5. Etablierung der 13CFLUX2-Essentials 49
5.7. Choreographie der Modulbausteine des Frameworks
Simula-100,00 100,00 ±± 2,112,11 100,00 100,00 ±± 3,233,23 100,00 100,00 ±± 1,901,90 100,00 100,00 ±± 1,721,72
30,17 30,17 ±± 2,272,27 26,16 26,16 ±± 3,413,41 37,44 37,44 ±± 1,481,48 10,79 10,79 ±± 1,471,47
69,01 69,01 ±± 1,761,76 69,06 69,06 ±± 2,622,62 71,90 71,90 ±± 1,521,52 62,32 62,32 ±± 1,291,29
68,04 68,04 ±± 2,682,68 72,37 72,37 ±± 4,214,21 60,88 60,88 ±± 1,961,96 87,37 87,37 ±± 2,172,17
39,46 39,46 ±± 1,791,79 43,40 43,40 ±± 2,802,80 35,04 35,04 ±± 1,301,30 52,17 52,17 ±± 1,451,45
28,58 28,58 ±± 0,890,89 28,97 28,97 ±± 1,401,40 25,84 25,84 ±± 0,650,65 35,20 35,20 ±± 0,720,72
20,90 20,90 ±± 0,890,89 22,66 22,66 ±± 1,401,40 18,62 18,62 ±± 0,650,65 27,29 27,29 ±± 0,720,72 18,56
18,56 ±± 0,890,89 20,74 20,74 ±± 1,401,40 16,42 16,42 ±± 0,650,65 24,88 24,88 ±± 0,720,72
144,15 144,15 ±± 3,793,79 148,65 148,65 ±± 5,715,71 148,54 148,54 ±± 3,383,38 136,74 136,74 ±± 2,952,95
90,13 90,13 ±± 3,793,79 104,31 104,31 ±± 5,715,71
97,79 97,79 ±± 3,383,38 81,14 81,14 ±± 2,952,95
64,44 64,44 ±± 3,793,79 83,22 83,22 ±± 5,715,71 73,65 73,65 ±± 3,383,38 54,70 54,70 ±± 2,952,95
53,50 53,50 ±± 3,793,79 155,45
155,45 ±± 3,793,79 157,92 157,92 ±± 5,715,71 159,16 159,16 ±± 3,383,38 148,37 148,37 ±± 2,952,95 250,22
250,22 ±± 12,6812,68 312,89 312,89 ±± 19,3519,35 271,37 271,37 ±± 11,4211,42 240,01 240,01 ±± 10,3410,34
Residuals:
1107,60 1107,60 1037,01 1037,01 1833,74 1833,74 2690,48 2690,48 F QS:0000
Abb. 5.10.:Ausführliche Visualisierung aller relevanten Ergebnisse einer13C-MFA: orange Rechtecke entspre-chen Metaboliten, die über die Reaktionen (Pfeile) verknüpft sind. Die Pfeildicken entspreentspre-chen den Fluss-raten normiert aufΠGlc und sind in verschiedenen Farben für die jeweiligen Stoffwechselwege dargestellt.
Die wichtigsten Reaktionen sind mit Boxen hinterlegt, in denen von oben nach unten die jeweiligen Raten mit entsprechender Standardabweichung für die biologischen Replikate A – D aufgelistet sind (blaue Zeilenhin-tergründe für aktuellen Datensatz). Die Markierungsmuster der orangen Metaboliten wurden im Gegensatz zu den grau gefärbten für die Parameterschätzung verwendet. Schwarz gefärbte Metabolite wurden nicht ge-messen.
tionsergebnissen deutlich: trotz der höherenF QSim letzten Ansatz sind die Standardabweichun-gen der Flussraten wesentlich geringer und geben damit einen wesentlich Standardabweichun-genaueren biologischen Zustand wieder. Hiermit wird also erkennbar, dass eine niedrigeF QS alleine nicht für eine gute Interpretation ausreicht, sondern integrativ alle Ergebnisse gemeinsam bewertet werden müssen.
13 C-Markie- rungsexperiment
analytische Rohdaten
technische Prozessdaten
A B
Rohdaten- verarbeitung
JuMeDaS calcExtRates
Stöchiometrie / Modelg
Markierungs-musterg
extrazelluläre Rateng
Nebenbe-dingungen
Substrat-markierung
Modellierung &Simulation
setmeasurements setconstraints setinput FluxML
hdf5
Analyseder Ergebnisse
evaluate_reports evaluate_statistics evaluate_sens evaluate_fitfluxes FWDSIM
Abb. 5.11.:Choreographie der Module innerhalb der13CFLUX2-Essentials: dargestellt sind die entwickel-ten Module (weiße Rechtecke) im Ablauf einer Stoffflussanalyse mit den Blöcken13 C-Markierungsex-periment,Rohdatenverarbeitung,Modellierung & SimulationsowieAnalyse der Ergebnisse.
