C HEMISCHE E PILEPSIE -M ODELLE

4.1.1 Versuchstiere

Für die Versuche wurden weibliche Wistar-Ratten des Versuchstierzüchters Harlan Winkelmann, Borchen verwendet. Die Haltung erfolgte in Gruppen von 5 – 6 Tieren in Makrolonkäfigen Typ IV. Als Einstreu diente Weichholzgranulat (Altromin ; Fa.

Altrogge, Lage). Die Ratten erhielten Altromin 1324 Standarddiät und Leitungswasser ad libitum. Das Futter wurde einmal pro Woche und das Wasser zweimal pro Woche erneuert. Einmal in der Woche wurden die Ratten in frische Käfige umgesetzt. Das Umsetzen der Ratten erfolgte 1 – 2 Tage vor den Versuchen, um eine Beunruhigung der Ratten direkt vor dem Experiment zu vermeiden.

Die Tiere wurden bei einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an 6:00; Licht aus 18:00 MEZ), bei einer Umgebungstemperatur von 22 – 24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 – 60% gehalten.

Nach der Ankunft hatten die Tiere 4 - 5 Tage Ruhe, um sich an die neuen Bedingungen zu akklimatisieren. Danach wurden sie an 2 – 3 Tagen einmal am Tag gewogen, die Temperatur wurde gemessen und i.p. Injektionen von 0,9%iger NaCl-Lösung vorgenommen, um sie an diese Prozeduren zu gewöhnen. 7 Tage nach der Ankunft wurde der eigentliche Versuch durchgeführt. Beginn der Versuche war immer zwischen 7:00 und 9:00 MEZ, um circadiane Einflüsse möglichst gering zu halten (STEWART et al. 2001). Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung wogen die Ratten 180 g – 210 g.

4.1.2 Kainat-Modell

Es wurden 10 mg/kg Kainat (siehe Punkt 3.10.1) in 3 ml/kg 0,9%iger physiologischer Natriumchlorid-Lösung (NaCl-Lösung) intraperitoneal (i.p.) injiziert.

Der pH-Wert der Lösung betrug pH 4. Kontrolltiere erhielten 3 ml/kg 0,9%ige NaCl-Lösung i.p. (pH 6).

Nach der Injektion wurden die Ratten kontinuierlich beobachtet. In der Regel belief sich die Beobachtungszeit auf 3 - 4 h. In dieser Zeit durchliefen die Ratten zunächst fokale und dann generalisierte Anfallsstadien bis die generalisierte Anfallsaktivität

kontinuierlich ohne zwischenzeitliches Erlangen des Bewusstseins zu beobachten war. Auch während des Status epilepticus wurden die Ratten beobachtet, um sicher zu gehen, dass die generalisierte Krampfaktivität kontinuierlich anhielt. Ratten, die keine Krampfaktivität zeigten, wurden maximal 3 h beobachtet.

Die Anfallsstadien wurden nach einer von BARAN et al. (1995) modifizierten Skala von RACINE et al. (1972b) bewertet.

keine Anfallsaktivität

WDS: wet dog shakes fokale Anfallsaktivität

Stadium I: Immobilität, schwacher Fazialklonus

(Schließen eines Auges, stereotypes Schnüffeln)

Stadium II: schwerer Fazialklonus (klonische Kaubewegungen, Kopfnicken) Stadium III: unilateraler Vorderextremitätenklonus

generalisierte Anfallsaktivität

Stadium IV: bilateraler Vorderextremitätenklonus und Aufrichten des Rumpfes Stadium V: bilateraler Vorderextremitätenklonus mit Verlust der Stellreflexe

(nach hinten fallen)

Stadium VI: Status epilepticus (Serie von Anfällen der Klasse III – V ohne anfallsfreie Intervalle bzw. Erlangen des Bewusstseins) Tabelle 1: Skala der Krampfstadien im Kainat-Modell

Aus einem Status epilepticus entwickelten sich in einigen Fällen tonische Streckkrämpfe, denen ein unkontrolliertes Rennen und Springen vorausging.

Der Status epilepticus wurde 90 min nach Beginn mit 5 mg/kg Diazepam i.p.

unterbrochen. Danach wurde das Befinden der Ratten kontinuierlich kontrolliert und die Temperatur gemessen. Bei zu starkem Temperaturabfall (<36°C) wurden die Ratten auf eine Wärmeplatte gelegt. Da die Tiere nach einem Status epilepticus zunächst sehr geschwächt waren und nicht selbständig trinken und fressen konnten, wurde ihnen bis zwei Tage nach dem Status epilepticus täglich 5 ml 0,9%ige NaCl-Lsg. i.p. injiziert. Da Kontrolltiere selbstständig Flüssigkeit in ausreichender Menge zu sich nahmen, wurde ihnen keine zusätzliche Flüssigkeit injiziert. Zudem wurde nach dem Status epilepticus täglich das Gewicht kontrolliert.

