargestellt.
Die Daten aus den Versuchstagen 9 (erster Tag nach der Zugabe), 13 und 16 der In-vitro-Untersuchungen mit dem Hefestamm S. b. sind einer statistischen Analyse mit Hilfe des Statistikprogramms SAS® (Version 8.2) für WINDOWS®, Prozedur GLM, unterzogen worden. Hierbei wurden die Ergebnisse aus den Versuchsreihen 1 und 3 (lebende Hefen) sowie 2 und 4 (autoklavierte Hefen) mittels einer 3-faktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Messwiederholungen im Faktor Zeit und unabhängigen Stichproben in den Faktoren lebend/autoklaviert und Dosis gemeinsam ausgewertet. Die Voraussetzung der Normalverteilung der Residuen wurde überprüft. Die Varianzen zwischen den Fermentern wurden innerhalb der Kombinationen der Stufen der Einflussfaktoren als homogen angenommen. Daher wird in den Abbildungen 4-14 jeweils eine mittlere Standardabweichung angenommen. Hierbei wurden lediglich lebende bzw. autoklavierte Hefen bei gleichen Dosierungen miteinander verglichen und Unterschiede zwischen den Dosierungen nur bei gleichen Behandlungen gegeneinander mittels t-Tests getestet. Als statistisch signifikant wurden Mittelwertdifferenzen mit p-Werten ≤ 0,05 angenommen. In den Abbildungen werden diese zwischen den Gruppen mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.
4. Ergebnisse
4.1. Einflüsse von Topinamburmehl auf die Pansenparameter
4.1.1. Einfluss der Zugabe von Topinamburmehl auf den pH-Wert in den Versuchsreihen I und II
In den Tabellen 16 und 17 sind die pH-Werte der Versuchsreihen I und II aufgeführt.
Während der 5-tägigen Kontrollphase stellte sich der pH-Wert der Versuchsreihe I zwischen 7,04 und 7,10 ein. Ein deutlicher Einfluss der 6-tägigen Zugabe von Topinamburmehl konnte weder bei niedriger noch bei hoher Dosierung festgestellt werden. Die pH-Werte lagen zwischen 7,02 und 7,09. Während der Kontrollphase der Versuchsreihe II betrug der pH-Wert 6,87. Durch Zugabe von 1,0 g bzw. 2,0 g Topinamburmehl kam es zu keinen dosisabhängigen signifikanten pH Änderungen.
Tab. 16: pH-Werte in der Versuchsreihe I
Fermenter A Fermenter B Fermenter C Fermenter D Fermenter E Fermenter F 0,0 g/d 0,2 g/d 0,4 g/d 0,6 g/d 0,8 g/d 1,0 g/d
Vor der Zugabe (Χ ± SD von 5 Tagen)
7,10±0,02 7,06±0,05 7,04±0,05 7,06±0,03 7,04±0,05 7,07±0,04 Nach der Zugabe (Χ ± SD von 6 Tagen)
7,09±0,03 7,06±0,03 7,04±0,06 7,05±0,02 7,02±0,05 7,05±0,04
Tab. 17: pH-Werte in der Versuchsreihe II
Fermenter A Fermenter B Fermenter C Fermenter D Fermenter E Fermenter F
1,0 g/d 2,0 g/d
Vor der Zugabe (Χ ± SD von 5 Tagen)
6,87±0,02 6,87±0,00 Nach der Zugabe (Χ ± SD von 6 Tagen)
6,89±0,00 6,89±0,00
4.1.2. Einfluss der Zugabe von Topinamburmehl auf das Redoxpotential (mV) in den Versuchsreihen I und II
In der Kontrollphase der Versuchsreihe I lagen die Redoxpotentiale zwischen –297 und –318 mV. Die Zugabe von Topinamburmehl hatte keinen gerichteten Effekt auf das Redoxpotential. Nach der Zugabe wurden Werte zwischen –298 und –321 mV gemessen (Tab. 18).
Tab. 18: Redoxpotential (mV) in der Versuchsreihe I
Fermenter A Fermenter B Fermenter C Fermenter D Fermenter E Fermenter F 0,0 g/d 0,2 g/d 0,4 g/d 0,6 g/d 0,8 g/d 1,0 g/d
Vor der Zugabe (Χ ± SD von 5 Tagen)
-297±3 -307±5 -311±5 -316±4 -318±7 -316±4 Nach der Zugabe (Χ ± SD von 6 Tagen)
-303±5 -298±20 -313±9 -319±9 -320±8 -321±6
Die höhere Menge von Topinamburmehl bei der Versuchsreihe II führte ebenso zu keinem deutlichen Effekt auf das Redoxpotential. Die Werte lagen vor der Zugabe zwischen –350 und -351 mV. Während der 6-tägigen Zugabe stellten sich die Redoxpotentiale auf Werte zwischen –350 und –354 mV ein (Tab. 19).
Tab. 19: Redoxpotential (mV) in der Versuchsreihe II
Fermenter A Fermenter B Fermenter C Fermenter D Fermenter E Fermenter F
1,0 g/d 2,0 g/d
Vor der Zugabe (Χ ± SD von 5 Tagen)
-350±1 -351±0 Nach der Zugabe (Χ ± SD von 6 Tagen) -350±2 -354±1
4.1.3. Einfluss der Zugabe von Topinamburmehl auf die SCFA-Produktion (mmol/d) in den Versuchsreihen I und II
In der Tabellen 20 und 21 ist der Effekt von Topinamburmehl im Dosierungsbereich 0,2-1,0 g bzw. 1,0-2,0 g auf die Gesamt-SCFA-Produktion (mmol/d) dokumentiert. In der 5-tägigen Kontrollphase stellte sich die Gesamt-SCFA-Produktion auf Werte zwischen 22,38 und 26,96 mmol/d pro Fermenter ein. Nach der Zugabe von Topinamburmehl blieb die tägliche Produktion an SCFA unbeeinflusst und lag zwischen 23,11 und 26,32 mmol/d.
Tab. 20: Gesamt-SCFA-Produktion (mmol/d) in der Versuchsreihe I
Fermenter A Fermenter B Fermenter C Fermenter D Fermenter E Fermenter F 0,0 g/d 0,2 g/d 0,4 g/d 0,6 g/d 0,8 g/d 1,0 g/d
Vor der Zugabe (Mittelwert von 5 Tagen)
22,96±1,98 26,61±3,68 26,85±3,10 22,41±1,72 22,51±2,11 22,38±0,55 Nach der Zugabe (Mittelwert von 6 Tagen)
23,56±1,73 25,75±1,09 24,42±1,98 23,17±1,41 26,32±2,73 23,11±2,88
In der Kontrollphase der Versuchsreihe II betrug die durchschnittliche Gesamt-SCFA-Produktion 24 mmol/d. Bei Zugabe von 1,0 bzw. 2,0 g Topinamburmehl konnte kein
In der Kontrollphase der Versuchsreihe II betrug die durchschnittliche Gesamt-SCFA-Produktion 24 mmol/d. Bei Zugabe von 1,0 bzw. 2,0 g Topinamburmehl konnte kein