3. Ergebnisse und Diskussion
3.4. Derivate von ( L )-Mimosin und Kojisäure
3.4.1. Etherderivate der Kojisäure
Ausgehend von den Ergebnissen der bereits herausgefundenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und den daraus resultierenden Hinweisen auf die Topographie der Bin-detasche aus dem Homologiemodelling, lassen sich weitere Derivate der Kojisäure (12) ableiten, bei denen Strukturvariationen eine verstärkte Hemmung des Enzyms erwarten lassen.
Wie bereits erwähnt und in Abb. 125 gezeigt, ist vermutlich die Abstoßung zwischen der polaren Hydroxymethyl-Partialstruktur der Kojisäure (12) und einer hydrophoben
Region im aktiven Zentrum der humanen Tyrosinase der Grund für die schlechte Hemmung der Substanzen. Um diese Problematik zu umgehen, wurden synthetische Bemühungen unternommen, die alkoholische OH-Gruppe in einen Ether umzuwan-deln. Alle Synthesen starteten mit dem einfach benzyl-geschützenKojisäure-Derivat 145, dessen noch freie Hydroxylfunktion jedoch deutlich weniger sauer ist als die zu-vor mit Benzylbromid umgesetzte phenolische Hydroxygruppe. Um beispielsweise den gewünschten Methylether zu erhalten, ist der Einsatz starke Basen wie NaH nötig, in deren Anwesenheit Verbindung 145 nicht stabil ist. Aus diesem Grund liefer-ten erste Versuche für die Darstellung des Methylethers 226 nur Ausbeute von ca.
5%. Eine parallel laufende Synthese, bei der statt Methyliodid Benzylbromid einge-setzt wurde, lieferten ähnlich moderate Ausbeuten (Abb. 130).
O O O
O R O
O
OH DMF
14 h, RT O
1. NaH 2. R I
145 226-227
Abb. 130 Reaktionsgleichung für die Substitution der freien OH-Gruppe in Verbindung 145 mit Methyliodid oder Benzylbromid.
Tab. 26 Isolierte Ausbeuten für die erhaltenen Ether bei der Umsetzung von 145 mit Methyliodid oder Benzylbromid.
O O O
O R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Methyl 226 17%
2 Benzyl 227 31%
Obwohl die Reaktionsbedingungen optimiert werden konnten, so dass höhere Aus-beuten für die 226 und 227 erhalten wurden, blieb die Herstellung die beiden Ether anspruchsvoll und arbeitsintensiv. Aus diesem Grund wurden die entsprechenden Thioether-Derivate synthetisiert, da der Schwefel wegen seiner größeren
Nukleophi-lie reaktiver ist und somit weniger basische Reaktionsbedingungen für eine Umset-zung mit der alkoholischen OH-Gruppe herrschen müssen. Das Edukt für die Thio-etherderivate von Kojisäure (12) war in allen Fällen Chlorkojisäure (187), die an-schließend mit dem gewünschten Alkanthiol zur Reaktion gebracht wurde (Abb. 131).
O O HO
OH
SOCl2
O O HO
Cl
NaOEt HS-R
O O HO
S R
12 187 228-232
Abb. 131 Einführung einer Thioether-Partialstruktur in Kojisäure (12).
Tab. 27 Erhaltene Ausbeuten für die Reaktion von Chlorkojisäure (187) mit Alkanthiolen.
O O HO
S R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Methyl 228 44%
2 Ethyl 229 67%
3 Neopropyl 230 50%
4 Isopropyl 231 57%
5 Pentyl 232 76%
Um zu überprüfen, ob die Thioether-Derivate 228-232 eine größere Hemmwirkung zeigen als die Kojisäure (12), wurden sie an der humanen Tyrosinase getestet. Die aus den Testungen erhaltenen Ki-Werte sind in Tab. 28 aufgelistet. Zum Vergleich sind außerdem die Ki-Werte von Rucinol (18), Hexylresorcinol (19) sowie der stan-dardmäßig verwendete Kojisäure (12) mit aufgeführt.
