3. Ergebnisse und Diskussion
3.2. Derivate der ( E )-4-Aminozimtsäure
3.3.2. Derivate von Rucinol und 4-Hexylresorcinol
dafür waren aber die beiden phenolischen OH-Gruppen unsubstituiert und konnte direkt danach mit Benzylbromid funktionalisiert werden (Abb. 102).
HO
OH HN
O
NH O O
+ Br
K2CO3 DMF, 15 h, RT
O
OH HN
O
NH O O
150 32%151
Abb. 102 Syntheseschema zur Herstellung von Verbindung 151 durch Umsetzung von Molekül 150 mit Benzylbromid.
Der vorletzte Schritt, die Einführung des Metallankers, wurde mit Verbindung 151 nicht mehr versucht. Das Projekt wurde an dieser Stelle hinsichtlich aller 1,3,5-tri-substituierten Benzolderivate beendet, da die Aussichten, einen geeigneten Wirk-stoffkandidaten in dieser Substanzklasse zu finden, als gering eingestuft wurden.
Von den Verbindungen aus der Substanzklasse der 1,3,5-substituierten Aromaten wurde keine an der humanen Tyrosinase getestet.
gegen die humane Tyrosinase studieren zu können. Um Reaktionsbedingungen zu etablieren, unter denen Derivate von 17 oder 19 synthetisiert werden können, wur-den erste Versuche unternommen, um 4-Hexylresorcinol (19) selber herzustellen.
Die Syntheserouten zur Gewinnung weiterer Resorcinol-Derivate, bei denen bei-spielsweise die Positionen der beiden OH-Gruppen beliebig variiert werden kann oder die eine Doppelbindung in ihrer aliphatischen Seitenkette besitzen, wären der für Verbindung 19 vergleichbar.
Zusätzlich sollte eine Serie von Estern (Abb. 103) hergestellt werden, die in ihrer Struktur Rucinol (18) oder Verbindung 19 vergleichbar sind, aber synthetisch leichter zugänglich und strukturell einfacher zu variieren wirkten.
O O
R
OH
OH
O O
R
HO OH
O O
R
OH OH R = Butyl, Hexyl
Abb. 103 Allgemeine Strukturen der Ester, die in der Länge ihre aliphatischen Seiten-ketten an den Resorcinol-Derivaten 18 und 19 orientieren.
Es sollte untersucht werden, ob die in unterschiedlichen Positionen platzierte Carbo-nylfunktion der Estergruppe einen Einfluss auf die Wirksamkeit der potentiellen Inhi-bitoren hat. Inwieweit die unterschiedliche Anordnung der beiden Hydroxylgruppen zueinander einen Einfluss auf die Wechselwirkung mit dem Kupferzentrum des En-zyms hat, sollte ebenfalls herausgefunden werden. Ein exemplarisches Docking, dessen Ergebnis in Abb. 104 gezeigt wird, wurde für den 3,4-Dihydroxybenzoe-säurebutylester (152) durchgeführt und lässt eine inhibitorische Aktivität dieser Ver-bindung vermuten.
Über Ester mit unterschiedlich langen aliphatischen Resten gibt es ebenfalls viele Untersuchungen an der Pilztyrosinase, an welcher starke Hemmungen mit IC50 -Werten unter 1 µM[136] beschrieben werden. Durch Messung ihrer Hemmstärke an der menschlichen Tyrosinase sollte außerdem ermittelt werden, inwiefern das Pilzenzym als Modell für Inhibitorstudien herangezogen werden kann. Darüberhinaus sollte er-neut die Tauglichkeit des im Arbeitskreis Klebe entworfenen Homologiemodell für die Vorhersagen von Struktur-Wirkungs-Beziehungen validiert werden.
Abb. 104 Dreidimensionale Darstellung des Butylesters 152 im aktiven Zentrum der humanen Tyrosinase.
Um die aliphatischen Seitenketten in das Resorcinol (17) einzuführen, wurde in einer Metathese-Reaktion 1-Hexen mit einem Styrolderivat umgesetzt. Um die Styrolderi-vate zu synthetisieren, wurde auf die Wittig-Reaktion zurückgegriffen. Diese Reaktion ist die bedeutendste Methode in der organischen Synthese, um Alkene herzustellen und gleichzeitig die Geometrie der neu entstehenden Doppelbindung zu bestimmen.
Mechanistisch gesehen handelt es sich bei der Wittig-Reaktion um eine syn-Eliminierung, deren Antriebskraft die Bildung einer stabilen Sauerstoff-Phosphor-Bindung ist. Außerdem findet der Eliminationsschritt aus einem in situ erzeugten In-termediat heraus statt und startet nicht von isolierten Ausgangsmaterialien.
