Im Folgenden wird die standardmäßige Aufbereitung des Hirngewebes beschrieben.
Abweichungen werden an gesonderter Stelle erwähnt. Sämtliche Herstellungsprotokolle der verwendeten Lösungen sind im Anhang zu finden.
4.2.1 Gewinnung des Gehirngewebes
Zur Gewinnung des Gehirngewebes wurde eine transkardiale Perfusionsfixierung angewendet. Hierzu wurden die Tiere zunächst mit 500 mg/kg Chloralhydrat tief narkotisiert. Bei der Perfusionsfixierung wird das natürliche Gefäßsystem des Körpers für eine schnelle Fixierung des Gewebes verwendet. Hierfür wurde eine Knopfkanüle vom linken Herzventrikel in die Aorta geschoben. Das rechte Herzohr wurde aufgeschnitten, um den Abfluss des Blutes und der Perfusionslösung zu erlauben. Der gleich bleibende Perfusionsdruck wurde durch die Positionierung der Flaschen mit der Perfusionslösung bestimmt. Dieser entsprach ungefähr dem Blutdruck des Tieres. Bevor das eigentliche Fixans verwendet wurde, wurde der Blutkreislauf der Ratte mit 0,01 M phosphatgepufferter 0,9 % Kochsalzlösung (PBS, pH-Wert 7,6) gespült. Zur Fixierung wurde ca. 300 ml 4 %iges Paraformaldehyd bzw.
für die Transplantationsstudie ein Gemisch aus frisch angesetztem 4 %igem Paraformaldehyd und 0,1 % Glutardialdehyd, in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) mit einer Temperatur von 4 °C verwendet. „Frisch“ bedeutet hierbei, dass das Paraformaldehyd spätestens am Vortag, besser jedoch am Tag der Perfusion hergestellt wurde.
Nach der Perfusion wurden die Gehirne entnommen und in eine 30 %ige Saccharose-Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) überführt. In dieser Saccharose-Lösung verblieben die Gehirne für mindestens drei Tage, um einen ausreichenden Gefrierschutz zu gewährleisten.
4.2.2 Gewinnung der Gehirnschnitte
Zwecks Verifikation des Implantationsortes der Stimulationselektroden, des Transplantationsortes der Zellen und des Messortes der elektrophysiologischen Messung wurden die perfusionsfixierten Gehirne auf einem Gefriermikrotom (Frigomobil Modell 1205, Fa. Jung, Heidelberg) aufgefroren und geschnitten. Die
Schnittdicke betrug 52 µm bzw. für die Transplantationsstudie 40 µm. Die Gehirnschnitte wurden in 0,1 M Phosphatpuffer aufgefangen und danach in anterior-posteriorer Reihenfolge mit Hilfe von flüssiger Gelantine-Chromalaun-Lösung auf entfettete Objektträger aufgezogen. Nach dem Abtrocknen konnte mit den entsprechenden Färbemethoden begonnen werden.
4.2.3 Histologische Färbemethoden 4.2.3.1 Thioninfärbung
Diese Färbung wurde als Übersichtsfärbemethode zur Verifikation des Implantationsortes der Stimulationselektroden sowie der transplantierten Zellen verwendet. Bei dieser Färbung werden insbesondere die Zellkörper von Neuronen dargestellt. Neurone besitzen im Vergleich zu Gliazellen eine große Menge Nisslschollen (Stapel des endoplasmatischen Reticulums), die durch die Nissl-Farbstoffe (u.a. Thionin) selektiv angefärbt werden. Ein detailliertes Färbeprotokoll ist im Anhang zu finden.
4.2.3.2 Neutralrotfärbung
Diese Färbemethode wurde speziell in der elektrophysiologischen Studie als Gegenfärbung angewendet. Hierdurch ergibt sich ein guter Kontrast (helles rot) zu den dunklen Markierungen (Diaminobenzidin-gekoppelte Peroxidasereaktion) des elektrophysiologisch abgeleiteten Ortes. Ein detailliertes Färbeprotokoll ist im Anhang zu finden.
4.2.4 Immunhistologisches Standardprotokoll
In der Transplantationsstudie wurden neben einer Verifikation des Transplantationsortes der Zellen (Thioninfärbung/ zur besseren Abgrenzung der Gehirnareale) immunhistologische bzw. -zytologische Färbungen der Zellen sowohl in Kultur, als auch im Transplantat durchgeführt, um eine partielle Funktionalität der Zellen anhand bestimmter exprimierter Proteine nach- bzw. beweisen zu können.