Graue Rechtecke stellen die jeweiligen Schnittstellen mit den zugehörigen Daten dar während die Software-Logos bestehende Technologien verdeutlichen.
tion der so konvertierten technischen Prozessdaten, der analytischen Markierungsdaten und der Nebenbedingungen in ein bestehendes stöchiometrisches Netzwerk erfolgt mit den entwickelten Modulensetmeasurements,setinputundsetconstraints. Das Post-Processing der Ergeb-nisse geschieht im letzten BlockAnalyse der Ergebnisse, in demevaluate_fitfluxesmit den MSO-Daten das Vorhandensein und die Eigenschaften lokaler Optima untersucht und die optima-le Flusslage identifiziert. Diese muss durch das Programmevaluate_statisticsmit statisti-schen Methoden analysiert werden, wobei besonders der Vergleich experimenteller und
simulati-ver Messdaten mit Bewertung der Anpassungsgüte durch die Kategorisierung der Abweichungen durchevaluate_reportszu nennen ist. Die Komplexität der Verarbeitung wird durch die unter-schiedlichen Schnittstellen und Arbeitsschritte deutlich, bei der bestehende Daten überschrieben, gelöscht oder mit neuen Parameteren kombiniert werden müssen. Die Zuweisung von Indizes für zusammengehörende Daten verbessert eine spätere Interpretation. Im Weiteren werden die Bau-steine der13CFLUX2-Essentialsvorgestellt und eine kurze Erläuterung zur Bedienung angege-ben. Die Benennung der Skripte sowie die Notation der ausführbaren Parameter lehnt sich an die von13CFLUX2an und erleichtert damit den Einstieg in die13CFLUX2-Essentials.
• workflow_13C-MFA:
Hierbei handelt es sich um das Hauptmodul des Pakets. Mit diesem Skript wird die Mittel-durchsatz13C-MFA gestartet. Der Benutzer muss eine Versuchsliste, eine Datei mit allen experimentellen Rohdaten, die Anzahl der Startpunkte für eine MSO sowie ein Verzeichnis für die zu speichernden Daten vorgeben.
-S sample_list.csv Versuchsliste
-i rohdaten.csv Datei mit experimentellen Rohdaten -n 10000 Anzahl der Startpunkte für MSO
-r Ergebnisse Erweiterung für Verzeichnis, in das alle Daten gespeichert werden (endgültiges Verzeichnis lautet:$DATE$_$USER$_Ergebnisse) -N gapA Normierung aller Flusswerte auf diese Reaktion
• calcExtRates:
Dieses Modul berechnet aus einer gegebenen Datei mit experimentellen Rohdaten alle ex-trazellulären Raten inklusive Fehlern und stellt automatisch eine Kohlenstoffbilanz auf. Au-ßerdem können die berechneten Raten im FluxML-konformen Format gespeichert werden.
-i rohdaten.csv einzulesende Rohdaten
-r fluxes/ Verzeichnis, in das absolute Flusswerte und Kohlenstoffbilanz gespeichert werden
-x extRaten/ Verzeichnis für die Speicherung der berechneten Flussraten in FluxML-Dateien
-p Ausgabe der Ergebnisse auf Kommandozeile -l 3 Angabe des zu prozessierenden Ansatzes
• setmeasurements:
Die jeweiligen Prozessdaten oder Markierungsdaten werden in eine vom Benutzer definier-te FluxML-Dadefinier-tei indefinier-tegriert. Die gewünschdefinier-ten Messdadefinier-ten werden über spezifische Paramedefinier-ter angegeben. Die benötigten Markierungsdateien (.lmd:labeling measurement data) werden mitJuMeDaSerzeugt, während die extrazellulären Flussraten (.fmd:flux measurement da-ta) als Ergebnis auscalcExtRateserhalten oder manuell über eine CSV-Datei importiert werden können.