4.1.2.1 Kainat-Modell: Protokoll für akute Untersuchungen

Ratten, bei denen die Neurodegeneration akut nach dem kainat-induzierten Status epilepticus untersucht werden sollte, wurden 48 h nach dem ersten generalisierten Anfall perfusionsfixiert (siehe Punkt 4.5.1). Die Gruppe der Ratten mit kainat-induziertem Status epilepticus umfasste 9 Tiere, die Kontrollgruppe bestand aus 7 Tieren.

Abb. 2: Schema des Versuchprotokolls für die akuten Untersuchungen am Kainat-Modell.

4.1.2.2 Kainat-Modell: Protokoll für chronische Untersuchungen

Bei einigen Ratten sollte die Neurodegeneration nach einem längeren Zeitraum nach dem kainat-induzierten Status epilepticus untersucht werden. Zudem sollte eine Überwachung stattfinden, ob die Ratten nach einer gewissen Latenzzeit spontan auftretende epileptische Anfälle entwickeln. Die Durchführung der Überwachung ist unter Punkt 4.3.1 beschrieben. Die Ratten (n = 6) wurden 7 Wochen nach dem Status epilepticus perfusionsfixiert (siehe Punkt 4.5.1).

Abb. 3: Schema des Versuchsprotokolls für die chronischen Untersuchungen am Kainat-Modell.

14. – 15. Tag Beginn der Überwachung

Induktion des Status epilepticus

49. – 50. Tag Perfusionsfixierung

ab 4. – 5. Tag Handling der Ratten (1 x täglich) 8. Tag

Ankunft

14. – 15. Tag Beginn der Überwachung

Induktion des Status epilepticus

49. – 50. Tag Perfusionsfixierung

4.1.3 Lithium-Pilocarpin-Modell

Den Ratten wurde 20 h – 24 h vor der Pilocarpin-Behandlung Lithiumchlorid in einer Dosierung von 3 meq/kg (entsprechen 127 mg/kg) in 3 ml/kg 0,9%iger NaCl-Lösung, pH-Wert 6 – 7, i.p. injiziert. Auch die Ratten, die als Kontrollen dienten, wurden mit derselben Dosis Lithiumchlorid behandelt (n = 6). Auf die Injektion reagierten die Ratten für ca. 30 – 60 sec mit deutlichen Schmerzäußerungen (Einziehen der Flanken, Vokalisation), die dann aber vollständig aufhörten. Aufgrund der Vorbehandlung mit Lithiumchlorid kann die Pilocarpin-Dosis, die zur Auslösung eines Status epilepticus notwendig ist, um eine Zehnerpotenz gesenkt werden.

Ca. 19 h nach der Lithiumchlorid-Gabe wurde den Ratten 1 mg/kg Methylscopolamin in 2 ml/kg 0,9%iger NaCl-Lösung, pH-Wert 6, i.p. verabreicht. Methylscopolamin ist ein muscarinerger Antagonist, der aufgrund seines quaternären Ammoniumions die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren kann. Somit hebt Methylscopolamin nur die unerwünschten peripheren Nebenwirkungen des Pilocarpins auf. Den Ratten wurde 30 min nach der Methylscopolamin-Gabe 30 mg/kg Pilocarpin in 3 ml/kg 0,9%iger NaCl-Lösung, pH-Wert 6, i.p. injiziert. Kontrollratten (n = 6) wurden parallel zu jeder Injektion mit einem entsprechenden Volumen 0,9%iger NaCl-Lösung i.p. behandelt.

Nach der Pilocarpin-Gabe wurden die Ratten beobachtet und die Anfallsstadien wie beim Kainat-Modell bewertet (siehe Punkt 4.1.2). Der Status epilepticus wurde 90 min nach Beginn mit 10 mg/kg Diazepam i.p. unterbrochen (n = 7). Alle Ratten wurden 48 h nach dem ersten generalisierten Anfall perfusionsfixiert (siehe Punkt

Abb. 4: Schema des Versuchsprotokolls für die akuten Untersuchungen am Lithium-Pilocarpin-Modell.

Ankunft

Handling der Ratten (1x täglich) ab 5. Tag

7. Tag Lithiumchlorid-Applikation

8. Tag Induktion des Status epilepticus

10. Tag

8. Tag Induktion des Status epilepticus

10. Tag

(48 h nach erstem generalisierten Anfall)

Perfusionsfixierung