4 MATERIAL UND METHODEN
4.10 A NHANG
4.10.1 G ERÄTE FÜR DIE EEG- UND V IDEOÜBERWACHUNG
Geräte Typ-Bezeichnung Bezugsquelle
Stabilisierte
CyberAmp 380 Axon Instruments, Inc. Foster City, CA
Videokassetten Kodak HS E-240 Aldi
EEG-Kabel
4.10.2 Protokolle für die histologischen und molekularbiologischen Methoden 4.10.2.1 Thioninfärbung
Färbung:
• 3 min in 100% Alkohol
• 3 min in 95%.Alkohol
• 3 min in 70% Alkohol
• 3 min in 50% Alkohol
• 3 min in aqua dest.
• 75 sec –90 sec in Thionin
• 3 min in 50% Alkohol
• 3 min in 70% Alkohol
• 3 min in 95% Alkohol
• 3 min in 100% Alkohol
• 3 min in Terpinol/Xylol-Ersatzmedium 1:1
• 3 min in Xylol-Ersatzmedium
• 3 min in frisches Xylol-Ersatzmedium
• mit Entellan eindecken
4.10.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von Bcl-2 und Bax
• Schnitte 3x in 0,05 M Tris gepufferter Saline (TBS; pH 7,6) waschen
• 30 min in TBS + H2O2 inkubieren (0,5%)
• 3x in TBS waschen
• 60 min in blocking solution ( siehe Punkt 3.10) inkubieren
• 18 – 24 h in Carrier-Lösung + anti Bax / anti Bcl-2 bei 4 °C inkubieren (1:50)
• 3x in TBS waschen
• 60 min in Carrier-Lösung (siehe Punkt 3.10) + biotinyliertem sekundärem Antikörper (anti-Kaninchen aus dem Schwein; 1:500)
• 3x in TBS waschen
• 60 min in TBS + Streptavidin-HRP; (1:375)
• 3x in TBS waschen
• 5 - 10 min in Tris-Nickel Lösung + DAB (siehe Punkt 3.10) vorinkubieren
• H2O2 (0,025%) dazupipettieren → 15 min inkubieren
• 3x in TBS waschen
• aus aqua dest. auf mit glycerineiweiss- bestrichene Objektträger aufziehen
• Lufttrocknen
• 1 min in Toluol
• mit Entellan® eindecken 4.10.2.3 TUNEL
Verwendete Lösungen des Apop Tag S7100-Kits:
• Equilibrierungspuffer
• Reaktionspuffer
• TdT Enzym
• Stop/Wash Puffer Protokoll
Vorbereitung der Schnitte (free floating):
• 5 min in 2%iger H2O2-Lösung inkubieren
• 3x in TBS bewegt waschen
• 5 min in 100% Ethanol und 100% Essigsäure (2:1) bei -20°C inkubieren
• 3x in TBS bewegt waschen
• aus TBS auf unbehandelte Objektträger aufziehen und antrocknen lassen Vorbereitung der Lösungen:
TdT-Enzym-Lösung:
• 70 % Reaktionspuffer + 30 % TdT Enzym im Eisbad aufbewahren (maximal 6 h haltbar) Stop/Wash Puffer:
• 2,9 % Stop/Wash Puffer in aqua dest. (im Eisbad aufbewahren) TUNEL-Verfahren (auf Objekträger):
• 70 µl Equilibrierungspuffer auf den Objektträger pipettieren (reicht für 10 cm2 ≅ 4 Schnitte)
• Coverslip möglichst blasenfrei auflegen
• 30 min bei Raumtemperatur inkubieren
• 110 µl vorbereitetes working strength TdT (reicht für 10 cm2 ≅ 4 Schnitte) auf den Objektträger pipettieren
• Coverslip auflegen
• 1 h bei 37 °C in der Feuchtkammer inkubieren
• Schnitte vom Objekträger lösen und mit stop and wash Puffer 15 sec bewegt und 10 min unbewegt inkubieren
• 3x in TBS bewegt waschen Fluoreszenzfärbung:
• 60 min in TBS + Maus anti Digoxin inkubieren (1:500)
• 3x in TBS bewegt waschen
• 60 min in TBS + Sreptavidin-CY3 inkubieren (1:333)
• 3x in TBS bewegt waschen Aufziehen und eindecken
• Schnitte aus aqua dest. auf glycerineiweiss-bestrichene Objektträger aufziehen
• lufttrocknen
• 1 min in Toluol inkubieren
• mit Entellan® eindecken
4.10.2.4 DNA-Laddering mit vorausgehender ligationsvermittelten PCR Bestandteile des Apoptotic DNA-Ladder Kit:
• Bindepuffer
• Waschpuffer
• Elutionspuffer
• Sammel und Filterröhrchen
Bestandteile des ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay Kits
• 1x Ligationsmix
• T4 DNA Ligase
• 10x LM PCR Mix Protokoll
DNA-Extraktion (DNA-Laddering Kit; Boehringer Mannheim):
• Lysieren des Gewebes (nicht mehr als 50 mg Gewebe einsetzen) 40 µl Proteinase K-Lösung (siehe Punkt 3.10)
200 µl Lysepuffer (siehe Punkt 3.10)
zum Gewebe pipettieren und bei 55 °C solange inkubieren bis sich eine homogene Masse ergibt.
