6. Anwendung der 13 C-MFA im Mitteldurchsatz 88
6.2. Prozessdaten und Kohlenstoffbilanzen der Kultivierungen
In diesem Abschnitt erfolgt die Vorstellung der experimentellen Rohdaten, eine Bewertung der daraus abgeleiteten Raten und der KohlenstoffbilanzΘC sowie die ermittelte, optimale Substrat-mischung.
In Tabelle 6.2 sind die absoluten Werte der Prozessparameter wie OD600, cGlc, CBM oder BT Mzusammengefasst. Die extrazellulären Raten wie die Glukose-AufnahmerateΠGlc, die Bio-massebildungsrate ΠBM, die Kohlendioxidbildungsrate ΠCO2 und Produktbildungsrate ΠP rod, die KohlenstoffbilanzΘC und die jeweils aufΠGlc normierten AnteileΘCO2, ΘBM undΘP rod finden sich in Tabelle 6.3.
Experimentelle Rohdaten:
Die beiden Parameterρ mit 1,013±0,0025g/L undV von 0,2±0,05 L wurden ausgiebig in Ab-schnitt 4.1.3 diskutiert und aufgrund der ähnlichen Werte für alle Ansätze nicht noch einmal explizit aufgeführt. Der ParameterCBM wurde ausgenommen dem Ausreißer WT_0.20_B mit einem durchschnittlichen Wert von ~ 38,9±0,012 % ermittelt und ist mit einer relativen Standard-abweichung von 2,97 % über die biologischen Replikate besser reproduzierbar alsBT M. Diese weist eine relative Standardabweichung von 4,79 % über die Ansätze von WT_0.15, WT_0.10 und WT_0.05 auf.
Während für die Experimente WT_0.20 eineBT M von ~ 3,01g/Lermittelt wurde, so erreichte dieBT M in den anderen Kultivierungen (WT_0.15, WT_0.10 und WT_0.05) nur ~ 2,38g/L. Die höheren Werte von WT_0.20 sind mit dem suboptimalen Setup der ersten13 C-Markierungsexperi-mente zu erklären. Hierbei wurden zum Beispiel zu dicke Schlauchinnendurchmesser für die Feed-schläuche eingesetzt, durch die aufgrund der geringeren Pumpendrehzahlen größere Schwankun-gen erzeugt wurden. Unter Berücksichtigung der biologischen EiSchwankun-genschaften von WT erscheint eineBT M von ~ 2,38g/Lbei einer Einwaage von 5g/LGlukose als realistischer, da somit ein mit der Literatur vergleichbarer Biomasseausbeutekoeffizient YX/Svon ~ 0,48 erreicht wird [49,106].
In LP_0.20 zeigteBT M Werte von ~ 2,79±0,19g/L, was eine schlechte Reproduzierbarkeit von 6,78 % für die biologischen Replikate in LP_0.20 bedeutet.
Die Glukose-KonzentrationcGlc und die FeedrateFmediumwurden für WT_0.20 und LP_0.20 experimentell nicht bestimmt und daher mit den vorgegebenen Sollwerten und einer relativen Standardabweichung von 1 % angenommen. Für die optimierten Ansätze WT_0.15, WT_0.10 und WT_0.05 erfolgte eine Sechsfach-Bestimmung von cGlc mit einem Glukose-Assay (siehe hierzu Abschnitt B.8 im Anhang) mit einer mittleren Konzentration von 5,14g/L und einer gu-ten Reproduzierbarkeit von 2,96 % über die biologischen Replikate ausgenommen dem Ausreißer WT_0.10_A.Fmediumwurde in den optimierten Ansätzen über die ermittelte Dichte des Mediums sowie den gravimetrischen Verlauf der Feed-Flasche berechnet und zeigt die lineare Proportiona-lität mit der vorgebenen Verdünnungsrate. Mit sinkender Feed-Rate wird auch die Reproduzier-barkeit innerhalb der vier biologischen Ansätze geringer, deren relative Standardabweichung sich von 1,32 % für WT_0.15 auf 3,67 % bei WT_0.05 erhöht.
