AMYGDALA-GEKINDELTEN RATTEN
4.6.1 Vorversuche
In Vorversuchen wurden in stereotaktischen Probeimplantationen die Koordinaten für den STN in Anlehnung an den Altas von Paxinos und Watson (1998) ermittelt.
Hierfür wurden sieben weibliche Ratten mit einem Gewicht von 200-220 g verwendet.
4.6.2 Allgemeiner Ablauf der Untersuchung
Analog zu Kapitel 4.1 (Amygdala-Kindling-Modell) wurden für diese Studie 10 weiblichen Wistar-Ratten eine Kindlingelektrode unilateral in die BLA sowie jeweils eine Tiefenhirnstimulationselektrode (HSE, Havard Apparatus GmbH, MarchHugstetten) bilateral in den STN (rostrocaudal= 3,9 mm, lateral= ±2,6 mm, ventral= -8,0 mm; in Anlehnung an Paxinos und Watson, 1998) implantiert (Abbildung 9). Die Tiere wurden daraufhin gekindelt. Nach Erreichen des Status „vollgekindelt“ (10 generalisierte Anfälle des Stadium V) wurden dann in regelmäßigen Abständen alle 3-4 Tage zur gleichen Tageszeit die Nachentladungsschwellen (inkl. GST) bestimmt, wobei jeweils mit einer Stromstärke von 5 µA begonnen wurde.
Abbildung 9: Aufsicht auf den Rattenschädel mit Darstellung der Lokalisationen der Stimulations- und Ableitelektroden sowie der Fixationsschrauben nach Paxinos und Watson (1998).
Zusätzlich zu den Nachentladungsschwellen wurde in regelmäßigen Zeitabständen (ca. alle zwei Monate) die individuelle motorische Nebenwirkungsschwelle für die hochfrequente Stimulation bestimmt. Dabei wurden die Tiere mit den entsprechenden Stimulationsparametern (s. Kap. 4.6.3) und Stromstärken ausgehend von 100 µA kurzzeitig stimuliert und dabei die Reaktionen der Ratten beobachtet. Bis zum Auftreten motorischer Nebenwirkungen (dystone und ataktische Symptome) wurde die Stromstärke schrittweise um 100 µA erhöht. Danach schrittweise wieder um jeweils 25 µA gesenkt bis keine Nebenwirkungen mehr auftraten. Die letzte Stromstärke, bei der noch Nebenwirkungen auftraten, war die individuelle Nebenwirkungsschwelle für die hochfrequente Hirnstimulation.
Sobald die Tiere drei stabile Nachentladungsschwellen aufwiesen, konnte mit den therapeutischen Stimulationsregimen begonnen werden. Dabei wurden die Tiefenhirnstimulationselektroden über ein spezielles Kabel (Pin Connecting Cable, HSE, Havard Apparatus, GmbH, March-Hugstetten) mit einem Stimulator (A310 Accupulser/ A365 Stimulus Isolator; WPI, Sarasota, Florida, USA) verbunden. Das Stimulationregime sah vor, dass die Tiere zunächst als Kontrollversuch schein-stimuliert (Bestimmung der ADT mit eingesetzten Tiefenhirnstimulationssteckern), am
Bregma rostral
Lambda
Stimulations- und Ableitelektrode
Erdungsschraube Fixationsschrauben
Tiefenhirnstimulationselektroden
caudal
folgenden Versuchstag hochfrequent bilateral stimuliert (s. Kap. 4.6.3) und als Abschlusskontrolle schließlich am folgenden Versuchstag wieder schein-stimuliert wurden. Bei erneutem Erreichen stabiler Nachentladungsschwellen wurden die Versuche analog mit anderen Stimulationsparametern durchgeführt. Aufgrund methodischer Probleme (Verdrehen der Kabel bzw. Herausfallen der Stimulationsstecker bei Aufenthalt der Tiere in einem Glasbassin) wurde bei den Stimulationsregimen mit Vorlaufzeiten zwischen zwei und fünf Sekunden die Bestimmung der ADT nicht bei 5 µA begonnen, sondern es wurde direkt mit der Stromstärke der stabilen ADT angefangen.
Längere Stimulationen (1 Std. und mehr) setzten einen geeigneten Versuchsbehälter vorraus, in dem ein Freilauf der benötigten Kabel auch über einen längeren Zeitraum möglich war. Hierzu wurde ein neu erworbenes RATURN® (BAS, West Lafayette, USA) verwendet. Hierbei handelt es sich um ein System, welches Drehbewegungen eines, in einen zugehörigen durchsichtigen Kunststoffbehälter eingesetzten, mit dem System verbundenen Tieres erkennt und durch entsprechende Drehungen des Versuchsbehälters in die entgegengesetzte Richtung ausgleicht.