• mit 200 µl Bindepuffer 10 min bei 72 °C inkubieren
• Proben mit 100 µl Isopropanol mischen und in spezielle Sammel- und Filterröhrchen pipettieren
• 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren
• Durchlauf verwerfen und Sammel- und Filterröhrchen erneut kombinieren
• 500 µl Waschpuffer in oberes Reservoir pipettieren
• 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren und Waschschritt wiederholen
• 10 sec bei 13000 rpm zentrifugieren
• Filterröhrchen in ein autoklaviertes Eppendorfcup einsetzen
• 200 µl vorgewärmten Elutionspuffer (70 °C) ins Filterröhrchen pipettieren
• 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren DNA-Fällung:
• 10 Volumenprozent Natriumacetatpuffer (siehe Punkt 3.10)
• 250 Volumenprozent 96%iges Ethanol
• ca. 24 h bei –20 °C fällen lassen
• DNA-Proben 30 min bei 13000 rpm zentrifugieren
• 50 µl 70%iges Ethanol dazupipettieren
• DNA-Pellet bei 35 °C im Trockenschrank trocknen bis Restethanol verflogen ist
• DNA-Pellet in 10 µl autoklaviertem Wasser lösen Bestimmung der DNA-Konzentration:
• 1µl der DNA-Lösung mit 1000 µl autoklaviertem Wasser mischen
• DNA-Konzentration photometrisch bestimmen Verdünnungsfaktor 1000
50 ng/ml DNA ergibt eine Absorption von 1,0
Berechnung: (Absorption bei 260 nm) x 1000 x 50 = DNA in ng/µl
Ligationsvermittelte PCR (Apo Alert LM-PCR Assay Kit; Clontech Laboratories)
• 2 µg DNA zur Ligation einsetzen (berechnen des einzusetzenden Volumens der DNA-Lösung)
• Berechnetes Volumen mit 70 µl 1x Ligations Mix mischen.
• Reaktionsgemisch auf 55 °C erhitzen und 10 min inkubieren.
• Über eine Stunde hinweg auf 10 °C abkühlen.
• 10 min bei 10 °C inkubieren
• 0,5 µl T4DNA-Ligase dazupipettieren
• 12-16 h bei 16 °C inkubieren
• Berechnung der DNA im Ligations-Mix:
Formel: Menge der DNA [ng]/Ligations-Mix [µl] + eingesetzte DNA-Lösung [µl]
• 200 ng DNA in die PCR einsetzen
• Für jede PCR-Probe:
10x LM-PCR-Mix: 10 µl
200 ng adaptor-ligierte DNA: berechnetes Volumen Taq Polymerase: 5 U = 1 µl
PCR-Grad Wasser: x µl
insgesamt: 100 µl
• kurz zentrifugieren
• mit Mineralöl überschichten
• Taq Polymerase nach dem Hot Start (3 min bei 72 °C) dazu pipettiert
• Programm des Personal Cyclers: 8 min bei 72 °C; 30 Zyklen von 1 min bei 94 °C und 3 min bei 72 °C; 15 min bei 72 °C abkühlen lassen
Gel-Elektrophorese:
• 1,2%iges Agarose-Gel gießen (siehe Punkt 3.10)
• PCR-Produkte jeweils mit Blaumarker mischen und in Geltaschen pipettieren.
• Geschwindigkeit: 6 V/cm
4.10.2.5 Verwendete Puffer- und sonstige Lösungen 0,4 M Phosphatpuiffer (Stammlösung)
• in aqua dest.
• 5,7% Na2HPO4
• 1,2% NaH2PO4
• mit 1 M NaOH auf pH 7,4 einstellen
0,01 M phospatgepufferte 0,9%ige Kochsalzlösung
• 0,9% NaCl
• 0,01 M Phosphatpuffer
• mit HCl auf pH 7,6 einstellen
4% Paraformaldehyd
• 8% Paraformaldehyd
• in aqua dest.