Für die Belüftungsrate Fair wurde ein minimaler Fehler von 0,01L/h definiert, während die ProduktkonzentrationcP rodaufgrund des Korrelationskoeffizienten der Kalibrierfunktion nur mit einer relativen Standardabweichung von 10 % angenommen wurde. In den Abgas-WertencO2und cCO2 wurde unter Berücksichtigung des auf die Hälfte reduzierten Fair für WT_0.05 ebenfalls eine lineare Proportionalität zu den eingestellten Verdünnungsraten festgestellt, bei der höhere
Tab.6.2.:ZusammenfassungallergeneriertenexperimentellenProzessdaten:dieRohdatenwieOD600,cGlc,CBM,BTMwerdenfüralleAnsätzemitzugehörigen Standardabweichungenaufgelistet AnsatzOD600cGlcFmediumCBMBTMcO2cCO2FaircProd [–][g/L][mL/h][%][g/L][%][%][L/h][mol/L] WT_0.20_A09,54±0,1115,00±0,05040,00±0,40040,3±0,802,99±0,16520,20±0,2020,415±0,016212,0±0,01— WT_0.20_B09,18±0,1715,00±0,05040,00±0,40033,8±0,302,88±0,38820,20±0,2020,359±0,004712,0±0,01— WT_0.20_C08,91±0,1175,00±0,05040,00±0,40037,8±0,403,00±0,13720,20±0,2020,469±0,005612,0±0,01— WT_0.20_D09,07±0,0425,00±0,05040,00±0,40038,7±0,403,19±0,10820,30±0,2030,555±0,007912,0±0,01— WT_0.15_A10,14±0,2835,17±0,06131,13±0,23639,9±0,542,26±0,06820,37±0,0050,428±0,007212,0±0,01— WT_0.15_B09,71±0,7395,22±0,11830,74±0,07939,7±0,362,39±0,07020,37±0,0000,424±0,005612,0±0,01— WT_0.15_C09,96±0,3104,83±0,11131,06±0,14339,8±0,442,31±0,17220,38±0,0030,422±0,005312,0±0,01— WT_0.15_D10,25±0,2725,18±0,07730,24±0,06038,7±0,422,45±0,11020,36±0,0050,429±0,008012,0±0,01— WT_0.10_A09,69±0,3054,13±0,06821,13±0,15940,5±0,282,19±0,33820,53±0,0050,331±0,007212,0±0,01— WT_0.10_B09,42±0,4615,09±0,03621,02±1,02739,7±0,412,39±0,11120,43±0,0000,353±0,006012,0±0,01— WT_0.10_C09,64±0,3915,07±0,06220,12±0,87039,2±0,222,34±0,05520,48±0,0000,349±0,005012,0±0,01— WT_0.10_D09,60±0,3325,00±0,10820,28±1,45437,2±0,502,48±0,11920,44±0,0000,329±0,006712,0±0,01— WT_0.05_A09,96±0,2085,28±0,07709,43±0,10938,9±0,422,42±0,06620,50±0,0050,315±0,005906,0±0,01— WT_0.05_B10,31±0,4145,07±0,07810,13±0,01738,3±0,322,61±0,14620,48±0,0440,342±0,006206,0±0,01— WT_0.05_C09,58±0,4485,41±0,03710,17±0,01836,4±0,222,29±0,16620,46±0,0060,339±0,007006,0±0,01— WT_0.05_D09,79±0,8355,19±0,04410,19±0,02939,4±0,362,48±0,11720,38±0,0040,394±0,005306,0±0,01— LP_0.20_A09,54±0,1117,50±0,07540,00±0,40040,6±0,502,61±0,17020,00±0,2000,379±0,008112,0±0,0109,25±0,925⋅10−3 LP_0.20_B09,18±0,1717,50±0,07540,00±0,40039,1±0,802,85±0,19820,40±0,2040,387±0,044212,0±0,0110,26±1,026⋅10−3 LP_0.20_C09,21±0,1177,50±0,07540,00±0,40036,9±0,703,03±0,13420,40±0,2040,579±0,009212,0±0,0109,66±0,966⋅10−3 LP_0.20_D09,07±0,0427,50±0,07540,00±0,40037,1±1,302,67±0,16420,20±0,2020,631±0,008512,0±0,0110,88±1,088⋅10−3
Tab.6.3.:ZusammenfassungallerberechnetenextrazellulärenRatenundderKohlenstoffbilanz:nebenderOD-BTMwerdenjeweilsdieberechneteextrazelluläreRatesowiederzugehörigeAnteilvonΘCinKlammernangegeben(ΘCO2,ΘBM,ΘProdundΘC)