Die für die Synthese von Alkenen benötigten Edukte sind bei der Wittig-Reaktion ein Aldehyd bzw. Keton, welche baseninduziert mit einem Phosphor-Ylid zur Reaktion gebracht werden. Bei Yliden handelt es sich um eine Spezies, die sowohl eine positive wie auch eine negative Ladung trägt, und mit ihrer tautomeren Form, dem Phosphoran, im Gleichgewicht steht. Der Ablauf der Wittig-Reaktion ist schematisch vereinfacht in Abb. 105 dargestellt, wobei die Bildung des Ylides nicht gezeigt wird.
R2 R1
O P
CH2 Ph PhPh
I
O P Ph
Ph R1
R2 Ph
II
R1 R2 P
Ph Ph
Ph + O
III Abb. 105 Schematisch vereinfachte Darstellung der Wittig-Reaktion.
I.) Das nukleophile Carbanion im Phosphorylid greift den positiv polarisierten Carbo-nylkohlenstoff des Aldehyds/Ketons an unter gleichzeitiger Ausbildung eine Bindung zwischen dem Carbonylsauerstoff und dem Phosphoratom. II.) In einer [2+2]-Cyclo-addition bildet sich ein Vierring, das Oxaphosphetan, als Zwischenprodukt, welches aufgrund der hohen Affinität zwischen Phosphor und Sauerstoff in einer retro-[2+2]-Cycloaddition zerfällt. III.) Die Produkte der Reaktion sind Triphenylphosphinoxid und das Alken.
Das für die Methathese benötigte Zwischenprodukt wurde in zwei Schritten aus 2,4-Dihydroxybenzaldehyd (153) erhalten, dessen beiden OH-Gruppen vor der nach-folgenden Wittig-Reaktion mit Schutzgruppen versehen wurden (Abb. 106).
HO OH O O
R R
153 154-155
H O
H O
Abb. 106 Schützung der phenolischen OH-Gruppen in 153 durch Umsetzung mit Benzyl-bromid oder Methoxymethylchlorid (= MOMCl).
Tab. 10 Ausbeuten für die geschützten Derivate von 2,4-Diyhdroxybenzaldehyd (153).
O O
R R
H O
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Benzyl 154 99%
2 MOM 155 89%
Verbindung 155 wurde hergestellt, damit die später mit der Methathese-Reaktion eingeführte Doppelbindung bei der Freisetzung der Hydroxylgruppen erhalten bleibt.
MOM-Ether können unter sauren Bedingungen gespalten werden, so dass die Dop-pelbindung im Gegensatz bei der hydrogenolytischen Entfernung der Benzylschutz-gruppen nicht zur Einfachbindung reduziert wird. Mit dem Erhalt der Doppelbindung sollten die Konformationen der möglichen Endstufen eingeschränkt und der daraus resultierende Einfluss auf die Inhibitorstärke untersucht werden. In der Wittig-Reaktion wurden deshalb die beiden Aldehyde 154 und 155 mit Methyltriphenylphos-phoniumbromid zur Reaktion gebracht(Abb. 107).
O O
R R
1.
2. K2CO3 3. 18-Krone-6
Ph3P CH3Br
THF, 16 h, 60 °C
O O
R R
154-155 156-157
H O
Abb. 107 Wittig-Reaktion zur Gewinnung der beiden Styrol-Derivate 156 und 157.
Tab. 11 Erzielte Ausbeuten für die mittels Wittig-Reaktion gewonnen Verbindungen 156 und 157.
O O
R R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Benzyl 156 84%
2 MOM 157 50%
In der nachfolgenden Olefin-Methathese wurde nur das doppelt benzylgeschütze Derivat 156 umgesetzt (Abb. 108). Die Reaktion wurde nicht nur zur Synthese von Hexylresorcinol (19) verwendet, sondern auch zur Gewinnung von zwei Derivaten der 2,4-Dihydroxybenzoesäure, bei denen eine Carbonylfunktion in die Seitenkette eingeführt wurde.
BnO BnO OBn OBn
+
Grubbs-Katalysator der 2. Generation
DCM, 3 d, 40 °C R
R
156 158-160
Abb. 108 Methathese-Reaktion zur Einführung von Styrolderivaten in Verbindung 156.
Tab. 12 Ausbeuten für die Methathese-Rektion.
BnO
OBn R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Butyl 158 88%
2 Ethyloxycarbonyl 159 88%
3 But-2-on-4-yl 160 35%
Die ersten Olefin-Metathesen wurden in der Petrochemie zur Synthese von höheren Olefinen durchgeführt. Nickel-Katalysatoren mit Phosphor-Sauerstoff-Chelatliganden tolerierten zwar schon polare funktionelle Gruppen, aber ihr Haupteinsatzgebiet war die Olefinoligomerisation (z. B. Shell higher olefin process), wo sie hauptsächlich die Synthese von >C20-Olefinen unter hohem Druck und hohen Temperatur ermöglich-ten. Ausschlaggebend für die Fortschritte auf dem Gebiet der Metathesechemie ist die Entwicklung neuer Katalysesysteme. Für Anwendungen im Labor stehen mittler-weile Systeme zur Verfügung, welche beispielsweise Ringschlussreaktionen oder Ringöffnung ermöglichen und eine große Zahl funktioneller Gruppen tolerieren. Einen großen Verdienst um die Entwicklung neuer Katalysatoren hat die Gruppen um Grubbs und Schrock. Die von Grubbs entwickelten Katalysatoren gelten dabei als unempfindlicher, wohingegen der Schrock-Typ eher für sterisch anspruchsvolle Edukte Verwendung findet. Insgesamt gesehen läuft die Reaktion unter eher milden Bedingungen ab und ergänzt die Vielzahl von Methoden zur selektiven Einführung von Doppelbindungen in organische Moleküle. Bei dem in der vorliegenden Arbeit zur Synthese verwendeten Grubbs-Katalysator der 2. Generation (161) (Abb. 109) handelt es sich um eine kommerziell erhältliche Verbindung, die sich durch eine
we-sentlich höhere Aktivität auszeichnet und luftstabiler ist als die sogenannte erste Katalysatorgeneration.
161
Abb. 109 Struktur von Benzyliden[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)-2-imidazolidinyliden]di-chlor(tricyclohexylphosphin)ruthenium (161), der Grubbs-Katalysator der 2. Ge-neration.
Der Katalysezyklus, nach welchem die Reaktion abläuft ist schematisch in Abb. 110 dargestellt. Es handelt sich dabei um eine Kreuzmetathese, da unterschiedlich substituierte Olefine als Edukte eingesetzt werden.
Abb. 110 Schematische Darstellung des Katalysezyklus bei der Olefin-Kreuzmethathese nach Chauvin.[137]
Der gezeigte Zyklus ist vereinfacht dargestellt, da er die Ringöffnungen in der Gegen-richtung nicht berücksichtigt, welche wieder zu den Edukten führt. Neben allen möglichen Kombinationen werden aber auch E/Z-Isomere gebildet.
Im letzten Schritt der Synthesesequenz wurde nun in einer „Eintopf“-Reaktion sowohl die beiden benzylischen Schutzgruppen als auch die Doppelbindung in 158-160 durch Hydrierung entfernt (Abb.111).
HO OH
BnO
OBn Pd/C , H2 MeOH, 16 h, RT R
R 19, 162-163
Abb. 111 Abspaltung der Benzylschutzgruppen und Reduktion der Doppelbindung in 158-160 unter hydrogenolytischen Bedingungen.
Tab. 13 Erzielte Ausbeute der reduzierten Verbindungen 162-163.
HO OH
R
Eintrag R Produkt Ausbeute
1 Butyl 19 27%
2 Ethyloxycarbonyl 162 53%
3 But-2-on-4-yl 163 21%
Die mit Hilfe des MBTH-Assays bestimmten Ki-Werte für das selber synthetisierte Hexylresorcinol (19) ergaben bei einem kompetitiven Hemmtyp einen Wert von 42.1 + 0.3 µM, während für das kommerziell erworbenen ein Ki-Wert von 26.1 + 0.8 µM bestimmt wurde. Die für die humane Tyrosinase ermittelten Ki-Werte
liegen für beide Testungen von Hexylresorcinol (19) über denen, die für das Pilzen-zym beschrieben wurden. Daraus lässt sich schließen, dass die Tyrosinase aus A.
bisporus ein nur bedingt geeignetes Modellsystem für seinen menschlichen Vertreter darstellt. Außerdem hat sich anhand der Ki-Werte gezeigt, dass Verbindung 19 als potentieller Wirkstoffkandidat ungeeignet ist.
Parallel zu Verbindung 19 wurden, wie in Abb. 103 aufgeführt, Butyl- und Hexylester synthetisiert, die entweder von unterschiedlichen Strukturisomeren der Dihydroxy-benzoesäure oder von (3,4-Dihydroxyphenyl)essigsäure (164) ausgingen. Es wurden für diese Derivate außer 1-Butanol und 1-Hexanol keine anderen Alkohole als Reak-tionspartner gewählt, da die Ester strukturell dem Rucinol (18) bzw. Hexylresorcinol (19) ähneln sollten, um so die erhaltenen Testergebnisse vergleichen zu können.