Tab. 28 An der humanen Tyrosinase gemessene Ki-Werte für die Thioetherderivate der Kojisäure 228-232. Die Ki-Werte von Rucinol (18), Hexylresorcinol (19) und Koji-säure (12) sind zum Vergleich aufgeführt.
Verbindung Ki [µM] Verbindung Ki [µM]]
O O HO
S 228
46.3
OH HO
18
8.90
O O HO
S 229
18.7
OH HO
19
26.1
O O HO
S 230
26.6
O O HO
OH 12
186
O O HO
S 231
49.8
O O HO
S 232
45.8
Wie aus Tab. 27 ersichtlich, zeigt der Ethylthioether 229 die stärkste Hemmung der humanen Tyrosinase, wobei sein Ki-Wert noch unter dem von Hexylresorcinol (19) liegt. Seine räumliche Orientierung innerhalb des aktiven Zentrums ist in Abb. 132 a.) gezeigt und lässt eine günstige Interaktion mit Met185 oder Trp80 erahnen. Für das in Abb. 132 b.) gezeigte Isopropylderivat 231 wurde ebenfalls eine dreidimensionale Darstellung der Substanz in der Bindetasche angefertigt, anhand dessen sich vermu-ten ließ, dass der sperrige Alkylrest wahrscheinlich eine ungünstige Orientierung innerhalb der Bindetasche einnimmt.
a.) b.)
Abb. 132 Räumliche Orientierung der Thioether 229 [links] und 231 [rechts] in der Substratbindetasche der humanen Tyrosinase, die anhand des verfeinerten Homologiemodells erstellt wurde.
Innerhalb der Verbindungreihen 228-232 lässt sich der Trend erkennen, dass die Inhibitorstärke mit steigender Länge der aliphatischen Seitenkette abnimmt. Für die schlechten Ergebnisse beim Methylether 228 lieferte das Homologiemodell jedoch keine Erklärung. Es kann in diesem Zusammenhang nur vermutet werden, dass die Seitenkette zu kurz ist, um mit den Aminosäureresten der Bindetasche zu inter-agieren.
Weitere Berechnungen und Docking-Studien im Arbeitskreis von Prof. Dr. Klebe ergaben, dass sich auch für Sulfon- bzw. Sulfoxid-Derivate der Kojisäurethioether 228-232 günstige Wechselwirkungen und gute inhibitorische Eigenschaften erwarten ließen. Darüberhinaus gelten Thioether-Partialstrukturen in potentiellen Wirkstoff-kandidaten als unerwünscht und sollten deshalb durch die stabileren Sulfon-Teilstrukturen ausgetauscht werden, die häufig in Wirkstoffen zu finden sind. Die Ergebnisse von Docking-Studien für zwei Sulfonderivate sind in Abb. 133 gezeigt.
a.) b.)
O O HO
S O O
O O HO
S O O
233 234
Abb. 133 Ergebnisse der Docking-Studien für die Sulfonderivate 233 und 234, die durch Oxidation aus 229 bzw. 231 gewonnen werden können.
a.) Position von 5-Hydroxy-2-(propan-2-sulfonylmethyl)-4H-pyran-4-on (233) im akti-ven Zentrum des humanen Enyzms. b.) Räumliche Ausrichtung von 2-Ethansulfonyl-methyl-5-hydroxy-4H-pyran-4-on (234) in der Substratbindetasche.
Die Sulfone konnten durch Oxidation direkt aus den jeweiligen Thioethern 228-231 gewonnen werden. Das hierfür benötigte Reagenz war Oxone®, das Peroxomonosul-fat als Oxidationsmittel enthält (Abb. 134).
O O HO
S R
Oxone
O O HO
S R O O 4 h, RT
228-231 233-236
Abb. 134 Reaktionsgleichung, nach welcher die Thioether 228-231 mit dem Oxidationsmit-tel Oxone® zu den gewünschten Sulfonen 233-236 oxidiert werden.