AnsatzOD-BTMΠGlcΠBMΠCO2ΠProdΘC
[–][mmol/g⋅h][mmol/g⋅h][mmol/g⋅h][mmol/g⋅h][–]
WT_0.20_A0,31±0,0171,80±0,1356,28±0,338(58,2±3,13%)3,03±0,261(28,1±2,42%)—086,33±3,72%WT_0.20_B0,31±0,0421,87±0,2695,27±0,268(47,0±2,39%)2,67±0,386(23,9±3,45%)—070,86±6,40%WT_0.20_C0,33±0,0151,80±0,1235,89±0,301(54,7±2,80%)3,46±0,239(32,1±2,22%)—086,81±2,75%WT_0.20_D0,35±0,0121,68±0,1036,03±0,308(59,7±3,05%)3,90±0,243(38,6±2,41%)—098,36±2,41%
WT_0.15_A0,22±0,0411,42±0,0544,99±0,147(43,1±1,27%)3,06±0,123(35,8±1,56%)—078,87±1,86%WT_0.15_B0,25±0,0811,48±0,0734,90±0,132(44,9±1,21%)3,17±0,146(35,6±1,46%)—080,55±2,35%WT_0.15_C0,23±0,0811,35±0,0584,96±0,138(46,8±1,31%)3,07±0,119(37,8±3,01%)—084,64±4,06%WT_0.15_D0,24±0,0521,37±0,0534,70±0,129(45,1±1,24%)3,04±0,125(36,9±2,04%)—082,07±2,53%
WT_0.10_A0,23±0,1580,81±0,0333,43±0,093(53,0±1,44%)2,41±0,107(49,7±7,87%)—102,71±8,46%WT_0.10_B0,25±0,0671,02±0,0643,35±0,187(45,9±2,57%)2,66±0,117(43,5±2,44%)—089,43±3,22%WT_0.10_C0,24±0,0470,95±0,0563,16±0,159(44,6±2,25%)2,57±0,106(45,1±1,70%)—089,71±2,59%WT_0.10_D0,26±0,0590,95±0,0793,03±0,234(45,6±3,52%)2,41±0,106(42,5±2,49%)—088,05±4,35%
WT_0.05_A0,24±0,0340,45±0,0181,47±0,093(43,9±1,31%)1,11±0,046(41,2±1,76%)—085,07±2,06%WT_0.05_B0,25±0,0690,45±0,0181,56±0,093(48,6±1,29%)1,17±0,049(43,8±2,83%)—092,41±3,23%WT_0.05_C0,24±0,0860,52±0,0201,49±0,093(37,9±0,98%)1,25±0,057(40,5±3,25%)—078,39±2,97%WT_0.05_D0,25±0,0970,48±0,0221,61±0,093(46,5±1,25%)1,45±0,069(49,8±2,76%)—096,28±2,50%
LP_0.20_A0,30±0,0193,10±0,2586,40±0,336(34,4±1,80%)3,12±0,267(16,8±1,44%)0,70±0,091(22,6±2,94%)073,79±3,32%LP_0.20_B0,32±0,0222,84±0,2476,16±0,339(36,1±1,99%)2,95±0,453(17,3±2,66%)0,71±0,094(25,1±3,31%)078,53±4,32%LP_0.20_C0,31±0,0142,67±0,1835,82±0,317(36,3±1,97%)4,31±0,298(26,8±1,86%)0,63±0,076(23,6±2,85%)086,78±3,11%LP_0.20_D0,28±0,0173,03±0,2445,85±0,362(32,1±1,99%)5,35±0,432(29,4±2,37%)0,81±0,103(26,6±3,41%)088,15±3,65%
Verdünnungsraten auch höherecCO2 und niedrigerecO2 erzeugen. Für die im Vergleich zu CO2 vorliegenden, höheren O2-Konzentrationen im Abgas konnten zwar auch leicht sinkende Repro-duzierbarkeiten über die sinkende Verdünnungsrate beobachtet werden, die relativen Standardab-weichungen innerhalb der vier biologischen Replikate liegen aber zwischen 0,03 % für WT_0.15 und 0,25 % bei WT_0.05 sehr niedrig. Im Gegensatz dazu konnten für cCO2 bei WT_0.15 noch akzeptable Reproduzierbarkeiten über die vier biologischen Replikate mit 0,80 % erreicht werden, diese steigen aber bei WT_0.10 auf 3,57 % und bei WT_0.05 sogar auf 9,53 %. Dies ist auf die hohen Belüftungsraten und die niedrigen cCO2-Werte zurückzuführen, wodurch Schwankungen im Messwert stärkeren Einfluss auf die Reproduzierbarkeit haben.