Außerdem sollte einfach erkennbar sein, inwiefern die Lage der Carbonylgruppe in der Esterfunktion und/oder die Veränderungen der Positionen der beiden unsubsti-tuierten Hydroxylfunktionen die Stärke des Inhibitors beeinflusst. Eine Ausnahme in dieser Reihe bildet der Methylester 165 der 2,5-Dihydroxybenzoesäure (166), der zwar strukturell eher dem Hydrochinon (16) gleicht, aber in der Literatur als guter Inhibitor der Pilztyrosinase beschrieben ist. Die Verbindung diente auch hier zur Erstellung von vergleichenden Studien zwischen dem humanem Enzym und der Pilz-tyrosinase. Zur Knüpfung der Esterbindung wurde die jeweilige Carbonsäure mit dem gewünschten Alkohol unter Säurekatalyse umgesetzt (Abb. 112).
R2
R4
OH O R1
R3
H2SO4,
Butanol oder Hexanol 9 h, Rückfluß
R2
R4 O O R1
R3
R5
165-171
Abb. 112 Säurekatalysierte Veresterung von Dihydroxybezoesäuren.
Tab. 14 Isolierte Ausbeuten für die säurekatalysierte Veresterung der Carbonsäuren.
R2
R4
O O R1
R3
R5
Eintrag R1 R2 R3 R4 R5 Produkt Ausbeute
1 OH H H OH Methyl 165 70%
2 H OH H OH Butyl 167 94%
3 H OH H OH Hexyl 168 55%
4 OH H OH H Butyl 169 38%
5 OH H OH H Hexyl 170 65%
6 H OH OH H Butyl 152 38%
7 H OH OH H Hexyl 171 63%
Um wie bei den Verbindungen 152 und 171 den Abstand zwischen Aromat und Esterfunktion zu vergrößern, wurden die folgenden beiden Ester 172 und 173 synthe-tisiert (Abb.113).
HO
HO O
OH H2SO4 9 h, Rückfluß
HO
HO O
O R
R = Propyl =172 R = Butyl = 173 164
Abb. 113 Säurekatalysierte Veresterung von (3,4-Dihydroxyphenyl)essigsäure (164).
Der (3,4-Dihydroxyphenyl)essigsäurepropylester (172) wurde in einer Ausbeute von 66% isoliert, während für den entsprechenden Butylester (173) nur 51% erhalten wurden. Obwohl für die Ester mit aliphatischen Seitenketten in der Literatur eine star-ke Hemmung der Pilztyrosinase zu finden ist (IC50-Werte < 1 µM), wurde keine nen-nenswerte Hemmung beim humanen Enzym für die Ester 152,162-163, 165, 167-170 und 171 gemessen. Exakte Ki-Werte für die einzelnen Verbindungen wurden nicht bestimmt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Ki-Werte von allen syn-thetisierten Estern größer sind als 1000 µM.
Eine Übersicht über die prozentuale Hemmung bei Konzentrationen von 1000 µM zeigt Tab. 15.
Tab. 15 Prozentuale Hemmung der humanen Tyrosinase durch die verschiedenen Ester 152, 162-163, 165, 167-170 und 171-173.
Eintrag Produkt Verbindung R % Hemmung bei 1000 µM
1 169
OR OH O
HO
Butyl
-a
2 170 Hexyl
-a
3 152
OR O
HO HO
Butyl
7.01
4 171 Hexyl
19.36
5 167
OR O HO
OH
Butyl
3.57
6 168 Hexyl
2.55
7 172
HO HO
OR O
Propyl 2.03
8 173 Butyl 1.60
9 163
OH HO
O
- -a
10 162
HO OH
OR O
Ethyl 3.50
11 165
OH
HO OR
O
Methyl 26.11
aBei Konzentrationen von 1000 µM ist die Substanz in DMSO nicht mehr ausreichend löslich und fällt aus dem MBTH-Assay aus.
Da innerhalb der Verbindungsreihe der Ester kein Trend bezüglich der prozentualen Hemmung bzw. inhibitorischen Stärke zu erkennen ist, lassen sich anhand der
Test-ergebnisse keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Da das in Abb. 104 ge-zeigte Ergebnis der Dockingstudien vorhersagt, dass der Ester 152 sich gut in die Subtratbindetasche einpassen würde und demzufolge eine inhibitorische Wirkung zu erwarten wäre, zeigen diese neuen Ergebnisse, dass auch mit dem neuen „verfeiner-te“ Homologiemodell der humanen Tyrosinase nur sehr bedingt Aussagen über die Struktur der Inhibitoren und ihre Wechselwirkungen im aktiven Zentrum gemacht werden können.