Nach dem Wechsel in den neuen Versuchsbehälter mussten sich die Tiere erst an die neuen Umweltbedingungen gewöhnen, was durchschnittlich ca. eine Woche dauerte (d.h. zwei ADT-Bestimmungen). Durch dieses Gerät war kein Verdrehen der Kabel mehr möglich. Zur Bestimmung der Nachentladungsschwelle bei diesen Stimulationen wurde bei der Vor- und Nachkontrolle sowie bei der Tiefenhirnstimulation direkt mit der Stromstärke der stabilen ADT (Stimulationsregime 4 bis 6) bzw. jeweils drei Schwellen unter der letzten ADT begonnen. Um die Zeit zu verkürzen, in denen die Tiere den mechanischen Kräften des Kabels ausgesetzt waren, wurde hier ebenfalls nicht bei 5 µA begonnen.
In Abbildung 10 wird der oben beschriebene allgemeine Versuchsablauf nochmal übersichtlich zusammengefasst. Die X-Achse beschreibt hierbei den Zeitverlauf, welcher bei dieser Studie mehrere Monate betrug. Der Übersichtlichkeit halber wurden die tatsächlichen Zeitabstände nicht exakt in der Skizze wiedergegeben.
Abbildung 10: Versuchsdesign der Studie zur hochfrequenten Tiefenhirnstimulation im Amygdala-Kindling-Modell. ADT = after discharge threshold/ Nachentladungsschwelle, NWS = motorische Nebenwirkungsschwelle, STN-HFS = hochfrequente Stimulation des subthalamischen Nucleus.
4.6.3 Stimulationsparameter
Bei Betrachtung der Stimulationsparameter müssen Parameter, die bei allen Stimulationsregimen und für jedes Tier gleich gehalten wurden, von individuell bzw.
stimulations-spezifisch variierenden Parametern unterschieden werden. So wurde bei allen Stimulationen ein biphasischer, bipolarer Stimulus mit einer Frequenz von 130 Hz und einer Stimulusbreite von 60 µs angewendet.
Stimulations-
regime Vorlaufzeit Kontinuierliche Stimulation
Tabelle 9: Übersicht über die angewendeten Stimulationsregime. NWS = motorische Nebenwirkungsschwelle.
Variiert wurden (s. Übersicht Tabelle 9): 1. die Stromstärke. Diese lag bei fast allen Stimulationen 25 µA unter der individuellen motorischen Nebenwirkungsschwelle. 2.
die Stimulationscharakteristik. Es wurden kontinuierliche mit intermittierenden (z.B.
Bestimmung
NWS Stimulation 1 Stimulation 2
Vorkontrolle STN-HFS Nachkontrolle
30 Sek. alle 5 Min.) Stimulationen verglichen. 3. die Vorlaufzeit der Stimulation bis zum Überprüfen der Nachentladungsschwelle. Hierbei wurden Vorlaufzeiten von zwei bis fünf Sekunden als akute Stimulationen, Vorlaufzeiten von einer bis 24 Stunden als chronische Stimulationen bezeichnet.
4.6.4 Perfusion und Aufarbeitung des Gehirngewebes
Nach Abschluss der Untersuchungen wurden die Tiere perfundiert (s. Kap. 4.2.1), die Gehirne geschnitten und auf Objektträger aufgezogen (s. Kap. 4.2.2) und dann mit Thionin gefärbt (s. Kap. 4.2.3.1).
4.6.5 Auswertung und Statistik
Mit Hilfe eines Mikroskops (Leika, Wetzlar) erfolgte zunächst die Überprüfung des Implantationsortes der Kindlingelektrode sowie der bilateral implantierten Tiefenhirnstimulationselektroden anhand des stereotaktischen Atlas nach Paxinos und Watson (1998). Es wurden nur diejenigen Tiere ausgewertet, bei denen sowohl die Kindlingelektrode in der BLA, als auch die Tiefenhirnstimulationselektrode im STN lag.
Die statistische Auswertung (s. Kap. 4.3) erfolgte mit dem Programm PRISM für Windows (Version 4), wobei die Kindlingparameter ADT, SS, SD1+2 und ADD ausgewertet wurden. Die Parameter GST und ADD2 wurden nicht separat aufgelistet, da in dieser Studie zum Einen ADT=GST, zum Anderen bis auf ein Tier immer ADD1=ADD2 war und bei diesem zudem keine aussagekräftigen stimulationsbedingten Veränderungen der ADD2 auftraten. Da es sich um kleine Gruppengrößen handelte, wurden nicht-parametrische Testverfahren angewendet.
Da jedes Tier seine eigene Kontrolle darstellte, handelt es sich hier um verbundene Daten. Für die Varianzanalyse der verbundenen, nicht-parametrischen Daten wurde zuerst die Friedman-Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von einem Wilcoxon-Signifikanztest (post-hoc) bei Vorliegen einer Signifikanz.
5 E RGEBNISSE
5.1 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG