Expression einer HDAC1-Variante ohne His-tag

Ein HDAC1-Konstrukt voller Länge, aber ohne einen tag, wurde durch Klonierung eines durch Spaltung mit NdeI freigesetzten Fragmentes aus pQEHDAC1NHIS in den mit NdeI geöffneten Vektor pQEHDAC1CHIS erschaffen. Dabei konnte auf eine Abtrennung der jeweiligen nicht erwünschten Fragmente der Restriktionsverdaus verzichtet werden, da beide Vektoren zusätzlich zum Schnitt im Gen für HDAC1 im Replikationsursprung geschnitten wurden und daher nur Ligate aus der Fusion der gewünschten Fragmente mit der korrekten Orientierung nach Transformation im Wirt propagiert werden konnten. Pilotexpressionen mit dem durch Sequenzierung überprüften resultierenden Expressionsvektor pQEHDAC1otag in HB101-Zellen wiesen in Standard-HDAC-Assays mit Boc-Lys(Ac)-AMC aber ebenfalls keinerlei Deacetylase-Aktivität auf.

4.3.2 Klonierung der humanen HDAC8 und heterologe Expression in E. coli

Da die humane HDAC1 in E. coli nicht in aktiver Form exprimiert werden konnte, wurde die Produktion von humaner HDAC8 angegangen. Für dieses Enzym ist eine erfolgreiche heterologe Expression in E. coli bereits belegt (Hu et al., 2000). Auch dieses menschliche Enzym ist eine wertvolle Referenz bei Untersuchungen der Selektivität von HDACI und sollte als weiteres Beispielenzym neben der FB188-HDAH die generelle Anwendbarkeit des neuen Assays belegen. Ein weiterer Anreiz, sich näher mit diesem Enzym zu befassen, war durch auffallend wenige biochemischen Daten z. B.

hinsichtlich der Substratspezifität oder der Funktion in vivo gegeben.

Die für HDAC8 codierende cDNA wurde mit den Primern HDAC8pQEEcoRIfor und HDAC8XaHISrev mittels PCR aus einer cDNA-Bibliothek aus humanem Lebergewebe amplifiziert, in pCR4TOPO zwischenkloniert und dann über EcoRI und HindIII in den Expressionsvektor pQE70 umkloniert. Die HDAC8 trägt C-terminal einen RGSHis6 -tag, dem eine Faktor Xa-Prozessierungssequenz voransteht. Da bei der Sequenzierung des Vektors eine Punktmutation endeckt wurde, die zu dem Aminosäureaustausch Val282Ala der HDAC8 führte, wurde dieser Austausch nach der Quik-Change-Methode (Li and Wilkinson, 1997; Wang and Malcolm, 1999; Wang and Malcolm, 2002) rückgängig gemacht. Dazu wurden in einer PCR die die Schadstelle überlappenden und zueinander völlig komplementären Primer QCM-HD8for und QCM-HD8rev mit dem Plasmid pQEHDAC8V282A als Matritze verwendet.

1000

Abb 25: Vektorkarte des Expressionsvektors pQEHDAC8.

Dieser diente zur heterologen Produktion von humaner HDAC8 mit einem C-terminalen His6-tag und einer Faktor Xa-Spaltstelle. T5-Prom, T5-Promotor mit Lac-Operatorregion; bla, β-Laktamasegen für die Ampicillinresistenz; ori, Replikationsursprung ColE1.

Eine Testexpression wurde mit durch den korrekten Vektor pQEHDAC8 (Abb. 25) transformierten XL1-Blue-Zellen unternommen, indem mit 50 µl aus einer 4 ml Vorkultur 50 ml dYT/Amp angeimpft und nach 3 h bei einer OD600 von ca. 0,4 mit 1 mM IPTG induziert wurde. Nach 3 h und 20 h wurden Aliquots abgenommen, per Ultraschall aufgeschlossen, durch SDS-PAGE (12,5 % PAA) aufgetrennt und mittels Immunoblot mit Anti-PentaHis-AK (1 : 3000) analysiert (Abb. 26), wobei sich in einer Bande bei Mr ~ 50000 die exprimierte HDAC8 (Mr: ~ 45240, (Hu et al., 2000) nachweisen ließ.

Ein HDAC-Aktivitätstest der löslichen Lysatfraktion mit Boc-Lys(Ac)-AMC bzw. Ac-RGK(Ac)-AMC als Substrat bestätigte, daß die HDAC8 in aktiver Form produziert werden konnte (als Kontrolle diente ein mit dem Leervektor pQE70 transformierter Stamm).