Mit den optimierten, experimentellen Methoden konnten die Prozessparameter innerhalb ei-nes13C-Markierungsexperimentes bis aufBT M und OD600mit relativen Standardabweichungen deutlich unter 3 % bestimmt werden, in den meisten Fällen sogar unter 1 %. Die BT M sowie OD600wiesen eher Abweichungen von ~ 5 %, in einzelnen Fällen sogar bis zu 15 % auf. Über die biologischen Replikate hinweg zeigtenBT M undcCO2Reproduzierbarkeiten von ~ 3 – 6 % auf.
Extrazelluläre Raten:
Aus den eben vorgestellten, experimentellen Rohdaten wurden mit den in Abschnitt 4.1.2 prä-sentierten Gleichungen die extrazellulären Raten berechnet und die Kohlenstoffbilanz aufgestellt.
Auch in den Werten der extrazellulären Raten spiegelt sich die durch die Verdünnungsrate gege-bene Linearität wieder. Hier kann in ΠGlc,ΠBM sowieΠCO2 der nahezu lineare Proportionali-tätsfaktor der Verdünnungsrate wieder gefunden werden (ausgenommen für WT_0.20).
Aufgrund der angewandten Gauß’schen Fehlerfortpflanzung aus Abschnitt 5.3.1 liegen die rela-tiven Standardabweichungen der berechneten extrazellulären Raten in vergleichbaren Größenord-nungen wie die größten relativen Standardabweichungen der benötigten Parameter. So weisen zum Beispiel WT_0.20_B oder WT_0.10_A aufgrund einer relativen∆BT M von ~ 15 % ebenso ho-he relative∆ΠGlcauf. Im Experiment LP_0.20_B erzeugt der relative Fehler∆cCO2 von 11,4 % einen unpräzisen, relativen∆ΠCO2von 15,4 %. Im Durchschnitt konnten ausgenommen der Aus-reißer WT_0.20_B, WT_0.10_A und LP_0.20_B relative Standardabweichungen von 6,84 % für
∆ΠGlc, 6,24 % für∆ΠCO2und 5,02 % für∆ΠBM ermittelt werden. Für∆ΠP rodwurde aufgrund des angenommenen relativen Fehlers von 10 % für∆cP rodnur ein relativer Fehler von 12,9 % er-reicht.
Kohlenstoffbilanz:
Wie bereits angedeutet istΘC ein wichtiges Kriterium zur Bewertung von Prozessen in der13 C-MFA sowie der Bioprozessentwicklung. In Abbildung 6.1 sind die erreichtenΘC und∆ΘC al-ler 13C-Markierungsexperimente mit den jeweiligen Anteilen der gebildeten Biomasse (ΘBM), Kohlendioxid-Bildung (ΘCO2) und Produktbildung (ΘP rod) bezogen auf die C-molareΠGlc vi-sualisiert. Es konnten nur einzelne Bilanzen geschlossen werden, während die meisten eine durch-schnittliche Lücke von ca. 14 % aufwiesen.