Tab. 29 Ausbeuten für die Oxidationsreaktion der Thioether zu den Sulfonen 233-236.
O O HO
S R O O
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Methyl 235 8%
2 Ethyl 234 17%
3 Isopropyl 233 3%
4 Neopropyl 236 9%
Bei den nachfolgenden Testungen am humanen Enzym wurden für die Sulfone 234-236 deutlich schlechtere Ki-Werte gemessen als für die analogen Thioether (Tab.
30). Das Isopropyl-Derivat 233 wurde nicht mit in die Testreihe aufgenommen, weil sich die anderen Derivate 235-236 am Enzym inaktiv zeigten. Das Homologiemodell kann in diesem Fall keine zufriedenstellende Erklärung liefern, warum die Sulfone 234-236 trotz positiver Vorhersagen aus dem Docking über keine gute Hemmwirkung verfügen.
Tab. 30 Gemessenen Ki-Werte für die Sulfone 234-236 an der humanen Tyrosinase.
O O HO
S R O O
Eintrag R Ki [µM] Hemmtyp 1 Methyl 841 Nicht-kompetitiv 2 Ethyl 518 Nicht-kompetitiv 3 Neopropyl 524 Nicht-kompetitiv
Weitere synthetische Anstrengungen zur Gewinnung von Kojisäurederivaten mit Sulfon-Strukturelement wurden aufgrund der Testergebnisse (Tab. 30) nicht unter-nommen. Stattdessen wurde für weitere Docking-Untersuchungen (Abb. 135) exem-plarisch ein Vertreter der Reihe gewählt, aus dem bei positiver Vorhersage anschlie-ßend ein Sulfoxid-Derivat gewonnen werden sollte.
Abb. 135 Lage des exemplarisch ausgewählten 5-Hydroxy-2-(propan-1-sufinylmethyl)-4H-pyran-4-ons (237) in der Bindetasche der humanen Tyrosinase.
Nachdem aufgrund der Docking-Untersuchung eine positive Vorhersage bezüglich der Hemmung des Tyrosinase durch 5-Hydroxy-2-(propan-1-sufinylmethyl)-4H-pyran-4-on (237) gemacht werden konnte, wurde der Thioether 230 erneut mit Oxone zur Reaktion gebracht wurde. Um das Schwefelatom in 230 nicht bis zum entsprechen-den Sulfon zu oxidieren, wird der Versuchsansatz bereits nach zwei Minuten mit wässriger Natriumthiosulfit-Lösung aufgearbeitet (Abb. 136).
O O HO
S
"Oxone"
O O HO
S O 2 min, RT
18%
230 237
Abb. 136 Oxidation des Thioether 230 zum entsprechenden Sulfon 237.
Die Hemmung der Tyrosinase war für Verbindung 237 ebenfalls gering. Es wurde ein Ki-Wert von 796 µM bestimmt. Da diese Strukturvariation keinen deutlichen Unter-schied der inhibitorischen Stärke im Vergleich zu 230 oder 236 erbrachte, wurde die Idee verworfen, Sulfoxid-Derivate dieser Substanzklasse als zukünftige Wirkstoff-kandidaten zu gewinnen.
Da noch keine Testdaten für die Derivate der Kojisäure- bzw. Mimosin mit basischer Seitenkette bei Beginn der nächsten Synthesesequenz vorlagen, wurde versucht auch einige der Thioetherderivate der Kojisäure (12) mit Alkylaminen oder Diaminen
zur Reaktion zu bringen (Abb. 137). Bevor die Einführung der Amine in das 4H-Pyran-4-on-Gerüst der Thioether jedoch stattfinden konnte, wurde vorher die
phenolische Gruppe mit Benzylbromid zur Reaktion gebracht (Abb. 138).
O O HO
S R O
O O
S R NaOH,
BnBr 12 h, 78 °C
238-239
Abb. 138 Schutz der OH-Gruppe mit Benzylbromid.
Tab. 31 Isolierte Ausbeuten für die benzylgeschützten Derivate 238 und 239.
O O O
S R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Ethyl 238 54%
2 Isopropyl 239 30%
O O O
S R1
NH2 R2
N O O
S R1 R2
238 und 239 240-242
Abb. 139 Reaktion der Thioetherderivate 238 und 239 mit Alkylaminen.
Tab. 32 Erzielte Ausbeuten für die Umsetzung von 238 und 239 mit Alkylaminen.
N O O
S R1 R2
Eintrag R1 R2 Produkt Ausbeute
1 Ethyl Butyl 240 22%
2 Ethyl Propylamin 241 81%
3 Isopropyl Ethylamin 242 19%
Bei der Freisetzung der phenolischen Gruppe in 240-242 gestaltete sich die Entfer-nung der Benzylschutzgruppe ungeahnt schwierig. Diese häufig verwendete Schutz-gruppe erweist sich hier als nachteilig, da bei ihrer Abspaltung unter hydrogenoly-tischen Bedingungen die Doppelbindungen im 4H-Pyran-4-on-Gerüst ebenfalls redu-ziert werden. Die Reduktion ist jedoch nicht vollständig und es treten Produktgemi-sche auf, deren Trennung nicht möglich war. Diese Problematik trat hier erstmals in Erscheinung. Sie wiederholt sich aber, sobald in der Seitenkette in 2-Position ein etherartiges Strukturelement auftritt (Abb. 139). Möglicherweise hätte eine Änderung des Katalysatorsystems oder eine Abspaltung unter den Bedingungen einer Trans-ferhydrierung den gewünschten Erfolg gebracht. Da die Einführung einer neuen Schutzgruppe als schnellere Lösung angesehen wurde, wurde auf eine Optimierung der Reaktionsbedingungen an dieser Stelle verzichtet.
N O O
S R1 R2
R1 = Ethyl, Isopropyl
R2 = Butyl, Ethylamin, Propylamin
10% Pd/C, H2 12 h, RT
N O HO
S R1 R2
Abb. 140 Versuche zum Entfernen der Benzylschutzgruppe unter hydrogenolytischen Bedingungen.
Um zu überprüfen ob das Thioether-Sturkturelement oder die Einführung der Amine die Probleme beim Entfernen der Benzylschutzgruppe verursacht, wurden
Probever-suche an den Thioethern 238 und 239 unternommen, welche die gleichen Beobach-tungen lieferten. Auch mit der Methode der „Transferhydrierung“ konnte die Schutz-gruppe nicht entfernt werden, ohne dass die Doppelbindungen des Pyranon-Gerüstes zu Einfachbindungen reduziert werden (Abb. 141).
O O BnO
S
O O HO
S H2/Pd
oderTransferhydrierung
R R
R = Et, Isopropyl
Abb. 141 Probeversuche zum Entfernen der Benzylschutzgruppe aus den Thioethern 238 und 239 unter verschiedenen Reaktionsbedingungen.
Anhand der durchgeführten Versuche lässt sich für den weiteren Syntheseweg sagen, dass für die Umsetzung von beispielsweise den Thioethern die Benzylschutz-gruppe nicht mehr die SchutzBenzylschutz-gruppe der Wahl ist. Als alternative SchutzBenzylschutz-gruppe wur-den eine Tritylgruppe und eine TBDMS-(tert-Butyldimethylsilyl)-Schutzgruppe erprobt (Abb. 142). Die Tritylschutzgruppe lässt sich dabei unter milden, sauren Bedingun-gen abspalten, unter denen die Kojisäure stabil sein sollte. Die Silyl-Schutzgruppe hingegen wird durch Zugabe von Tetrabutlyammoniumfluorid (Bu4NF) abgespalten.
O O HO
S
Tr-Cl
O O O
S
O O HO
S
Si Cl
DCM, Imidazol O
O O
S Si
32%
50%
243
244 231
231
Abb. 142 Einführung von alternativen Schutzgruppen in das 5-Hydroxy-2-isopropylsulf-anylmethyl-4H-pyran-4-on (231).
Während sich die Einführung der beiden neuen Schutzgruppen als unproblematisch erwies, stellte sich die anschließende Insertion der primären Amine in das 4H-Pyran-4-on-Gerüst als synthetisches Problem heraus. Trotz intensiver Variation der Reakti-onsbedingungen konnte keine Umsetzung zwischen 243 bzw. 244 und den ausge-wählten Aminen beobachtet werden (Abb. 143). Dabei spielte es keine Rolle, ob es sich um ungeschützte Diamine oder um einfach boc-geschützte Verbindungen han-delte.
O O O
S R
H2N NH2 n=1,2,3
n
80° C, 18 h N
O O
S R
NH2 n
O O O
S
R n=0,1,2
n
80° C, 18 h N
O O
S R
NHBoc n H2N
HN O O
R = Trityl oder TBDMS
Abb. 143 Umsetzung der Trityl- bzw. TBDMS-geschützten Kojisäure-Thioether 243 und 244 mit verschiedenen primären Aminen.
Als weitere Möglichkeit zum Schutz der phenolischen OH-Gruppe wurde die PMB-Schutzgruppe in Betracht gezogen, da sie strukturell zwar der Benzylschutzgruppe ähnelt, aber unter sauren Reaktionsbedingungen entfernt werden kann (Abb. 144).
O O HO
S R
K2CO3, PMBCl 3 h, 80 °C
O O O
S R O
245-246
Abb. 144 Alkylierung der phenolischen Gruppe durch Umsetzung p-Methoxybenzyl-chlorid.
Tab. 33 Ausbeuten für die Reaktion von 229 und 230 mit p-Methoxybenzylchlorid.
O O O
S R1 O
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Ethyl 245 44%
2 Isopropyl 246 29%
Mit PMB-Ether als Schutzgruppe verlief die Umsetzung von 245 und 246 mit ausge-suchten Diaminen erfolgreich (Abb. 145). Es wurde hauptsächlich die Verbindung 245 zur Reaktion gebracht, da in der Reihe der Thioether 229-232 für den Ethylsub-stituent die besten Ki-Werte gemessen wurden. Verbindung 246 hingegen wurde zum einem mit 1,3-Diaminopropan zur Reaktion gebracht und zum anderen mit Glycinamid-Hydrochlorid. Die Umsetzung mit dem Glycinamid-Hydrochlorid erfolgte, weil erprobt werden sollten, ob auch Amide zur Reaktion gebracht werden könnten (Abb. 145). Ein amidisches Strukturelement am Ende der eingeführten Seitenkette hätte den Vorteil, dass es keine Probleme bei der Reinigung der Endstufe nach Frei-setzung der phenolischen Gruppe geben würde.
O O O
S O
H2N NH2 n n = 1, 2, 3
N O O
S O
NH2 n
245 247-249
Abb. 145 Einschub von Diaminen in das 4H-Pyran-4-on-Gerüst des Thioethers 245.
Tab. 34 Erhaltenen Ausbeuten für die Umsetzung von Verbindung 245 mit verschiede-nen primären Diamiverschiede-nen.
N O O
S O
NH2 n
Eintrag n Produkt Ausbeute
1 1 247 30%
2 2 248 35%
3 3 249 25%
O O O
S O
NH2
N O O
S O
246
H2N
H2N
250 26%
O O O
S O
N O O
S O
246 251
26%
H2N O
NH3 Cl
NH2 O
Abb. 146 Reaktion von Thioether 246 mit 1,3-Diaminopropan zu 250 oder mit Glycinamid-Hydrochlorid zu Verbindung 251.