Alle immunhistologischen Färbungen wurden im „Free-floating“-Verfahren durchgeführt. Bei den immunzytologischen Färbungen wurden die Zellen zuvor auf Poly-D-Lysin-beschichteten Glassplättchen kultiviert, dann auf den Plättchen fixiert, um daraufhin das immunzytologische Protokoll zu durchlaufen.
Im Folgenden wird das immunhistologische Standardprotokoll, welches prinzipiell bei allen Antikörpern verwendet wurde, mit den jeweilig durchzuführenden Arbeitsschritten näher beschrieben. Besonderheiten je nach Antikörper (s. Kap.
5.2.2.1 bzw. 5.2.2.3.2) bzw. die Immunzytochemie von auf Glas kultivierten Zellen (s.
Kap. 5.2.1.2) werden an gesonderter Stelle näher erläutert.
Es wurden sowohl polyklonale (Anti-Glutamat-Decarboxylase, Anti-glial-fibrillary-acid-protein), als auch monoklonale Antikörper (Anti-Epstein-Barr-Virus nukleäres Antigen 1) verwendet (detaillierte Beschreibung der Antikörper: s. Anhang). Polyklonale Antikörper stammen aus verschiedenen B-Lymphozyten und binden an mehreren Epitopen (Bindungsstellen) der Proteine, was zur Folge hat, dass ihre Spezifität meist geringer ist als bei monoklonalen, aus B-Zellklonen stammenden Antikörpern.
Der Vorteil von polyklonalen Antikörper ist hingegen, dass bei Maskierung oder bei Zerstörung eines Epitops der Nachweis des Proteins weiterhin möglich ist.
Als erstes wurden die Gehirnschnitte gründlich in 0,05 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS; pH 7.6) gewaschen. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde dann mit 0.5 % H2O2 innerhalb einer 30-minütigen Inkubation zerstört. Zur Verhinderung von unspezifischen Reaktionen der Antikörper wurden die Schnitte anschließend für 60 Min. in einer „Blocklösung“ inkubiert (TBS mit 2 % bovines Serumalbumin, 0.3 % Triton X-100 und 5 % Serum der Tierart, in der der sekundäre Antikörper gewonnen wird). Darauf wurden die Schnitte für 10 Min. in „Carrierlösung“
(TBS mit 1 % Serum der Tierart, in der der sekundäre Antikörper gewonnen wird, 1 % bovines Serumalbumin und 0.3 % Triton X-100) inkubiert, um sie an die Bedingungen für den Primärantikörper zu äquilibrieren. Danach wurden sie direkt für ca. 20 Std. bei 4°C in das primäre Antiserum überführt. Am nächsten Tag wurden die Schnitte nach gründlicher Spülung mit TBS und erneuter 10-minütiger Inkubation in
„Carrierlösung“ für 90 Min. in das mit Biotin markierte sekundäre Antiserum gebracht.
Ungebundener sekundärer Antikörper wurde danach durch mehrmaliges Spülen mit TBS entfernt. Nach einer abschließenden 90-minütigen Behandlung mit Streptavidin-Meerettich-Peroxidase (Streptavidin-HRP, 1:375; DAKO) war die Inkubation beendet.
Durch erneutes viermaliges Spülen mit TBS konnte überschüssige Streptavidin-Meerettich-Peroxidase beseitigt werden.
Für die Sichtbarmachung der Antikörper-Konjugate mit einer Schwermetall-verstärkten 3,3’-Diaminobenzidin-Reaktion wurden die Schnitte für 15 Min. in eine Diaminobenzidin-Reaktionslösung gebracht (0.05 % 3,3’-Diaminobenzidin, 0.6 %
Ammonium-Nickel-Sulfat, 0.01 % H2O2 gelöst in 0,5 M TBS). Nach 15 Min. wurde die Reaktion durch mehrmaliges Spülen mit TBS beendet. Die Schnitte wurden daraufhin auf Objektträger in anterior-posteriorer Reihenfolge aufgezogen, getrocknet, für eine Minute in Toluol inkubiert und dann mit Entellan (Merck, Darmstadt) eingedeckt. Positiv-markierte Zellen stellen sich durch diese Methode schwarz dar.
Die Antikörper wurden in der oben genannten „Carrierlösung“ gelöst. Bei der Durchführung von Negativkontrollen wurde jeweils der primäre Antikörper durch die gleiche Menge an Serum aus der Tierart, in der der Sekundärantikörper entstanden ist, ersetzt.