In den Ansätzen WT_0.20 sind durch das nicht optimale technische Setup größere Schwankun-gen sichtbar, wobei die Ausreißer vonCBM (33,8 %) sowiecCO2 (0,359 %) in WT_0.20_B zu einer niedrigerenΠBM (5,27mmol/g⋅h) undΠCO2(2,67mmol/g⋅h) im Vergleich zu den anderen Repli-katen von WT_0.20 führten. DieΘCschließt sich damit nur auf 70,86 %. Insgesamt erzeugten die höherenBT M-Werte von ~ 3,01g/Lin WT_0.20 deutlich größere Anteile fürΘBM im Vergleich
WT_0.20_A WT_0.20_B WT_0.20_C WT_0.20_D WT_0.15_A WT_0.15_B WT_0.15_C WT_0.15_D WT_0.10_A WT_0.10_B WT_0.10_C WT_0.10_D WT_0.05_A WT_0.05_B WT_0.05_C WT_0.05_D LP_0.20_A LP_0.20_B LP_0.20_C LP_0.20_D
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Kohlenstoffbilanz [%]
ΘBM ΘProd ΘCO2
Kohlenstoffbilanz[%] WT_0.20_A WT_0.20_B WT_0.20_C WT_0.20_D WT_0.15_A WT_0.15_B WT_0.15_C WT_0.15_D WT_0.10_A WT_0.10_B WT_0.10_C WT_0.10_D WT_0.05_A WT_0.05_B WT_0.05_C WT_0.05_D LP_0.20_A LP_0.20_B LP_0.20_C LP_0.20_D
ΘBM ΘP rod ΘCO2
Abb. 6.1.:Kohlenstoffbilanzen aller13C-Markierungsexperimente: dargestellt sind die aufΠGlcnormierten, C-molaren AnteileΘBM(grün),ΘCO2(grau) sowieΘP rod(lila)
zu den anderen Verdünnungsraten. DieBT Mvon WT_0.20 und damit auchΘBM werden aus den vorgenannten Gründen als zu hoch angesehen. Für WT_0.15 zeigten sich dagegen sehr konsistente ΘCO2 undΘBM sowie eine durchschnittliche Lücke inΘC von ca. 20 %. Ebenso wies WT_0.10 sehr ähnliche Anteile auf, wobei WT_0.10_A durch die zu niedrig bestimmtecGlcvon 4,13g/Leine ΘC von 102,71 % hatte. Die Lücken der anderen drei Ansätze betrugen nur ca. 10 %. Die Bilanzen von WT_0.05 variieren wiederum stärker, was durch die niedrigenFmediumvon ~ 10mL/herklärt werden könnte.ΘBM von LP_0.20 zeigte mit ~ 35 % undΘP rodmit ~ 24 % sehr reproduzierbare Anteile. Die unterschiedlichen Werte voncCO2 undBT M spiegeln sich direkt inΘCO2, das mit Werten von 16,8 % bis 29,4 % starke Streuung über die biologischen Replikate zeigte. Die nach-weisbaren Lücken inΘC lagen daher zwischen 12 und 30 %. Weitere Diskussionen hierzu finden sich in Abschnitt 6.4.4.
Die erreichten ∆ΘC liegen in den meisten Ansätzen aufgrund der Fehlerfortpflanzung mit
~ 2 bis 4 % im gleichen Rahmen wie die Fehler der einzelnen extrazellulären Raten (vgl. Ab-schnitt 5.3.2 und Tabelle 6.2). Für die beiden Ausreißer WT_0.20_B und WT_0.10_A wurden Standardabweichungen von 6,40 % und 8,46 % festgestellt, die sich durch die erhöhten Fehler
∆BT M mit Einfluss aufΠCO2undΠBM erklären lassen.