Um im finalen Schritt die PMB-Schutzgruppe zu entfernen, wurden die Verbindungen 247-249 und 250 und 251 mit Trifluoressigsäure (TFA) umgesetzt. Außer Verbindung
251 wurden die Substanzen 247-249 sowie 250 nochmal für 1 h mit einer 4N HCl/Dioxan-Mischung zur Reaktion gebracht, um die Endstufe in Form des Hydrochlorids isolieren zu können (Abb. 147).
n = 1, 2, 3 N
O O
S O
NH2 n
1. TFA
2. 4N HCl/Dioxan je 1 h, RT
N O HO
S
NH3 n Cl
247-249
252-254
N O O
S O
1. TFA
2. 4N HCl/Dioxan je 1 h, RT H2N
N O HO
S
H3N Cl
250 255
82%
N O O
S O
TFA je 1 h, RT
N O HO
S
NH2 O
NH2
O
251 256
98%
Abb. 147 Abspaltung der PMB-Schutzgruppe mit TFA und anschließende Protonierung der Aminofunktion durch Umsetzung mit 4N HCl/Dioxan-Lösung.
Tab. 35 Erzielte Ausbeuten für den Umsetzung von 247-249 mit TFA und 4N HCl/Dioxan-Lösung.
N O HO
S
NH3 n Cl
Eintrag n Produkt Ausbeute
1 1 252 88%
2 2 253 97%
3 3 254 79%
Von den in Abb. 147 gezeigten Substanzen wurden nur Verbindungen 252-254 und 256 am humanen Enzym vermessen. Die Messreihe sollte abschließende Er-kenntnisse darüber liefern, ob die Einführung von polaren Seitenketten in die Thio-etherderivat 229 und 231 die ermittelte Inhibitorstärke verbessert oder nicht. Die er-haltenen Ki-Werte sind in Tab. 36 aufgeführt. Für Verbindung 255 wurden keine Hemmstudie mehr durchgeführt, da sich die Verbindungen 252-254 am humanen Enzym bereits als inaktiv erwiesen.
Anhand der Ergebnisse lässt sich erkennen, dass die Einführung einer polaren Sei-tenkette die Ki-Werte für 229 bzw. 231 deutlich erhöht hat. Wurde für 229 ein Ki-Wert von 18.7 µM gemessen, so ist bereits der für das Derivat mit der Ethylamin-Seiten-kette 252 mit 380 µM um das 20-fache größer. Der Trend setzt sich für die längerket-tigen Verbindungen 253 und 254 fort, verläuft innerhalb der Reihe jedoch nicht ein-heitlich. So zeigt das Derivat 253 eine geringfügig bessere Hemmwirkungen gegen-über dem Enzym als die Verbindung 254. Eine eindeutige Erklärung für dieses Phä-nomen konnte anhand des Homologiemodells nicht gefunden werden. Es scheint sich allerdings die Struktur-Wirkungs-Beziehung zu bestätigen, dass die Anwesenheit von Seitenketten mit freien Aminofunktionen die Hemmwirkung insgesamt gesehen verschlechtert, woraus sich ergibt, dass die Adressierung des polar negativen Berei-ches innerhalb der Substratbindetasche für die Inhibitorstärke nicht essentiell ist. Aus diesem Grund sollte die Wechselwirkung mit dieser Region der Bindetasche bei der zukünftigen Strukturoptimierung der Substanzen vermieden werden.
Verbindung 256 zeigt innerhalb dieser Testserie den höchsten Ki-Wert mit 736 µM. Die geringe Hemmwirkung für diese Substanz beruht wahrscheinlich auf den glei-chen Gründen wie für 252-254. Eine eindeutige Erklärung ist aber auch in diesem Fall anhand des Homologiemodells nicht zu finden.
Tab. 36 Ermittelte Ki-Werte sowie der dazugehörige Hemmtyp für die Verbindungen 252-254 sowie 256.
Verbindung Produkt Ki [µM] Hemmtyp
N O HO
S
NH3Cl
252 380 + 27.6 nicht kompetitiv
253 361 + 27.7 nicht kompetitiv
254 366 + 31.3 nicht kompetitiv
N O HO
S
NH2 O
256 736 + 110 nicht kompetitiv