M 1 2 3 4

Abb. 26: Immunodetektion der in XL1-Blue exprimierten, rekombinanten HDAC8 mit Anti-PentaHis-tag-AK.

Eine Pilotexpression von XL1-Blue-pQEHDAC8 wurde in 50 ml LB/Amp unternommen. Als Kontrolle wurde ein mit dem Leervektor transformierter Stamm mitgeführt (XL1-Blue-pQE70). Nach Sonifizierung der Zellen wurde die lösliche Lysatfraktion per SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Der Nachweis des rekombinanten Enzyms (Pfeil, Mr ~ 50000) erfolgte immunologisch über Anti-PentaHis-AK und einen AP-gekoppelten, sekundären AK durch die NBT/BCIP-Reaktion. M: Prestained Marker (MBI) 10-160 kDa, 1 : Penicillin-Acylase (WPA) mit His-tag als Positivkontrolle (Ninkovic et al., 2001), 2 : FB188-HDAH mit N-terminalem Strep-tag, 3: XL1-Blue-pQE70, 4: XL1-Blue-pQEHDAC8.

4.3.3 Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC)

Mittels Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallionen (Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC, (Porath et al., 1975)) lassen sich Proteine, die einen Hexahistidin-tag tragen, recht effektiv und schnell z. B. aus dem Lysat einer Expressionskultur isolieren (Sulkowski, 1985).

Für die Gewinnung der HDAC1 wurde mit HB101-pEHDAC1CHIS, einem Klon, für den die Pilotexpression gezeigt hatte, daß er HDAC1 mit C-terminalem His-tag produzierte, eine Expression in 50 ml LB/Amp durchgeführt wie bereits beschrieben.

Nach dem Aufschluß der geernteten und in 2 ml IMAC-Puffer I resuspendierten Zellen mittels Ultraschall wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und der Überstand des Lysates auf eine mit Nickel beladene und mit IMAC-Puffer I äquilibrierte Chelating-Sepharose-Säule (SV ca. 1 ml) geladen und der Durchfluß aufgefangen. Nach dem Wegwaschen nicht-bindender Proteine mit IMAC-Puffer I wurde HDAC1 mit einem Stufengradienten steigender Imidazol-Konzentration in IMAC-Puffer I eluiert. Alle Fraktionen wurden mittels Immunoblot mit Anti-TetraHis-tag-AK untersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung 27 gezeigt. HDAC1 eluierte vor allem bei 100 – 200 mM Imidazol. Da schon das Lysat im HDAC-Assay keine Deacetylase-Aktivität aufwies, wurde auf eine Dialyse und Enzymtests mit den Fraktionen verzichtet.

Abb. 27: Immunochemischer Nachweis der Aufreinigung der HDAC1 mit C-terminalem Hexahistidin-tag über IMAC.

HDAC1 mit C-terminalem Hexahistidin-tag wurde in HB101 exprimiert und die Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen. Der lösliche Anteil des Lysats wurde auf eine IMAC-Säule geladen und das Enzym mit einem Stufengradienten steigender Imidazol-Konzentration eluiert. Aliquots der Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Der Nachweis des rekombinanten Enzyms (Pfeil, Mr ~ 65000) erfolgte immunologisch über Anti-TetraHis-AK und einem AP-gekoppelten, sekundären AK durch die NBT/BCIP-Reaktion. M: Prestained Marker (MBI) 10-160 kDa, 1: Lysat, 3: Waschfraktion, 4:

40 mM Imidazol, 5: 80 mM Imidazol, 6: 100 mM Imidazol, 7: 200 mM Imidazol, 8: 300 mM Imidazol, 9:

500 mM Imidazol.

Zur Gewinnung der humanen HDAC8 sollte zunächst (wie bei der HDAC1) der C-terminale Hexahistidin-tag bei der Aufreinigung an einer mit Nickel beladenen Chelating-Sepharose-Säule ausgenutzt werden. Dazu wurde der lösliche Lysatbestandteil einer 50 ml-Expressionskultur von XL1-Blue-pQEHDAC8 auf eine äquilibrierte IMAC-Säule mit Chelating-Sepharose-Matrix (SV etwa 1 ml) geladen und der Durchlauf aufgefangen. Nach dem Wegwaschen nicht-bindender Proteine mit HDAC8-Puffer wurde HDAC8 mit einem Stufengradienten steigender Imidazol-Konzentration in HDAC8-Puffer eluiert. Alle Fraktionen wurden mittels Immunoblot mit Anti-PentaHis-tag-AK untersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung 28 gezeigt.