Optimierung des verwendeten Substrates: Experimental Design
Für jedes 13C-Markierungsexperiment sollte vor der experimentellen Durchführung eine Opti-mierung des Input-Substrates erfolgen, die sich nach dem Transitions-Netzwerk, den messbaren Markierungsdaten sowie der Zielsetzung richtet [25, 141, 170]. Hierzu werden die verschiedenen Substrate rein kombinatorisch in unterschiedlichen Mischungen vorgegeben und das Netzwerk mit einer angenommenen Flusslage (hier entnommen aus [249]) auf statistische Sicherheit und
Informationsdichte untersucht. Zum Einsatz kommen vorwiegend unmarkierte Glukose (glc0), teilmarkierte 1-13C-Glukose (glc1) und vollmarkierte U-13C-Glukose (glcU), aus denen sich ein Mischungsdreieck ergibt (siehe Abbildung 6.2). Dabei stehen die Ecken für je eine reine Versi-on der Glukose und die Farbskala verdeutlicht die InformatiVersi-onsdichte der entsprechenden Sub-stratmischung. Klar erkennbar ist hier die unterschiedliche Informationsverteilung der zugrunde liegenden Netzwerke beziehungsweise Stämme.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glcU
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
glc1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glc0
(a)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glcU
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
glc1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glc0
(b)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glcU
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
glc1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
glc0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
(c)
Abb. 6.2.:Substratoptimierung verschiedener Stämme, bei der jede Ecke einer isotopisch definierten Glukose-Form entspricht (glc0, glc1 oder glcU). Dargestellt sind: (a) WT mit ZSW, (b) WT mit ZSW und AS-Biosynthesewegen und(c)LP. Rote Flächen stehen für einen hohen und blaue für einen niedrigen Infor-mationsgehalt (entspricht der statistischen Sicherheit) bezogen auf die Referenzmischung in der Mitte des Dreiecks. Die ausgewählte Substratmischung ist mit einem weißen Kreis markiert.
Die optimale Mischung kann nach dem informativen Gehalt oder den entstehenden Kosten der Mischung ausgewählt werden. In dieser Arbeit wurde versucht, einen Kompromiss zwischen In-formationsgehalt und Kosten zu finden. Hierbei wurde in einem möglichst roten Bereich die Mi-schung mit dem höchsten glc0-Anteil (möglichst weit zur oberen Ecke) ausgewählt. Diese Mi-schungen sind mit einem weißen Kreis markiert und weisen minimale Kosten bei akzeptablem Informationsgehalt auf.
Fazit und Literatur-Vergleich:
Insgesamt konnten für die optimierten Ansätze WT_0.15, WT_0.10 und WT_0.05 reproduzierba-re extrazelluläreproduzierba-re Raten und Kohlenstoffbilanzen erzeugt werden. Die Qualität der Reproduzierbar-keit ist von der Verdünnungsrate abhängig, da bei geringeren Raten Prozessparameter wiecCO2 undFmedium durch die niedrigeren Werte insgesamt höhere Standardabweichungen aufweisen.
Der Parameter BT M hatte auf alle ermittelten extrazellulären Raten und die aufgestellte Koh-lenstoffbilanz einen so signifikanten Einfluss, dass dessen Sensitivität mit den hohen ∆BT M für die berechneten Fehler der Raten und der Kohlenstoffbilanz hauptsächlich verantwortlich ist.
Für alle Bilanzen wird aufgrund der dargelegten Ungenauigkeiten in cCO2 sowie CBM davon ausgegangen, dass ΘBM sowieΘCO2 leicht unterbestimmt vorliegen (vgl. Abschnitt 6.4.5 und Abschnitt 4.1.3) und damit die vorliegenden Lücken in den Bilanzen erklärt werden können.
Die C-molaren AnteileΘCO2 undΘBM sind ähnlich den bekannten Aufteilungen aus der Li-teratur. Petersen [164] hat für den WT ebenfalls nur CO2, Biomasse sowie minimale Mengen an Alanin und Valin aufgeführt. Von Krömer wurden für ΘBM ca. 50 % ermittelt, wobei hier auch minimale Anteile an Nebenprodukten identifiziert wurden [106]. Auch Eggeling propagiert ein YX/S von 0,5 [49]. Die in der Literatur angegebenen Anteile für ΘBM liegen etwas höher als die in Abbildung 6.1 gezeigten, die jedoch wegen der systematischen Unterbestimmung von CBMnach oben korrigiert werden müssten. Die AnteileΘBMundΘCO2sind hierbei unabhängig von der eingestellten Wachstumsrate [30, 91], da diese im Rahmen der Ungenauigkeiten konstant über alle Datensätze sind. Wellerdiek untersuchte den LP_0.20 in der Produktionsphase mit ei-nem Sensor-Reaktor und ermittelte ΘP rod mit 36 %, ΘCO2 mit 45,5 % und ΘBM entsprechend mit 18,5 % [223]. Dort wurden mehr Lysin und weniger Biomasse erzeugt, allerdings können die dortigen Prozessbedingungen nicht mit denen dieser Arbeit verglichen werden.