• auf 60 – 70 °C erhitzen
• abkühlen lassen
• mit 1 M NaOH Lösung klären
• filtrieren
• mit 0,2 M Phosphatpuffer
• auf 4%ige Lösung verdünnen
4% Formalin
• 4% Formalin
• in 0,1 M Phosphatpuffer
0,05 M Tris gepufferte Saline (TBS)
• 0,9% NaCl
• 0,05 M Tris[hydroxymethyl]-aminomethan
• mit HCl auf pH 7,6 einstellen
TBS-Nickel Lösung
• in 0,05 M TBS
• 0,6% Ammonium-Nickel-Sulfat
• mit 1 M NaOH auf pH 7,6 einstellen Carrier-Lösung
• in TBS
• 1% Schweinenormalserum
• 1 % Rinderserumalbumin
• 0,3 % Triton X
• pH 7,4 – 7,6
Blocking-Lösung
• in Carrier-solution
• 11% Schweinenormalserum
• 2% BSA
• pH 7,4 – 7,6
Thionin Färbelösung
• in aqua dest.
• 10% 1M Essigsäure
• 3,6 % 1M NaOH
• auf 60º-70º C erhitzen
• 1,25 % Thionin
• heiß filtrieren
Lysepuffer
• 1 M Harnstoff
• 100 mM Tris[hydroxymethyl]-aminomethan
• 20 mM NaCl
• 200 mM EDTA
• mit HCl auf pH 7,4 einstellen
Proteinase-K-Lösung
• 20 mg/ml Proteinase-K
• 50 mM Tris[hydroxymethyl]-aminomethan
• 1 mM CaCl2
• mit HCl auf pH 7,4 einstellen
0,5 M EDTA-Stammlösung
• in aqua dest.
• 18,6% EDTA
• mit 5 M NaOH auf pH 8 einstellen
TBE-Elektrophoresepuffer (10fach konzentriert)
• in aqua dest.
• 10,8% Tris[hydroxymethyl]-aminomethan
• 5,5 % Borsäure
• 4% 0,5 M EDTA-Stammlösung
4.10.2.6 Substanzen
Substanz Bezugsquelle
Ammonium Nickel Sulfat Hexahydrat Fluka Chemie AG, Buchs
APOAlert LM PCR Ladder Assay Kit Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg ApopTag Peroxidase Kit Oncor Appligene, Heidelberg
Apoptotic DNA-Ladder Kit Boehringer Mannheim Natrium-Cacodylat E. Merck AG, Darmstadt Chloralhydrat E. Merck AG, Darmstadt
Chloramphenicol Succinate Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Chrom III-Kaliumsulfat Dodecahydrat E. Merck AG, Darmstadt
3,3 Diaminobenzidin (DAB) Sigma-Aldrich Chemie GmBH, München DEVD-CHO (Caspase 3-Inhibitor) Calbiochem – Novobiochem, Bad Soden Diazepam (Diazepam-ratiopharm) Ratiopharm, Ulm
Dizocilpin (MK-801) Biotrend Chemikalien GmbH, Köln Entellan-Eindeckmittel E. Merck AG, Darmstadt
Essigsäure 99,8% Riedel de Häen Ethacridinlactat (Rivanol) Chinosol, Hannover Ethanol 99,8% Riedel de Häen
Ethanol vergällt Euro Alkohol, Hannover
Formaldehyd Roth, Karlsruhe
Gelatine, gepulvert E. Merck AG, Darmstadt Gentamicin (Friseo-Gent) Essex Tierarznei, München
Glutardialdehyd Sigma-Aldrich Chemie GmBH, München Kainat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Kaninchen anti Bax (IgG) Calbiochem Oncogene Research
Products
Kaninchen anti Bcl-2 (IgG) Calbiochem Oncogene Research Products
Kunststoff, Kaltpolymerisat (Paladur) Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim/Ts
Lithiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Maus anti Digoxigenin, biotinyliert Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Methylscopolaminbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Natrium-Chlorid-Lösung (isoton) Delta-Pharma, Pfullingen
Paraformaldehyd Riedel de Häen, Hannover
Pilocarpinhydrochlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Proteinase K Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Retigabin Arzneimittelwerk, Dresden
Rinderserumalbumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Schweinenormalserum DAKO, Denmark
Streptavidin-CY3 Dianova GmbH, Hamburg Taq DNA Polymerase, rekombinant MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Terpineol Roth, Karlsruhe
Thionin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Toluol E. Merck AG, Darmstadt
Tris[hydroxymethyl]-aminomethan Biomol Feinchemikalien, Hamburg Triton x – 100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Wasserstoffperoxid Riedel de Häen
Xylol-Ersatz-Medium (Rotihistol) Roth, Karlsruhe
z-VAD-fmk Bachem Biochemia GmbH, Heidelberg