HDAC8 (Mr ~ 45000) eluierte vor allem bei 100 – 200 mM Imidazol. Diese Fraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen HDAC8-Puffer dialysiert. Mit dem HDAC-Assay konnte jedoch nur beim Lysat (50 µl) eine Deacetylase-Aktivität mit 150 µM Boc-Lys(Ac)-AMC als Substrat festgestellt werden. Ein Western Blot der dialysierten Fraktionen mit Anti-PentaHis-tag-AK bestätigte das Vorhandensein der HDAC8 auch nach der Dialyse (Daten nicht gezeigt). Alternativ wurde die IMAC-Aufreinigung mit

1 M 3 4 5 6 7 8 9

einer Zink-beladenen Säule wiederholt, um eventuell durch die Säule herausgereinigtes Zink des aktiven Zentrums zu ersetzen. Auch hier konnte nur im Lysat eine Deacetylase-Aktivität detektiert werden. Ein Versuch, das eventuell verlorene Zink nach der Dialyse wieder zuzusetzen, erbrachte bei 1 bzw. 10 mM ZnCl2 ebenfalls keine Rekonstitution der Enzymaktivität. Desweiteren wurde durch Umpuffern des Eluates mit Hilfe von wiederholter Zentrifugation und Auffüllen mit HDAC8-Puffer in Microcon-Filtrationssäulchen das Imidazol entfernt. Aber auch danach war keine Enzymaktivität zu verzeichnen, obwohl die Kontrolle mittels Western Blot den Verbleib der HDAC8 im Filterüberstand anzeigte (Daten nicht gezeigt). Wahrscheinlich wird die Struktur der HDAC durch die Bindung an das Säulenmaterial irreversibel zerstört und/oder das Zink aus dem aktiven Zentrum entfernt, welches dann auch nicht mehr nachträglich eingefügt werden kann. Diese Befunde stehen im Widerspruch zu der erfolgreichen Aufreinigung der HDAC8 über Ni-NTA-Säulchen in aktiver Form durch Hu und Mitarbeiter (Hu et al., 2000). Im Unterschied zu Ni-NTA, das einen 4-zähnigen Komplexbildner darstellt und Nickel über 4 Stellen komplexiert, bindet der 3-zähnige Chelator Iminodiacetylsäure Nickel-Liganden über 3 Koordinationsstellen, womit 3 weitere des Nickel-Ions frei zur Bindung der Histidine des Proteintags bleiben (Hochuli, 1989; Porath et al., 1975). So könnte ein weiterer Grund für den Verlust der Aktivität bei der Aufreinigung in der leichteren Abgabe des Nickel-Ions von der Iminodiacetyl-Gruppe in die Enzymlösung und eine folgende irreversible Hemmung der HDAC sein.

Der Einsatz dieser Säulchen bei weiteren Aufreinigungsversuchen zeigte nach Dialyse der Eluate ü. N. gegen HDAC8-Puffer und ihrer Überprüfung mit 150 µM Boc-Lys(Ac)-AMC in HDAC-Assays, daß damit HDAC8 tatsächlich in aktiver Form bei 200 mM Imidazol eluiert werden konnte und die verwendete Matrix offensichtlich von ausschlaggebender Bedeutung ist (Daten nicht gezeigt).

45.000

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

Abb. 28: Immunochemischer Nachweis der Aufreinigung der HDAC8 mit C-terminalem Hexahistidin-tag über IMAC.

HDAC8 mit C-terminalem Hexahistidin-tag wurde in XL1-Blue exprimiert und die Zellen mittels Zelldisruptor aufgeschlossen. Der lösliche Anteil des Lysats wurde auf eine IMAC-Säule geladen und das Enzym mit einem Stufengradienten steigender Imidazol-Konzentration eluiert. Aliquots der Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Der Nachweis des rekombinanten Enzyms erfolgte immunologisch über Anti-PentaHis-AK und einem AP-gekoppelten, sekundären AK durch die NBT/BCIP-Reaktion. M: Prestained Marker (MBI) 10-160 kDa, 2 : Lysat, 3 : Durchlauf, 4, 5 : Waschfraktionen, 6 : 20 mM Imidazol, 7 : 40 mM Imidazol, 8 : 60 mM Imidazol, 9 : 100 mM Imidazol, 10: 200 mM Imidazol, 11: 100 mM Imidazol, 12: 200 mM Imidazol, 13: 300 mM Imidazol, 14: 500 mM Imidazol.