-i network.fml stöchiometrisches Modell
-o network_new.fml stöchiometrisches Modell mit integrierten Messdaten -F file Integration einer FWDSIM-basierten Datei (.fwd)
-X file Integration einer FluxML-basierten Datei (.fmdoder.fml) -C file.csv Integration von Daten aus einer CSV-Datei
-d a / l / f Löschung (a) aller (l) oder nur der Markierungs- oder (f) Flussmes-sungen
-R ’0.05*x + 0.01’ Definition eines Fehlermodells (nur mit-F)
• setconstraints:
Beliebige Nebenbedingungen können in eine FluxML-Datei eingebaut werden, wobei die constraintsmanuell als Parameter übergeben oder aus einer CSV-Datei eingelesen werden können.
-i network.fml stöchiometrisches Modell
-o network_new.fml stöchiometrisches Modell mit integrierten Nebenbedingungen -t ’g6P_bm=0.04’ manuelle Definition einer Nebenbedingung
-C file.csv Integration von Daten aus einer CSV-Datei
• setinput:
Dieser Baustein erzeugt die Definition der verwendeten Mischung an isotopisch markierter Glukose. Die isotopische und chemische Reinheit wird zu den technischen Prozessdaten gezählt und kann automatisch für beliebige Substrate erzeugt werden.
-i network.fml stöchiometrisches Modell
-o network_new.fml stöchiometrisches Modell mit integrierter Definition der Substrat-Marierung
-t ’GLC#100000:0.99:1’ manuelle Definition eines markierten Substrates
• evaluate_fitfluxes:
Die geschätzten Flusslagen aller durchgeführten MSO sind in einer .hdf5-Datei zusammen-gefasst. Aus dieser muss die optimale Flusslage mit dem zugehörigen Index ermittelt wer-den und in das ursprüngliche Modell integriert werwer-den. Der Index wird als Rückgabewerte des Moduls ausgegeben und vonworkflow_13C-MFAabgefangen und als Parameter für die nächsten Module verwendet.
-H cfd1.hdf5 zusammengefasste Simulationsergebnisse
• evaluate_reports:
Die simulierten Markierungsdaten und Flussraten können nun mit den experimentellen Da-ten verglichen werden, in dem eine Einteilung der absoluDa-ten Abweichungen für jeden Mess-wert in die gewünschten Fehlerkategorien I, II, III und IV wie in Abschnitt 5.6.1 beschrieben durchgeführt wird. Ebenso erfolgte eine Zusammenfassung der Fehlerkategorien, der simu-lierten Messdaten sowie der Differenzen zu den experimentellen Messdaten aller durchge-führten Ansätze aus derSample Listin jeweils gesonderten Dateien.
-i report.csv Bericht über Abweichungen von experimentellen und simulierten Messdaten aussimreport
-r results/ Verzeichnis für die Ergebnisdateien aller Abweichungen von simu-lierten und experimentellen Daten und einer Zusammenfassung der Kategorisierung
-L 0.01 untere Grenze für Kategorie [0 .. 1]
-M 0.05 mittlere Grenze für Kategorie [0 .. 1]
-U 0.1 obere Grenze für Kategorie [0 .. 1]
• evaluate_statistics:
Die Erzeugung aller statistischen Ergebnisse und Aufbereitung für die anschließende Vi-sualisierung wird mit diesem Skript durchgeführt. Mit der optimierten Flusslage werden die statistischen Abweichungen für die geschätzten Parameter berechnet und es erfolgt eine Normierung auf die über den Parameter angegebene Reaktion. Von allen Ansätzen wer-den die absoluten und normierten Flusswerte sowie deren jeweilige Abweichung in einer gemeinsamen Datei gespeichert.
-i network.fwd FWDSIM-Datei mit statistischen Daten -r results/ Ergebnisdatei für alle optimierten Flusslagen -N norm_flux Reaktion zur Normierung der Flussraten
Die Ergebnisse dieser Analyse werden im Hauptordner$DATE$_$USER$_Ergebnissein folgen-de Unterverzeichnisse gespeichert:
Verzeichnis Inhalt
cfg verwendete Messdaten und Nebenbedingungen
fml Vollständige FluxML-Modelle mit originalen und angepassten Abwei-chungen
fwd Simulationsergebnisse: erzeugte Samples, simulierte Flusslagen und zusammengefasste Ergebnisse
rep Dateien mit Vergleich von experimentellen und simulierten Daten results Report-Dateien über Statistik, absolute und normierte Flusslagen sowie
Einteilungen in die Kategorien stat Dateien mit statistischen Werten
Nach der Erstellung und Visualisierung aller relevanten Ergebnisse kann die effiziente und benut-zerfreundliche Interpretation und Bewertung der Daten erfolgen.